生物心脏瓣膜材料及其保存液的细胞毒性研究*
作者：程述森 石应康 梁卫东 李伟如 熊 英
单位：程述森 石应康 梁卫东(华西医科大学 附属第一医院胸外科，成都 610041)；李伟如 熊 英(华西医科大学 附属第二医院儿科，成都 610041)
关键词：生物心脏瓣膜材料；细胞毒性
生物医学工程学杂志990303 摘要 采用培养的人胚肺成纤维细胞(HEL)和鼠L-929细胞分析比较商业用生物心瓣材料保存在甲醛防霉液和Hank's液中的细胞毒性。并计算浸泡前和浸泡10、20、30 d周期中不同保存方式材料的细胞增殖抑制指数(CPII)，结果显示：(1)商业用生物心瓣材料保存在甲醛和Hank's液中均有明显的细胞毒性，随浸泡时间延长材料的细胞毒性逐渐降低。浸泡30 d材料的CPII仍高达19%～26%，提示浸泡减毒效果不佳；(2)HEL细胞敏感地反映材料的细胞毒性，但对毒性作用较弱的材料而言HEL与L-929的细胞毒性敏感性并无明显区别；(3)甲醛有明显的原发性细胞毒性，随浸泡时间延长其细胞毒性迅速减弱。作者认为，商业用生物心瓣材料具有显著长期的细胞毒性，生物材料细胞毒性试验使用人成纤维细胞更为敏感与准确。
, http://www.100md.com
Study of Cytotoxicity of Bioprosthetic Heart Valve
Material and Its Store Solution
Cheng Shusen1 Shi Yingkang1 Liang Weidong1 Li Weiru2
1 (Department of Cardiothoraic Surgery, The First Affiliated Hospital, West China University
of Medical Sciences, Chengdu 610041)
2 (Department of paediatrics, The Second Affiliated Hospital, West China
, 百拇医药
University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract This study compared the cytotoxicities of bioprosthetic heart valve materials crosslinked by glutaraldehyde, stored in 4% formaldehyde or Hank's solution. Human embryonic pulmonary fibroblasts or L-929 cell culture in vitro were used. Cell proliferative inhibiton index(CPⅡ) was calculated for bioprosthetic heart valve materials using different store methods in different rinse periods(before, 10 days, 20 days, 30days).The results demonstrate:(1)bioprosthetic heart valve materials stored in 4% formaldehyde or in Hank's solution both have significant cytotoxicity, and the longer the rinse time continues, the lower the cytotoxicity declines; (2) HEL cell is more sensitive than L-929 cell in detecting the cytotoxicity of toxic biomaterials but for weak toxic biomaterials the two cell lines are not significanth different; (3) formatldehyde solution increases the cytotoxicity of biomaterials stored in it, but the enhanced cytotoxicity can be easily relieved by rinse. The authors conclude that bioprosthetic heart valve materials have long term significant cytotoxicity and the biomaterial cytotoxicity test using human fibroblasts is more sensitive and precise than other tests.
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Key words Bioprosthetic heart valve materials Cytotoxicity
1 前 言
生物心瓣植入体内具有良好的血流动力学和不需长期抗凝的优点，但其耐久性问题迄今尚未解决，严重阻碍了生物心瓣在临床上的广泛使用。影响生物心脏瓣膜耐久性的主要原因是交变应力作用下瓣叶的退性变和钙化。从临床实践来看，植入晚期进行性加速的生物材料钙化对瓣膜的使用寿命威胁更大，迄今尚无可供临床使用的有效缓解钙化方法。目前商业用生物心脏瓣膜都是经戊二醛交联处理、4%甲醛保存，是一种失去活性的异种生物材料。采用生物材料生理活化的方法，即利用自体细胞生长覆盖生物材料表面，依赖活细胞正常的离子泵功能防止生物材料钙化是当今国内外研究的热点。生物材料的生物相容性检测是筛选材料十分重要的环节。我们旨在评价不同细胞对生物心脏瓣膜细胞毒性检测敏感性有无差异，以选择合理、准确的评价生物材料细胞毒性的实验方法。
, 百拇医药
2 材 料
采集健康牦牛的完整心包，剥去心包表面的脂肪组织，取心前区部分用生理盐水充分漂洗后用Hank's液处理，使用戊二醛(Glutaraldehyde,GA)交联处理，然后分别置于4%甲醛防霉液或Hank's液中，4～10 ℃保存。实验样品剪裁成为1 cm圆形片，每片重约30 mg。
实验细胞使用人胚肺成纤维细胞(HEL)和鼠L-929细胞，RPMI-1640加入10%小牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺作为培养液。5%CO2孵箱37 ℃条件下培养3～4 d，0.25%胰酶消化后加入RPMI-1640培养液稀释制成细胞悬液，细胞计数2.62×103/ml。
3 方 法
取出保存的心包样品用生理盐水彻底冲洗，再用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次。心包样品以“M”表示，实验分4个阶段进行。第1阶段为未浸泡期、以M0表示；第2至4阶段心包材料使用DMEM液浸泡，浸泡液内含青霉素80 U/ml，链霉素80 μg/L。浸泡液量为1∶10(即每1.0cm2材料加10 ml浸泡液)。第2阶段为浸泡10 d，心包材料以M1表示；第3阶段为浸泡20 d，心包材料以M2表示；第4阶段为浸泡30 d，心包材料以M3表示。每实验组每阶段的样品数均为4(n=4)。浸泡过程如图1所示。
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图1 浸泡过程和浸泡材料示意图
Fig 1 Preparation method for material rinse
细胞培养实验采用24孔细胞培养板2个，分别加入HEL和L-929细胞悬液，每孔3 ml，每孔放一片心包材料。每组每阶段同时设正常对照(n=4)，加入DMEM液0.3 ml。5%CO2、37 ℃条件下培养7 d后去除心包材料和培养液，并用PBS液4 ml冲洗3次。贴附于培养孔内壁的细胞层用0.25%胰酶消化。采用血球记数法分别计算各孔活细胞数，取其均数计算各组各阶段心包材料的细胞增殖抑制指数(Cell Proliferation Ihibition Index, CPII)：
统计学分析采用两样本率的χ2检验。
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4 结 果
GA交联材料对HEL和L-929细胞毒性的比较中，第一阶段材料(M0)的HEL细胞毒性明显比L-929的细胞毒性强，差异有显著性(P<0.05)。其余各浸泡阶段材料对HEL和L-929细胞毒性差异无显著性(P>0.05)(见表1)。
表1 不同浸泡阶段材料对HEL和L-929的细胞毒性
Table 1 Biomaterials cytotoxicity in HEL and L-929 Materials
HEL
L-929
P
Cell number (
±s) (×103/ml)
, 百拇医药
CPII(%)
CPII(%)
Cell number (±s) (×103/ml)
Control
2.73±0.16
0
3.89±0.36
0
M0
0.12±0.04
95.6
, 百拇医药
0.65±0.10
83.3
<0.05
M1
0.78±0.14
71.4
1.10±0.24
71.7
>0.05
M2
1.55±0.42
43.2
2.12±0.25
, 百拇医药
45.5
>0.05
M3
2.01±0.31
26.2
2.65±0.23
31.8
>0.05
在4%甲醛防霉液或Hank's液保存的GA交联的各浸泡阶段材料对HEL细胞毒性比较中，第1、4阶段材料的细胞毒性无显著性差异，第2、第3阶段甲醛保存GA材料的细胞毒性明显比Hank's液保存GA材料的细胞毒性强，差异有显著性(P<0.05)。随浸泡时间延长，两组材料的细胞增殖抑制指数均逐渐降低(见表2)。表2 甲醛防霉液与Hank's液保存的GA交联材料各浸泡阶段HEL细胞毒性比较
, 百拇医药
Table 2 Cytotoxicity of biomaterials stored in 4% Formaldehyde and Hank's Materials
4% Formaldehyde
Hank's
P
Cell number (±s) (×103/ml)
CPII(%)
Cell number (±s) (×103/ml)
, http://www.100md.com
CPII(%)
Control
2.37±0.16
0
2.73±0.16
0
M0
0.22±0.08
91
0.13±0.04
95.6
>0.05
M1
, 百拇医药
1.18±0.14
56.8
0.94±0.14
71.4
<0.05
M2
1.96±0.27
32
1.55±0.42
43.2
<0.05
M3
2.20±0.11
, 百拇医药
19.4
2.01±0.31
26.4
>0.05
5 讨 论
内皮细胞具有维持成纤维细胞的营养，参与合成某些结缔成分，防止血小板粘附，加速血栓素灭活，合成前列环素，参与纤维蛋白溶解等重要功能[1]。人工生物心脏瓣膜与同种异体主动脉瓣植入体内晚期进行性加速衰败和钙化与植入体内后生物心脏瓣膜永久缺乏内皮细胞覆盖的现象有关联。内皮细胞种植覆盖生物心脏瓣膜有可能延缓或防止生物瓣膜的钙化，并防止血栓形成。要使内皮细胞在生物瓣膜材料表面牢固附着并形成细胞单层，要求交联处理保存后的生物瓣膜材料没有细胞毒性、并适于内皮细胞粘附生长[2]。
目前商业用生物心脏瓣膜多采用0.5%～0.625%戊二醛交联固定，4%甲醛醋酸缓冲液保存[3]。材料检测侧重于拉力试验、生化分析、免疫反应、组织学检查和微生物的培养。近年国内有关的研究参照国际标准化组织(ISO)要求，采用鼠肾成纤维细胞L-929，通过细胞增殖度、细胞形态及琼脂覆盖等试验判定材料的细胞毒性[4]。商品化生物心脏瓣膜材料经上述试验均未发现其存在细胞毒性。韩波等[5]报道戊二醛与环氧交联处理的牛心包材料和浸出液对培养L-929细胞生长无影响，材料直接细胞毒性为0级。金磊等[6]报道铬配合物与戊二醛分别交联处理的牛心包对L-929细胞生长无影响，材料的直接细胞毒性分别为Ⅰ级与0-Ⅰ级。Van Luyn[7]，石应康等[8]使用人胚肺成纤维细胞，Eberl[2]使用内皮细胞均证实商品化生物心脏瓣膜材料具有长期的细胞毒性。这相互矛盾的试验结果说明目前生物心脏瓣膜材料的细胞毒性评价方法急待改进和完善。
, 百拇医药
L-929细胞在细胞毒性试验中使用最早和最广泛，该细胞是Earle等[9]1948年分离出来的。具有繁殖迅速、传代容易、体外培养条件低和易保存等优点，1982年美国标准学会将该细胞推荐为细胞毒性试验的标准细胞之一[10]。由于L-929细胞与人体细胞种属来源不同，并且该细胞具有无限分裂增殖类似肿瘤的特征，因此一些学者对利用L-929细胞代替人体正常组织细胞评价材料的细胞毒性的敏感性和可靠性产生了疑问。本研究比较HEL和L-929细胞对商业用生物心脏瓣膜材料细胞毒性的敏感性，结果显示商业用生物心脏瓣膜材料在HEL和L-929细胞培养中均有明显长期的细胞毒性，未经浸泡解毒的材料CPII高达91%～95%，即使浸泡30 d后材料的CPII仍高达26%～32%。本研究结果亦证实了Van Luyn[7]、石应康等[8]国内外学者有关商业用生物心脏瓣膜有显著长期的细胞毒性的观点。本实验第一阶段材料细胞毒性比较中HEL比L-929更敏感地反映出材料的细胞毒性，而其他浸泡阶段两者CPII并无明显差异(P>0.05)，说明HEL对细胞毒性较强的材料敏感性高，但对毒性弱的材料两种细胞并无明显差异。
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我们采用人胚肺成纤维细胞对生物心脏瓣膜材料保存于甲醛防霉液和Hank's液中的细胞毒性进行比较。未浸泡和浸泡30 d后两种保存方式材料的细胞毒性无显著性差异(P>0.05)，浸泡10、20 d时，甲醛保存的材料细胞毒性明显强于Hank's液保存的材料(P<0.05)。生物材料的细胞毒性作用分为原发性和继发性，原发性细胞毒性作用归因于材料可滤去的、易溶出的细胞毒性产物，随着溶出物的量、速度和持续时间的不同，表现出不同程度的细胞毒性反应；继发性细胞毒性作用是由水解和酶解反应造成的细胞毒性。甲醛对材料的细胞毒性主要表现为原发性细胞毒性，但经30 d浸泡漂洗后材料表面的甲醛基本溶出，对材料细胞毒性的影响明显减轻，所以浸泡30 d后甲醛与Hank's保存的生物心瓣材料细胞毒性差异无显著性。
生物心瓣材料的细胞毒性表现为原发性和继发性细胞毒性[7]，在浸泡初期以原发性细胞毒性为主，经20～30 d浸泡漂洗后以继发性细胞毒性为主，两者之间无明确的分界线。本研究中浸泡30 d后生物心瓣材料无论保存于甲醛或Hank's液中均有明显的细胞毒性。Viebe[11]发现商品化戊二醛交联处理的同种异体大隐静脉彻底冲洗后每克24 h仍释放13.8 ppm戊二醛直至一个月。极微量的戊二醛对内皮细胞有明显的细胞毒性。这可能是商品生物心瓣缺乏内皮细胞覆盖的重要原因之一。在目前新型生物瓣的研究中，即要考虑交联后生物材料的力学性能，也应严格评价材料的细胞毒性，明确其毒性作用机制，寻找适宜的减毒方法以利于内皮细胞的生长。
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* 国家自然科学基金资助项目(A1223)
参考文献
1 Jonas RA, Ziemer G, Bitton L et al. Cryopreserved and fresh antibiotic sterilized valved aortic homograft conduits in a long-term sheep model hemodynamic, angiographic and histologic comparisons. J Thorac Cardiovase Surg, 1988; 96∶746
2 Eberl T, Siedler S, Schumacher B et al. Experimental in vitrol endothelialization of cardiac valve leaflets. Ann Thorac Surg, 1992; 53(3)∶487
, 百拇医药
3 蔡用之主编.人造心脏瓣膜与瓣膜置换术.北京：人民卫生出版社，1986∶77-101
4 吕晓迎，邱立崇，薛 淼等.十二种生物材料的细胞毒性研究—组织培养琼脂覆盖试验.上海生物医学工程通讯，1986；1(1)∶29
5 Han Bao, Wuzhengshu, Yue Yilun et al. A new crosslinking agent for tissue valve. In:Proceedings of Xi'an satellite conference of MP-BME, World Congress, 1991∶B5-1
6 金 磊，朱晓东，陈兰英.铬配合物处理的牛心包瓣材料生物相容性的初步评价.透析与人工器官，1992；2(3)∶94
7 Van Luyn MJA, Van Wachem PB, Damink LO et al. Relations between in vitrol cytotoxicity and crosslinked dermal sheep collagens. J Biomed Mat Res, 1992; 26∶1091
, 百拇医药
8 石应康，程述森，魏蜀亮等.不同交联改性牛心包材料的细胞毒性研究.生物医学工程学杂志，1995；12(4)∶350
9 Rosenbluth SA, Weddington GR, Guess WL et al. Tissue culture method for screening toxicity of plastic materials to be used in medical practice. J of Pharmceutical Science, 1965; 54(1)∶156
10 Wendt SJ, Ziemecki TL, Spagberg LS et al. Indirect cytotoxic evaluation of dental materials. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1993; 75(3)∶353
11 Wiebe D. Glutaraldehyde release from vascular prostheses of biologic orgin. Surgery, 1988; 104(1)∶26
(收稿：1999-01-29), http://www.100md.com
单位：程述森 石应康 梁卫东(华西医科大学 附属第一医院胸外科，成都 610041)；李伟如 熊 英(华西医科大学 附属第二医院儿科，成都 610041)
关键词：生物心脏瓣膜材料；细胞毒性
生物医学工程学杂志990303 摘要 采用培养的人胚肺成纤维细胞(HEL)和鼠L-929细胞分析比较商业用生物心瓣材料保存在甲醛防霉液和Hank's液中的细胞毒性。并计算浸泡前和浸泡10、20、30 d周期中不同保存方式材料的细胞增殖抑制指数(CPII)，结果显示：(1)商业用生物心瓣材料保存在甲醛和Hank's液中均有明显的细胞毒性，随浸泡时间延长材料的细胞毒性逐渐降低。浸泡30 d材料的CPII仍高达19%～26%，提示浸泡减毒效果不佳；(2)HEL细胞敏感地反映材料的细胞毒性，但对毒性作用较弱的材料而言HEL与L-929的细胞毒性敏感性并无明显区别；(3)甲醛有明显的原发性细胞毒性，随浸泡时间延长其细胞毒性迅速减弱。作者认为，商业用生物心瓣材料具有显著长期的细胞毒性，生物材料细胞毒性试验使用人成纤维细胞更为敏感与准确。
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Study of Cytotoxicity of Bioprosthetic Heart Valve
Material and Its Store Solution
Cheng Shusen1 Shi Yingkang1 Liang Weidong1 Li Weiru2
1 (Department of Cardiothoraic Surgery, The First Affiliated Hospital, West China University
of Medical Sciences, Chengdu 610041)
2 (Department of paediatrics, The Second Affiliated Hospital, West China
, 百拇医药
University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract This study compared the cytotoxicities of bioprosthetic heart valve materials crosslinked by glutaraldehyde, stored in 4% formaldehyde or Hank's solution. Human embryonic pulmonary fibroblasts or L-929 cell culture in vitro were used. Cell proliferative inhibiton index(CPⅡ) was calculated for bioprosthetic heart valve materials using different store methods in different rinse periods(before, 10 days, 20 days, 30days).The results demonstrate:(1)bioprosthetic heart valve materials stored in 4% formaldehyde or in Hank's solution both have significant cytotoxicity, and the longer the rinse time continues, the lower the cytotoxicity declines; (2) HEL cell is more sensitive than L-929 cell in detecting the cytotoxicity of toxic biomaterials but for weak toxic biomaterials the two cell lines are not significanth different; (3) formatldehyde solution increases the cytotoxicity of biomaterials stored in it, but the enhanced cytotoxicity can be easily relieved by rinse. The authors conclude that bioprosthetic heart valve materials have long term significant cytotoxicity and the biomaterial cytotoxicity test using human fibroblasts is more sensitive and precise than other tests.
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Key words Bioprosthetic heart valve materials Cytotoxicity
1 前 言
生物心瓣植入体内具有良好的血流动力学和不需长期抗凝的优点，但其耐久性问题迄今尚未解决，严重阻碍了生物心瓣在临床上的广泛使用。影响生物心脏瓣膜耐久性的主要原因是交变应力作用下瓣叶的退性变和钙化。从临床实践来看，植入晚期进行性加速的生物材料钙化对瓣膜的使用寿命威胁更大，迄今尚无可供临床使用的有效缓解钙化方法。目前商业用生物心脏瓣膜都是经戊二醛交联处理、4%甲醛保存，是一种失去活性的异种生物材料。采用生物材料生理活化的方法，即利用自体细胞生长覆盖生物材料表面，依赖活细胞正常的离子泵功能防止生物材料钙化是当今国内外研究的热点。生物材料的生物相容性检测是筛选材料十分重要的环节。我们旨在评价不同细胞对生物心脏瓣膜细胞毒性检测敏感性有无差异，以选择合理、准确的评价生物材料细胞毒性的实验方法。
, 百拇医药
2 材 料
采集健康牦牛的完整心包，剥去心包表面的脂肪组织，取心前区部分用生理盐水充分漂洗后用Hank's液处理，使用戊二醛(Glutaraldehyde,GA)交联处理，然后分别置于4%甲醛防霉液或Hank's液中，4～10 ℃保存。实验样品剪裁成为1 cm圆形片，每片重约30 mg。
实验细胞使用人胚肺成纤维细胞(HEL)和鼠L-929细胞，RPMI-1640加入10%小牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺作为培养液。5%CO2孵箱37 ℃条件下培养3～4 d，0.25%胰酶消化后加入RPMI-1640培养液稀释制成细胞悬液，细胞计数2.62×103/ml。
3 方 法
取出保存的心包样品用生理盐水彻底冲洗，再用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次。心包样品以“M”表示，实验分4个阶段进行。第1阶段为未浸泡期、以M0表示；第2至4阶段心包材料使用DMEM液浸泡，浸泡液内含青霉素80 U/ml，链霉素80 μg/L。浸泡液量为1∶10(即每1.0cm2材料加10 ml浸泡液)。第2阶段为浸泡10 d，心包材料以M1表示；第3阶段为浸泡20 d，心包材料以M2表示；第4阶段为浸泡30 d，心包材料以M3表示。每实验组每阶段的样品数均为4(n=4)。浸泡过程如图1所示。
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图1 浸泡过程和浸泡材料示意图
Fig 1 Preparation method for material rinse
细胞培养实验采用24孔细胞培养板2个，分别加入HEL和L-929细胞悬液，每孔3 ml，每孔放一片心包材料。每组每阶段同时设正常对照(n=4)，加入DMEM液0.3 ml。5%CO2、37 ℃条件下培养7 d后去除心包材料和培养液，并用PBS液4 ml冲洗3次。贴附于培养孔内壁的细胞层用0.25%胰酶消化。采用血球记数法分别计算各孔活细胞数，取其均数计算各组各阶段心包材料的细胞增殖抑制指数(Cell Proliferation Ihibition Index, CPII)：
统计学分析采用两样本率的χ2检验。
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4 结 果
GA交联材料对HEL和L-929细胞毒性的比较中，第一阶段材料(M0)的HEL细胞毒性明显比L-929的细胞毒性强，差异有显著性(P<0.05)。其余各浸泡阶段材料对HEL和L-929细胞毒性差异无显著性(P>0.05)(见表1)。
表1 不同浸泡阶段材料对HEL和L-929的细胞毒性
Table 1 Biomaterials cytotoxicity in HEL and L-929 Materials
HEL
L-929
P
Cell number (
±s) (×103/ml), 百拇医药
CPII(%)
CPII(%)
Cell number (
±s) (×103/ml)Control
2.73±0.16
0
3.89±0.36
0
M0
0.12±0.04
95.6
, 百拇医药
0.65±0.10
83.3
<0.05
M1
0.78±0.14
71.4
1.10±0.24
71.7
>0.05
M2
1.55±0.42
43.2
2.12±0.25
, 百拇医药
45.5
>0.05
M3
2.01±0.31
26.2
2.65±0.23
31.8
>0.05
在4%甲醛防霉液或Hank's液保存的GA交联的各浸泡阶段材料对HEL细胞毒性比较中，第1、4阶段材料的细胞毒性无显著性差异，第2、第3阶段甲醛保存GA材料的细胞毒性明显比Hank's液保存GA材料的细胞毒性强，差异有显著性(P<0.05)。随浸泡时间延长，两组材料的细胞增殖抑制指数均逐渐降低(见表2)。表2 甲醛防霉液与Hank's液保存的GA交联材料各浸泡阶段HEL细胞毒性比较
, 百拇医药
Table 2 Cytotoxicity of biomaterials stored in 4% Formaldehyde and Hank's Materials
4% Formaldehyde
Hank's
P
Cell number (
±s) (×103/ml)CPII(%)
Cell number (
±s) (×103/ml), http://www.100md.com
CPII(%)
Control
2.37±0.16
0
2.73±0.16
0
M0
0.22±0.08
91
0.13±0.04
95.6
>0.05
M1
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1.18±0.14
56.8
0.94±0.14
71.4
<0.05
M2
1.96±0.27
32
1.55±0.42
43.2
<0.05
M3
2.20±0.11
, 百拇医药
19.4
2.01±0.31
26.4
>0.05
5 讨 论
内皮细胞具有维持成纤维细胞的营养，参与合成某些结缔成分，防止血小板粘附，加速血栓素灭活，合成前列环素，参与纤维蛋白溶解等重要功能[1]。人工生物心脏瓣膜与同种异体主动脉瓣植入体内晚期进行性加速衰败和钙化与植入体内后生物心脏瓣膜永久缺乏内皮细胞覆盖的现象有关联。内皮细胞种植覆盖生物心脏瓣膜有可能延缓或防止生物瓣膜的钙化，并防止血栓形成。要使内皮细胞在生物瓣膜材料表面牢固附着并形成细胞单层，要求交联处理保存后的生物瓣膜材料没有细胞毒性、并适于内皮细胞粘附生长[2]。
目前商业用生物心脏瓣膜多采用0.5%～0.625%戊二醛交联固定，4%甲醛醋酸缓冲液保存[3]。材料检测侧重于拉力试验、生化分析、免疫反应、组织学检查和微生物的培养。近年国内有关的研究参照国际标准化组织(ISO)要求，采用鼠肾成纤维细胞L-929，通过细胞增殖度、细胞形态及琼脂覆盖等试验判定材料的细胞毒性[4]。商品化生物心脏瓣膜材料经上述试验均未发现其存在细胞毒性。韩波等[5]报道戊二醛与环氧交联处理的牛心包材料和浸出液对培养L-929细胞生长无影响，材料直接细胞毒性为0级。金磊等[6]报道铬配合物与戊二醛分别交联处理的牛心包对L-929细胞生长无影响，材料的直接细胞毒性分别为Ⅰ级与0-Ⅰ级。Van Luyn[7]，石应康等[8]使用人胚肺成纤维细胞，Eberl[2]使用内皮细胞均证实商品化生物心脏瓣膜材料具有长期的细胞毒性。这相互矛盾的试验结果说明目前生物心脏瓣膜材料的细胞毒性评价方法急待改进和完善。
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L-929细胞在细胞毒性试验中使用最早和最广泛，该细胞是Earle等[9]1948年分离出来的。具有繁殖迅速、传代容易、体外培养条件低和易保存等优点，1982年美国标准学会将该细胞推荐为细胞毒性试验的标准细胞之一[10]。由于L-929细胞与人体细胞种属来源不同，并且该细胞具有无限分裂增殖类似肿瘤的特征，因此一些学者对利用L-929细胞代替人体正常组织细胞评价材料的细胞毒性的敏感性和可靠性产生了疑问。本研究比较HEL和L-929细胞对商业用生物心脏瓣膜材料细胞毒性的敏感性，结果显示商业用生物心脏瓣膜材料在HEL和L-929细胞培养中均有明显长期的细胞毒性，未经浸泡解毒的材料CPII高达91%～95%，即使浸泡30 d后材料的CPII仍高达26%～32%。本研究结果亦证实了Van Luyn[7]、石应康等[8]国内外学者有关商业用生物心脏瓣膜有显著长期的细胞毒性的观点。本实验第一阶段材料细胞毒性比较中HEL比L-929更敏感地反映出材料的细胞毒性，而其他浸泡阶段两者CPII并无明显差异(P>0.05)，说明HEL对细胞毒性较强的材料敏感性高，但对毒性弱的材料两种细胞并无明显差异。
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我们采用人胚肺成纤维细胞对生物心脏瓣膜材料保存于甲醛防霉液和Hank's液中的细胞毒性进行比较。未浸泡和浸泡30 d后两种保存方式材料的细胞毒性无显著性差异(P>0.05)，浸泡10、20 d时，甲醛保存的材料细胞毒性明显强于Hank's液保存的材料(P<0.05)。生物材料的细胞毒性作用分为原发性和继发性，原发性细胞毒性作用归因于材料可滤去的、易溶出的细胞毒性产物，随着溶出物的量、速度和持续时间的不同，表现出不同程度的细胞毒性反应；继发性细胞毒性作用是由水解和酶解反应造成的细胞毒性。甲醛对材料的细胞毒性主要表现为原发性细胞毒性，但经30 d浸泡漂洗后材料表面的甲醛基本溶出，对材料细胞毒性的影响明显减轻，所以浸泡30 d后甲醛与Hank's保存的生物心瓣材料细胞毒性差异无显著性。
生物心瓣材料的细胞毒性表现为原发性和继发性细胞毒性[7]，在浸泡初期以原发性细胞毒性为主，经20～30 d浸泡漂洗后以继发性细胞毒性为主，两者之间无明确的分界线。本研究中浸泡30 d后生物心瓣材料无论保存于甲醛或Hank's液中均有明显的细胞毒性。Viebe[11]发现商品化戊二醛交联处理的同种异体大隐静脉彻底冲洗后每克24 h仍释放13.8 ppm戊二醛直至一个月。极微量的戊二醛对内皮细胞有明显的细胞毒性。这可能是商品生物心瓣缺乏内皮细胞覆盖的重要原因之一。在目前新型生物瓣的研究中，即要考虑交联后生物材料的力学性能，也应严格评价材料的细胞毒性，明确其毒性作用机制，寻找适宜的减毒方法以利于内皮细胞的生长。
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* 国家自然科学基金资助项目(A1223)
参考文献
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2 Eberl T, Siedler S, Schumacher B et al. Experimental in vitrol endothelialization of cardiac valve leaflets. Ann Thorac Surg, 1992; 53(3)∶487
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3 蔡用之主编.人造心脏瓣膜与瓣膜置换术.北京：人民卫生出版社，1986∶77-101
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5 Han Bao, Wuzhengshu, Yue Yilun et al. A new crosslinking agent for tissue valve. In:Proceedings of Xi'an satellite conference of MP-BME, World Congress, 1991∶B5-1
6 金 磊，朱晓东，陈兰英.铬配合物处理的牛心包瓣材料生物相容性的初步评价.透析与人工器官，1992；2(3)∶94
7 Van Luyn MJA, Van Wachem PB, Damink LO et al. Relations between in vitrol cytotoxicity and crosslinked dermal sheep collagens. J Biomed Mat Res, 1992; 26∶1091
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8 石应康，程述森，魏蜀亮等.不同交联改性牛心包材料的细胞毒性研究.生物医学工程学杂志，1995；12(4)∶350
9 Rosenbluth SA, Weddington GR, Guess WL et al. Tissue culture method for screening toxicity of plastic materials to be used in medical practice. J of Pharmceutical Science, 1965; 54(1)∶156
10 Wendt SJ, Ziemecki TL, Spagberg LS et al. Indirect cytotoxic evaluation of dental materials. Oral Surg Oral Med Oral Pathol, 1993; 75(3)∶353
11 Wiebe D. Glutaraldehyde release from vascular prostheses of biologic orgin. Surgery, 1988; 104(1)∶26
(收稿：1999-01-29), http://www.100md.com