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编号:10273732
几种胶原型创伤敷料制作的实验研究
http://www.100md.com 《生物医学工程学杂志》 1999年第2期
     作者:吴志谷 盛志勇 孙同柱 耿 淼 周宝桐 黎君友 黄祖王秀

    单位:(吴志谷 盛志勇 孙同柱 耿淼 周宝桐 黎群友)解放军304医院 创伤研究室,北京 100037;(黄祖来得及)北京大学 化学系,北京 100871

    关键词:胶原海绵;创伤敷料

    生物医学工程学杂志990206 摘要 介绍了几种胶原型创伤敷料研制的方法。冷冻牛腱经0.05 M乙酸处理(pH3.2)48~72 h后,捣碎、过滤、脱泡、加硫酸软骨素(8%),制成1.5%~2.5%胶原溶液。该溶液在预冷或不预冷的模具内冷冻干燥,冻干的胶原海绵在0.25%戊二醛溶液中交联24 h。并以类似的方法研制成聚氨酯膜-胶原海绵复合膜,涂聚氨酯胶原膜,和纱布胶原膜三种创伤敷料。结果表明冷冻牛腱胶原性能稳定,冻干的胶原海绵具有良好的孔洞结构(50~400 μm),但气面孔洞比模具面的孔洞大数倍。本文简要讨论了影响胶原海绵孔洞结构和大小的有关因素,以及他们作为创伤敷料的可行性。
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    Preparation of Collagen-based Materials for Wound Dressing

    Wu Zhigu Sheng Zhiyong Sun Tongzhu Geng Miao Zhou Baotong

    Li Junyou Huang Zuxiu

    Burns Institute,304th Hospital PLA,Beijing 100037

    Department of Chemistry, Beijing University,Beijing 100871

    Abstract This article addressed the methods to develop collagen-based materials for wound dressing. Fresh frozen bovine tendon was treated with 0.05M acetic acid at pH3.2 for 48-72 h,then it was homogenized, filtered, and after the process of adding chondroitin sulphate(8%),it was debubblized; thus 1.5%-2.5% collagen solution was finally prepared. The solution was lyophilized in prefrozen or un-prefrozen mold. The collagen sponge was crosslinked with 0.25% glutaraldehyde for 24 h. Three other wound dressings were developed by similar method, namely collagen membrane with polyurethane membrane onlay, polyurethane-coated collagen membrane and collagen membrane on gauze. It was demonstrated that the property of frozen bovine tendon was stable, and the prepared collagen sponge contained pores of 50-400 μm in diameter. Some factors influencing pore structure and size in the collagen sponge were discussed. The results of this preliminary study suggested that the collagen could be used as wound dressing.
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    Key words Collagen spong Wound dressing

    胶原在创伤修复中的良好作用越来越受到人们的重视,近20年以胶原或胶原为内层的创伤修复材料研究十分广泛也比较深入[1~6]。本文就牛腱胶原海绵以及牛腱胶原膜为内层,聚氨酯膜等材料为外层的几种创伤修复材料研制的方法介绍如下。

    1 材料和方法

    1.1 胶原溶液的制备

    1.1.1 酸处理 新鲜成年牛腱,水洗,去除肌肉、肌膜及筋膜,凉干后贮存在-60 ℃左右的低温冰箱内备用。酸处理前,从冰箱内取出牛腱立即切成0.5 mm左右的薄片(越薄越好)并称重。腱片放入0.05 M乙酸中(pH3.2),使最终浓度为1.5%~2.5%(W/V)胶原-乙酸溶液,置4 ℃冰箱48~72 h,在此期间每天振摇2~3次,数小时后腱片便开始膨胀,直至膨胀成“棉絮状”为止。将膨胀后的胶原倒入组织捣碎机中(1500 r/min)开30 s停30 s,重复3~4次,即成为均匀的胶原溶液。
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    1.1.2 过滤脱泡 在捣碎后,用80~100#尼龙网过滤除去胶原溶液中的残渣。在捣碎和过滤胶原溶液时空气混入形成气泡,用真空减压脱泡。

    1.1.3 加硫酸软骨素 将硫酸软骨素(GAG,成都制药三厂)溶于0.05 M乙酸内,为胶原总量的8%,滴液速度为15~30 滴/min,并不断的搅拌(1000 r/min)。

    1.2 胶原海绵的制作

    1.2.1 模具 (1)玻璃板长25 cm,宽20 cm,厚0.3~0.5 cm,两侧或四周加4~8层医用胶布或1 cm高的玻璃边框,涂少许硅油。(2)不锈钢盘30 cm×23 cm×1 cm。

    1.2.2 预冻样品 (1)方法一,胶原液倒入模具内,擀平,放入-30 ℃左右的冰箱内预冻4 h以上。(2)方法二,将胶原液倒入特制的有机玻璃刮槽内,刮槽放在预冷玻璃模板(-30~-70 ℃)两侧的边框上,打开刮槽底部的滑板,将漏出的胶原液快速刮在玻璃膜板上,胶原液便平整地冻结在模板上。随后转入-30 ℃的低温冰箱,冷冻4 h以上或过夜。
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    1.2.3 真空干燥 将预冻后的胶原玻璃板快速转入冷冻干燥机内(FD-1、FD-2),真空冷冻干燥12~24 h,待样品温度回升到室温,再逐步加热至105 ℃,恒温24 h即成为胶原海绵。

    1.2.4 戊二醛交联 经高温处理初步交联的胶原海绵再放入0.25%戊二醛溶液内,置4 ℃冰箱24 h后,用滤过自来水漂洗2 h,然后换成双蒸水置4 ℃冰箱24 h,去除未结合残存的戊二醛。交联后的胶原海绵,可贮存于70%乙醇或异丙醇内,或再进行真空干燥备用。

    1.3 聚氨酯-胶原海绵复合膜

    外层为聚酯膜,15~50 μm厚,含有5~15 μm的微孔,内层为0.2~0.5 mm厚胶原海绵,孔径为50~300 μm,两膜复合粘接而成。

    1.4 涂聚氨酯胶原海绵膜

, http://www.100md.com     在胶原海绵一面涂聚氨酯,然后经室温或烘箱干燥而成。

    1.5 胶原纱布敷料

    方法一,先将医用纱布在0.05 M乙酸溶液中浸湿,平铺在模板上,倒上适量的胶原溶液(约15 ml/600cm2),擀平,置-30 ℃冰箱预冻4h以上,然后按上法冷冻干燥和交联。方法二,先将胶原倒入玻璃膜板上,刮平,覆盖一层经0.05 M乙酸浸湿医用纱布,按上法预冻,冻干和交联。

    1.6 理化测试

    分析提取牛腱胶原的氨基酸谱(日本,HITACHI835-50 Amino acid analyzer)和紫外吸收光谱(美国,Du-7 Beckman),以及光、电镜观察胶原海绵和各种创伤修复材料的结构。

    2 结 果
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    2.1 吸收光谱及氨基酸分析

    胶原在紫外分光光度计上最高吸收峰值为223 nm左右,表明乙酸水解的牛腱胶原的主要成份为氨基酸和DNA。从表1氨基酸谱中可以看到18种氨基酸的含量情况。甘氨酸最高,约占氨基酸总量的25.4%,其次是脯氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸和天门冬氨酸。

    2.2 冻干胶原海绵

    上述方法冻干的胶原都能获得良好的海绵

    表1 牛腱胶原蛋白氨基酸谱

    Table 1 Amino acid spectrum of collagen protein for bovine tendon Amino

    acid

, 百拇医药     Content

    (μg/mg)*

    Amino

    acid

    Content

    (μg/mg)

    1 Aspartic acid

    46.19

    10 Isoleucine

    12.77

    2 Threonine

    15.77
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    11 Leucine

    26.38

    3 Serine

    15.50

    12 Tyrosine

    10.29

    4 Glutamic acid

    77.63

    13 Phenylalanine

    18.35

    5 Glycine

    169.08
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    14 Lysine

    21.91

    6 Alanine

    6.34

    15 Histidine

    5.53

    7 Cystine

    3.05

    16 Arginine

    60.99

    8 Valine

    21.70
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    17 Hydroxyproline

    50.48

    9 Methionine

    8.29

    18 Proline

    94.49

    * Total contents:664.7 μg/ml

    结构,其孔径为50~300 μm。不预冷模板冻干的胶原海绵,一般孔洞较大,呈长形多边孔洞和较多的沟槽。预冷模板冻干的胶原海绵孔洞均匀,相对小,长形孔少,冷冻表面也较平整。预冷或不预冷模板制备的胶原海绵,其模具面(胶原靠模板的面)的孔洞均比气面孔洞要小。冷冻干燥后的胶原海绵柔软,但弹性较差,压之下陷不能弹起,吸水好,但易破碎。经105 ℃高温初步交联后,弹性强度增加,质地稍变硬。吸水(湿)后胶原海绵膨胀,在一定时间内结构不会明显改变。高温处理后的胶原体积比处理前略缩小。经戊二醛交联的胶原海绵结构不变,体积缩小(约20%左右),孔径变小,但胶原海绵强度及弹性明显增加,压之下陷但能弹起。吸水(湿)后亦膨胀,吸水性强,挤出水后再放入水中可立即恢复原状。戊二醛交联后胶原海绵在双蒸水内浸泡半年以上其结构无明显改变。
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    2.3 聚氨酯胶原海绵复合膜

    聚氨酯薄膜有均匀开口的微孔(5~15 μm),柔软、抗张强度大、弹性好、随形性好。内层为戊二醛交联的胶原海绵。两膜复合后仍保持其各自的特性,但复合后的胶原海绵略变薄。涂聚氨酯胶原海绵的聚氨酯膜较薄,强度虽没有前者大,但明显增加了胶原海绵的强度。聚氨酯胶原海绵复合膜及涂聚氨酯胶原膜结构特点见图1a,b。

    (a) 聚氨酯膜(×1000) (b) 加GAG胶原海绵(×50.5)

    (a) polyurethane membrane(×1000) b) colagen sponge with GAG(×50.5)
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    图1 聚氨酯膜及胶原海绵的结构特点(电镜照片)

    Fig 1 Structure characteristic of the polyurethane membrane and collagen sponge

    2.4 胶原(海绵)纱布敷料

    方法一制作的胶原纱布敷料,肉眼能见到涂胶原面的纱布上有一薄层胶原膜,该膜覆盖了整个纱布网眼,光镜下见纱布网眼上有一层大小不等的胶原纤维网形成的孔洞及半透膜。方法二制作的胶原纱布敷料,其纱布一面有一层多孔海绵薄膜。

    3 讨 论

    3.1 提取牛腱胶原的有关问题

    牛腱胶原是最常使用的医用胶原之,牛腱含胶原量极高,很容易被稀有机酸体系提取。低温冻存3~6年的牛腱在(-60±10) ℃下,经0.05 M乙酸提取的胶原含有大量的氨基酸,尤其甘氨酸含量极其丰富,显示为I型胶原的特性。以I型胶原为主的牛腱很容易被乙酸膨胀和溶解提取,由于提取牛腱胶原没有使用酶制剂,不仅节省了经费,而且大大减少了提取的步骤。大量文献及我们的实验资料证明单纯乙酸提取牛腱胶原是一种简便、理想的方法。该方法提取牛腱胶原十分简单,不需反复层析和离心,但得到的胶原含量及纯度都是比较高的,作为创伤修复材料的内层是可行的。但提取牛腱胶原应注意以下几点:(1)应选择新鲜优质牛腱如跟腱,应充分去除腱外肌(筋)膜或其他非胶原组织;(2)新鲜牛腱可在(-60±10) ℃低温下长期保存,质量无明显改变;(3)酸处理前,应将冷冻牛腱切成0.5 mm以下的薄片。如太厚或切成粗颗粒,乙酸处理时间延长,胶原提取量亦减少;(4)腱应充分膨胀后再捣碎处理;(5)胶原溶液中的气泡可在真空下脱除。
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    3.2 制作胶原海绵及创伤修复材料的有关问题

    作人工真皮的胶原海绵已有不少学者进行了研究[2~4]。Dagulakis等证明直接冷冻干燥和经预冷膜板冻干的胶原能获得平均直径(Φ)为(100±80) μm和(50±46) μm的孔洞,以及较小的收缩(3%或6%)[2],但两法都需要极低温度的冻干系统,如液态氮(LN2)预冻成膜,条件难以控制。Doillon等证明不同冷冻温度和pH对胶原孔洞形成都有影响,他们认为胶原海绵孔洞形成的最佳条件:(1)避免过度的搅拌;(2)pH3.0;(3)在乙醇浴内冷冻;(4)乙醇浴直接与模板接触,避免有空气间隙[4]。动物实验证明肉芽组织能长入海绵的最佳孔径为50~300 μm。本文介绍的方法能获得这种结果。-30 ℃的预冷温度能有效地保证胶原液中的游离和结合水迅速结冰,形成均匀分散的晶格(尤其是靠模板面)。平衡温度不能在-35 ℃以下的低温中进行,如低于此温度,胶原板放置太长,预冷胶原膜将被冻裂。如在高于-30 ℃预冷模板,胶原溶液则不容易冻实。由于冷冻速度减慢游离水和结合水被再分配,将在冷冻和平衡过程中形成较大的冰晶,结果冻干的胶原海绵孔洞明显大,带沟槽的长形孔多。此外加热不宜过早,而且必须在真空状态下进行。
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    据报道GAG可增强胶原交联密度,能较好控制生物降解率,冻干胶原海绵开口孔洞增多,能加强膜的抗张强度等作用[1]。研究证明胶原中加入8%GAG(如硫酸软骨素)最合适[5]。在胶原溶液中加GAG的浓度和速度非常重要,如果浓度太高或流速太快都是有害的,即会导至胶原纤维凝聚,形成粗大条索样物。我们的经验是加GAG溶液的流速应控制在15~30 滴/min,搅拌速度为1000 r/min为宜。

    3.3 胶原海绵及胶原型创伤敷料的结构特点及适应范围的初步探讨

    从上述结果可以看到本法研制的胶原海绵有良好的孔洞结构,是成纤维细胞,炎细胞侵润,以及毛细血管和肉牙组织长入的良好基质材料,可以作为人工真皮和人工皮的内层材料。胶原-聚氨酯复合膜不仅增强了胶原膜强度,而且对水份的蒸发,防止细菌进入具有较好的屏障功能[7,8],这类材料可望用于切痂或削痂植皮创面等。涂聚氨酯胶原膜和胶原纱布烧伤敷料,内层均有一薄层多孔胶原膜,与组织有良好的亲和性,容易粘附,无不良刺激,并具有一定的止血和减少渗出的作用;外层材料增强了胶原膜的抗张强度,对渗出较多的创面具有引流或蒸发排液的作用,这类材料可以考虑用于烧伤Ⅱ°和供皮区创面等。
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    参考文献

    1 Yannas IV, Burke JF. Design of an artificial skin. I.Basic design principles. J Biomedical Materials Research,1980;14∶65

    2 Dagulakis N, Flink J, Stasikelis R et al. Design of an artificial skin. Part Ⅲ.Control of pore structure. J Biomedical Materials Research, 1980;14∶511

    3 Oliver RF, Barker H, Cooke A. Dermal collagen implants. Biomaterials,1982;3∶38

, 百拇医药     4 Doillon CJ, Whyne CF, Brandwein S et al. Collagen-based wound dressing:Control of the pore structure and morphology. J Biomedical Materials Research, 1986;20∶1219

    5 Boyce ST, Hansbrough JF. Biologic attachment, growth, and differentiation of cultured human epidermal keratinocytes on a graftable collagen and chondroitin-6-sulfate substrate. Surgery, 1988;103(4)∶421

    6 Suzuki S, Matsuda K, Isshi N et al. Clinical evaluation of a new bilayer “artificial skin” composed of collagen sponge and silicone layer. British J Plastic Surgery, 1990;43∶47

    7 吴志谷,孙同柱,田惠民等.创伤修复材料水蒸气透过性测定的研究.生物医学工程学杂志,1997;14(3)∶243

    8 吴志谷,孙同柱,祝小枫等.一种研究创伤覆盖材料细菌透过性的测试装置,生物医学工程学杂志,1996;13(1)∶90

    收稿:1998-02-19 修回:1998-05-14, 百拇医药