人工真皮——胶原+6-硫酸软骨素膜的制作及部分性能测定
作者：李孝建 史济湘
单位：(李孝建)广州市红十字会医院，广州 510220；(史济湘)上海第二医科大学 附属瑞金医院，上海 200025
关键词：胶原；6-硫酸软骨素；戊二醛
生物医学工程学杂志990207 摘要 用酸溶解法从鼠尾腱中提取I型胶原，与6-硫酸软骨素按一定比例混合后，经过冷冻干燥、戊二醛交联等步骤制成人工真皮—胶原+6-硫酸软骨素膜。制成的人工真皮为半透明薄膜。扫描电镜观察其内部为有孔的网状结构，孔径大小在100～150 μm。性能测定发现该人工真皮与创面具有良好的粘附性，经戊二醛交联后，体外降解速率得到明显控制。
Formation and Characteristics of an Artificial Dermis——
Collagen-Chondroitin-6-Sulfate Membrane
, http://www.100md.com
Li Xiaojian Shi Jixiang
Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220
Ruijing Hospital Attached to shanghai second Medical University,Shanghai 200025
Abstract In this study, we extracted type-I collagen from rat tail tendon with acetic acid and then mixed it with chondroitin-6-sulfate to form a collagen-chondroitin-6-sulfate membrane by freeze drying and crosslinking. The result showed that the collagen-chondroitin-6-sulfate membrane was semitransparent, with a network structure, and the pore size was about 100-150μm. It was also demonstrated that the “dermis” achieved a good adherence to wound and the degradation rate in vitro was markedly decreased by glutaraldehyde crosslinkage.
, 百拇医药
Key words Collagen Chondroitin-6-sulfate Glutaraldehyde
近十几年来，复合移植方法覆盖Ⅲ度烧伤切痂创面越来越受到人们的重视，其中理想的真皮成份甚为重要。我们参照Yannas[1]的方法以改进制成的人工真皮具有组织相容性好、创面粘附力强、不易被降解吸收等优点，而且内部为有适宜孔径大小的网状结构，能诱导创面新生真皮的再生。现将制作方法及部分生物物理性能介绍如下。
1 材料和方法
1.1 胶原+6-硫酸软骨素膜的制作
取大鼠尾数根，去皮后抽取尾腱50 g，剪碎置入锥形烧瓶内，加入0.05 M乙酸200 ml，4℃冰箱放置4 d。4 ℃，16，000 rpm离心1 h，弃沉淀。在上清液中加入NaCl，使NaCl最终浓度为5%，见有白色絮状沉淀析出后，4 ℃，8，000 rpm离心30 min，弃上清。沉淀物用0.05 M乙酸溶解后，重复上述盐析步骤二次，沉淀物再用0.05 M乙酸溶解，置于0.02 M Na2HPO3中透析3天，即为精制胶原。
, http://www.100md.com
精制胶原与6-硫酸软骨素(Sigma)按10∶1比例均匀混合，取混合液15 ml，置于直径9 cm玻璃平皿内，-60 ℃冰冻后，于-55℃，3.9×10-5 KPa下冷冻抽干。抽干后样品置于0.25%戊二醛(pH：3.2)溶液中交联24 h，再于蒸馏水中浸泡24～48 h，自然晾干即成。
1.2 部分性能测定
1.2.1 形态及结构观察 观察其外观性状，并在扫描电镜下观察其内部结构。
1.2.2 粘附性能测定 按朱德安等[2]介绍的方法，用岛津GA型材料试验机作垂直剥离强度测定，得出创面粘附力。
1.2.3 体外酶降解试验 将1 mg胶原+6-硫酸软骨素膜样品置入盛有1.9 ml Stock缓冲液的试管中，并加入新配制的0.1 ml，100 Units胶原酶溶液。试管置于37 ℃恒温振荡器中，控制转速为10 rpm，分别于24、48、72、96 h后测定上清液中羟脯氨酸浓度[3]。
, 百拇医药
2 结 果
(1)制成的胶原+6-硫酸软骨素膜为半透明薄膜，厚度为0.1 mm，具有一定抗张强度。扫描电镜观测的内部结构见图1：
图1 人工真皮的扫描电镜结构
Fig 1 Scanning Electron Microscope structure of the artificial dermis
(2)胶原+6-硫酸软骨素膜与创面的粘附力见表1：
表1 人工真皮与自、异体皮粘附力的比较
Table 1 Adhesion of artificial dermis compared with that of autologous skin and allogenic skin Group
, 百拇医药
Adhesion of
5 hous(g)
Adhesion of
72 hours(g)
Autologous skin
20.18
±3.91
92.74
±8.23
Allogeneic skin
19.59
±5.43
, http://www.100md.com
88.53
±15.26
Artificial dermis
22.93
±4.61*
95.79
±17.96*
* Compared with autologous skin and allogeneic skin
P>0.05
(3)未交联及不同交联时间的胶原+6-硫酸软骨素膜的体外降解试验结果见表2：表2 未交联与交联不同时间的人工真皮体外降解结果的比较
, http://www.100md.com
Table 2 In vitro degradation results of non-crosslink artificial dermis compared with that of crosslink artificial dermis in different time Group
Concentration of hydroxyproline(ug/ml)
24 h
48 h
72 h
96 h
Non-crosslink
24.36
, http://www.100md.com
±2.35△
17.46
±1.78△
18.78
±2.65△
19.54
±1.95△
Crosslink 2 h
5.23
±1.24*
7.85
, http://www.100md.com
±2.61*
9.03
±1.87*
11.2
±12.34*
Crosslink 24 h
2.45
±1.78*△
4.96
±2.56*△
7.85
, http://www.100md.com
±3.01*△
8.34
±2.45*△
* Compared with Non-crosslink P<0.001；△Compared with Crosslink 24 h P<0.05
3 讨 论
(1)从组织中提取的胶原可以由多种方法制成膜，报导的有盐析成膜、氨熏成膜及冷冻干燥成膜等。不同的成膜方法对内部结构的影响较大，而内部结构的差异直接影响其性能。理想的人工真皮，其内部结构应是具有一定大小孔径的网状结构，以利于组织的成纤维细胞和毛细血管的侵入。Doillon等[4]曾研究在不同的pH条件下加入糖胺多糖以及在不同的冷冻温度下制成的胶原+6-硫酸软骨素膜，其内部孔径大小经光镜和扫描电镜观察有明显差异。因此，选用合适的成膜方法及条件非常重要。本研究用鼠尾I型胶原，在pH3.2的条件下加入6-硫酸软骨素，-55 ℃冷冻抽干制成的胶原+6-硫酸软骨素膜经扫描电镜观察，为有孔的网状结构，孔径大小在100～150 μm之间，比较符合人工真皮的内部结构要求。此外，单纯胶原蛋白制成的膜常缺乏弹性，且易碎[5]，加入糖胺多糖成份(如6-硫酸软骨素、透明质酸等)后，可以增加其韧性和弹性。
, 百拇医药
(2)控制人工真皮在体内的被吸收率及降解速率也是非常关键的。即人工真皮必须在移植后保持其网状结构一段时间，以支持组织细胞和血管的侵入。60年代曾有人用胶原替代骨移植，但因植入物很快被降解而达不到预期效果。我们制成的胶原+6-硫酸软骨素膜经戊二醛交联后，在体外胶原酶降解条件下，通过检测胶原降解的特有产物羟脯氨酸浓度，发现其降解速率得到明显控制。至于这种人工真皮在体内降解速率如何，尚待进一步研究。
(3)作为直接贴附创面的人工真皮，除具有适当的孔径及生物降解性能外，还应与创面有良好的粘附性，防止与创面之间产生间隙，积聚体液而诱发感染。我们制作的人工真皮与创面的粘附力，经过检测与自体皮、异体皮均无显著差异。
参考文献
1 Yannas IV, Burke JF, Gordon PL et al. Design of an artificial skin. Ⅱ:Control of composition. J Biomed Mater Res, 1980;14∶107
, 百拇医药
2 朱德安，曹启栋.洗必泰酒精冷藏猪皮——一种简单长期的保存猪皮.中华整形烧伤外科杂志，1986；2∶203
3 李玉瑞，主编.细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社，1988∶224
4 Doillon CJ, Whyne CF, Brandwein S et al. Collagen-based wound dressings :control of the pore structure and morphology. J Biomed Mater Res, 1986;20∶1219
5 Basil A, Pruitt BA, Levine NS. Characteristics and uses of biological dressings and skin substitutes.Arch Surg,1984;119∶312
收稿：1997-12-12 修回：1998-05-05, 百拇医药
单位：(李孝建)广州市红十字会医院，广州 510220；(史济湘)上海第二医科大学 附属瑞金医院，上海 200025
关键词：胶原；6-硫酸软骨素；戊二醛
生物医学工程学杂志990207 摘要 用酸溶解法从鼠尾腱中提取I型胶原，与6-硫酸软骨素按一定比例混合后，经过冷冻干燥、戊二醛交联等步骤制成人工真皮—胶原+6-硫酸软骨素膜。制成的人工真皮为半透明薄膜。扫描电镜观察其内部为有孔的网状结构，孔径大小在100～150 μm。性能测定发现该人工真皮与创面具有良好的粘附性，经戊二醛交联后，体外降解速率得到明显控制。
Formation and Characteristics of an Artificial Dermis——
Collagen-Chondroitin-6-Sulfate Membrane
, http://www.100md.com
Li Xiaojian Shi Jixiang
Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220
Ruijing Hospital Attached to shanghai second Medical University,Shanghai 200025
Abstract In this study, we extracted type-I collagen from rat tail tendon with acetic acid and then mixed it with chondroitin-6-sulfate to form a collagen-chondroitin-6-sulfate membrane by freeze drying and crosslinking. The result showed that the collagen-chondroitin-6-sulfate membrane was semitransparent, with a network structure, and the pore size was about 100-150μm. It was also demonstrated that the “dermis” achieved a good adherence to wound and the degradation rate in vitro was markedly decreased by glutaraldehyde crosslinkage.
, 百拇医药
Key words Collagen Chondroitin-6-sulfate Glutaraldehyde
近十几年来，复合移植方法覆盖Ⅲ度烧伤切痂创面越来越受到人们的重视，其中理想的真皮成份甚为重要。我们参照Yannas[1]的方法以改进制成的人工真皮具有组织相容性好、创面粘附力强、不易被降解吸收等优点，而且内部为有适宜孔径大小的网状结构，能诱导创面新生真皮的再生。现将制作方法及部分生物物理性能介绍如下。
1 材料和方法
1.1 胶原+6-硫酸软骨素膜的制作
取大鼠尾数根，去皮后抽取尾腱50 g，剪碎置入锥形烧瓶内，加入0.05 M乙酸200 ml，4℃冰箱放置4 d。4 ℃，16，000 rpm离心1 h，弃沉淀。在上清液中加入NaCl，使NaCl最终浓度为5%，见有白色絮状沉淀析出后，4 ℃，8，000 rpm离心30 min，弃上清。沉淀物用0.05 M乙酸溶解后，重复上述盐析步骤二次，沉淀物再用0.05 M乙酸溶解，置于0.02 M Na2HPO3中透析3天，即为精制胶原。
, http://www.100md.com
精制胶原与6-硫酸软骨素(Sigma)按10∶1比例均匀混合，取混合液15 ml，置于直径9 cm玻璃平皿内，-60 ℃冰冻后，于-55℃，3.9×10-5 KPa下冷冻抽干。抽干后样品置于0.25%戊二醛(pH：3.2)溶液中交联24 h，再于蒸馏水中浸泡24～48 h，自然晾干即成。
1.2 部分性能测定
1.2.1 形态及结构观察 观察其外观性状，并在扫描电镜下观察其内部结构。
1.2.2 粘附性能测定 按朱德安等[2]介绍的方法，用岛津GA型材料试验机作垂直剥离强度测定，得出创面粘附力。
1.2.3 体外酶降解试验 将1 mg胶原+6-硫酸软骨素膜样品置入盛有1.9 ml Stock缓冲液的试管中，并加入新配制的0.1 ml，100 Units胶原酶溶液。试管置于37 ℃恒温振荡器中，控制转速为10 rpm，分别于24、48、72、96 h后测定上清液中羟脯氨酸浓度[3]。
, 百拇医药
2 结 果
(1)制成的胶原+6-硫酸软骨素膜为半透明薄膜，厚度为0.1 mm，具有一定抗张强度。扫描电镜观测的内部结构见图1：
图1 人工真皮的扫描电镜结构
Fig 1 Scanning Electron Microscope structure of the artificial dermis
(2)胶原+6-硫酸软骨素膜与创面的粘附力见表1：
表1 人工真皮与自、异体皮粘附力的比较
Table 1 Adhesion of artificial dermis compared with that of autologous skin and allogenic skin Group
, 百拇医药
Adhesion of
5 hous(g)
Adhesion of
72 hours(g)
Autologous skin
20.18
±3.91
92.74
±8.23
Allogeneic skin
19.59
±5.43
, http://www.100md.com
88.53
±15.26
Artificial dermis
22.93
±4.61*
95.79
±17.96*
* Compared with autologous skin and allogeneic skin
P>0.05
(3)未交联及不同交联时间的胶原+6-硫酸软骨素膜的体外降解试验结果见表2：表2 未交联与交联不同时间的人工真皮体外降解结果的比较
, http://www.100md.com
Table 2 In vitro degradation results of non-crosslink artificial dermis compared with that of crosslink artificial dermis in different time Group
Concentration of hydroxyproline(ug/ml)
24 h
48 h
72 h
96 h
Non-crosslink
24.36
, http://www.100md.com
±2.35△
17.46
±1.78△
18.78
±2.65△
19.54
±1.95△
Crosslink 2 h
5.23
±1.24*
7.85
, http://www.100md.com
±2.61*
9.03
±1.87*
11.2
±12.34*
Crosslink 24 h
2.45
±1.78*△
4.96
±2.56*△
7.85
, http://www.100md.com
±3.01*△
8.34
±2.45*△
* Compared with Non-crosslink P<0.001；△Compared with Crosslink 24 h P<0.05
3 讨 论
(1)从组织中提取的胶原可以由多种方法制成膜，报导的有盐析成膜、氨熏成膜及冷冻干燥成膜等。不同的成膜方法对内部结构的影响较大，而内部结构的差异直接影响其性能。理想的人工真皮，其内部结构应是具有一定大小孔径的网状结构，以利于组织的成纤维细胞和毛细血管的侵入。Doillon等[4]曾研究在不同的pH条件下加入糖胺多糖以及在不同的冷冻温度下制成的胶原+6-硫酸软骨素膜，其内部孔径大小经光镜和扫描电镜观察有明显差异。因此，选用合适的成膜方法及条件非常重要。本研究用鼠尾I型胶原，在pH3.2的条件下加入6-硫酸软骨素，-55 ℃冷冻抽干制成的胶原+6-硫酸软骨素膜经扫描电镜观察，为有孔的网状结构，孔径大小在100～150 μm之间，比较符合人工真皮的内部结构要求。此外，单纯胶原蛋白制成的膜常缺乏弹性，且易碎[5]，加入糖胺多糖成份(如6-硫酸软骨素、透明质酸等)后，可以增加其韧性和弹性。
, 百拇医药
(2)控制人工真皮在体内的被吸收率及降解速率也是非常关键的。即人工真皮必须在移植后保持其网状结构一段时间，以支持组织细胞和血管的侵入。60年代曾有人用胶原替代骨移植，但因植入物很快被降解而达不到预期效果。我们制成的胶原+6-硫酸软骨素膜经戊二醛交联后，在体外胶原酶降解条件下，通过检测胶原降解的特有产物羟脯氨酸浓度，发现其降解速率得到明显控制。至于这种人工真皮在体内降解速率如何，尚待进一步研究。
(3)作为直接贴附创面的人工真皮，除具有适当的孔径及生物降解性能外，还应与创面有良好的粘附性，防止与创面之间产生间隙，积聚体液而诱发感染。我们制作的人工真皮与创面的粘附力，经过检测与自体皮、异体皮均无显著差异。
参考文献
1 Yannas IV, Burke JF, Gordon PL et al. Design of an artificial skin. Ⅱ:Control of composition. J Biomed Mater Res, 1980;14∶107
, 百拇医药
2 朱德安，曹启栋.洗必泰酒精冷藏猪皮——一种简单长期的保存猪皮.中华整形烧伤外科杂志，1986；2∶203
3 李玉瑞，主编.细胞外间质的生物化学及研究方法.北京：人民卫生出版社，1988∶224
4 Doillon CJ, Whyne CF, Brandwein S et al. Collagen-based wound dressings :control of the pore structure and morphology. J Biomed Mater Res, 1986;20∶1219
5 Basil A, Pruitt BA, Levine NS. Characteristics and uses of biological dressings and skin substitutes.Arch Surg,1984;119∶312
收稿：1997-12-12 修回：1998-05-05, 百拇医药