氢氧化钠对红细胞膜带Ⅲ蛋白作用的研究
作者：傅国辉 姜晓姝 滨崎直孝
单位：傅国辉 姜晓姝 (哈尔滨医科大学 病理生理教研室，哈尔滨 150086)；滨崎直孝 (日本国九州大学 医学部)
关键词：氢氧化钠；带Ⅲ蛋白；红细胞膜
摘要 本实验以红细胞膜带 摘要 本实验以红细胞膜带Ⅲ蛋白C1(Ala S93-Val 911)及KS-2(Ser 731-Lys 743)/肽链的释放量为指标，研究了不同浓度的氢氧化钠对带Ⅲ蛋白的影响。结果证明随着氢氧化钠浓度的升高多肽的释放量明显增多，用100mM NaOH预处理红细胞膜，再用胰蛋白酶消化，对从红细胞膜释放的多肽进行了氨基酸测序分析。
The Effect of NaOH on Erythrocyte Membrane Protein Band 3
, 百拇医药 Fu Guohui1 Jiang Xiaoshu1 Naotaka Hamasaki2
1 (Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086)
2 (Faculty of Medicine, Kyushu University, Japan)
Abstract We used the C1 (Ala 893-Val 911) and KS-2(Ser 731-Lys 743) peptides of band 3 protein as indicators to study the effect of NaOH on the band 3. Five peptides were released from the band 3 molecule when 100mM NaOH-stripped membrane was digested with trypsin. All of the five peptides were sequenced.
, 百拇医药
Key words NaOH Band 3 protein Erythrocyte membrane
1 引 言
带Ⅲ蛋白是存在于红细胞膜上的一种内在性膜蛋白质，它占红细胞膜蛋白质总量的25%，其主要功能是负责红细胞内外的Cl-/HCO-3离子交换，在结构上，与这种离子交换功能有关的区域是C末端的膜贯通区域，预测在该部位，带Ⅲ蛋白14次穿过红细胞膜，并在两个穿膜肽链之间的形成袢(图1)，带Ⅲ蛋白N末端、C末端的多肽袢以及C末端的尾部均具有高度的亲水性，但在一般情况下，胰蛋白酶只对N末端的酶切位点起作用，对后两者却不发挥作用。这两个部位对胰蛋白酶的抵抗性表明他们虽然具有亲水性但并不游离于细胞浆中，而是以某种形式结合或隐藏在红细胞膜中。
, 百拇医药
图1 带Ⅲ蛋白构造模型
Fig 1 Topological model of band3 protein
我们用100mmol/L NaOH对红细胞膜进行预处理，以期待多肽袢及C末端的尾部能够裸露出红细胞膜的表面，然后用高效液相色谱(HPLC)法检定NaOH处理后的红细胞膜带Ⅲ蛋白对胰蛋白酶的反应性，并用氨基酸测序仪检定了所释放的主要肽链的氨基酸序列。
2 材料与方法
2.1 红细胞血影的制备
正常人血(在4℃保存少于2周)，用PBS洗4次，向洗后的红细胞悬液中加入胰蛋白酶，在37 ℃环境中温育1小时，以切掉红细胞表面粘附的蛋白质，再用PBS洗4次去除胰蛋白酶，然
后加入20倍体积的5 mmol/L NaHCO3使红细胞溶解，同时加入对甲苯磺酰氟(PMSF 0.2 mg/ml)，并在冰浴条件下搅拌5 min，以1 500 g，在4℃离心20 min后，用5 mmol/L NaHCO3洗3次，沉淀调蛋白浓度为1 mg/ml，加胰蛋白酶15 μg/ml，在冰浴中搅拌1 h，切断带Ⅲ蛋白N末端，以27 200 g，在4 ℃离心20 min，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次，再调蛋白浓度为1 mg/ml。
, 百拇医药
2.2 NaOH血影的制备
向1 mg/ml蛋白浓度的红细胞血影中加入5倍体积的100 mmol/L NaOH，在冰浴环境下搅拌15 min，以27 200 g，在4 ℃离心20分钟，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次，再调蛋白浓度为1 mg/ml。
2.3 胰蛋白酶处理
分别取制备的红细胞血影及NaOH血影1 ml，加入Enppendorf试管中，再向其中加入胰蛋白酶(15 μg/ml)，在37 ℃温浴1 h，然后以27 200 g，在4 ℃离心20 min，取上清部分进行高效液相色谱(HPLC)分析。
2.4 HPLC分析条件
采用逆相色谱分析柱(Cosmosil,C-18, 4.6×250mm)，以0-100%乙腈(内含0.1%三氟乙酸)线性梯度，流速为0.5 ml/min。
, 百拇医药
2.5 蛋白定量采用Lowry法
3 结果与讨论
我们以C-1和KS-2肽链的释放量为指标，测定了在不同浓度NaOH作用下多肽的释放量(图2)，多肽的释放量以31 min时释放的肽链为标准，该肽链在一般条件下释放量是恒定的，随着NaOH浓度的升高，C-1和KS-2肽链的释放逐渐增加，最终确定100 mmol/L NaOH为最适浓度，图3(PanelA)为红细胞血影(已切除带Ⅲ蛋白N末端)未经NaOH处理在胰蛋白酶的作用下释放至上清液中多肽的HPLC分析图谱，该图谱未显示明显的主峰，在保留时间为20 min的较高波峰经氨基酸测序也无法确定其主要多肽成分，这一结果证明，在自然状态下红细胞膜带Ⅲ蛋白除N末端的其它亲水部分都以某种形式隐藏在红细胞膜中。
, 百拇医药
图2 氢氧化钠预处理的红细胞膜再用胰蛋白酶消化所释放的C1和KS-2的定量分析，两种多肽释放量以保留时间为31分的多肽释放量为标准
Fig 2 Quantitative analyses of C1 and KS-2 peptides from NaOH-treated membrane by trypsin The amounts of peptides released from membrane were expressed as the relative amounts to that of an internal standard peptide, the peak 31 fraction, which was always released in the same way into the supernatant under different digestion conditions
, 百拇医药
图3 从红细胞膜释放至上清中的多肽HPLC图谱
A：单纯的胰蛋白酶消化；B：胰蛋白酶消化前先用NaOH预处理。1：KS-2；2：Cl;3:GPA;4:ks-4;5:ks-5
Fig 3 HPLC analysis of membrane peptides released into the supernatant
Panel A:trypsin treatment; Panel B:pretreated by 100mM NaOH before trypsin treatment.1：KS-2；2：Cl;3:GPA;4:ks-4;5:ks-5
当用100 mmol/L NaOH预处理红细胞血影之后，在胰蛋白酶的作用下，带Ⅲ蛋白释放之上清中的多肽图谱发生了明显变化，多肽的释放增加(图3，PanelB)，对主要波峰进行氨基酸测序的结果见表1。
, http://www.100md.com
表1 释放至上清中多肽的氨基酸序列
Table 1 Amino acid sequence of peptides released into supernatant
KS-2
C1
KS-4
KS-5
GPA*
Ser731
Ala893
Gly647
Gly361
, 百拇医药
Lys101
Val
Thr
Trp
Leu
Ser
Thr
Phe
Val
Asp
Pro
His
Asp
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Ile
Leu
Ser
Ala
Glu
His
Asn
Asp
Asn
Glu
Pro
Gly
Val
, 百拇医药
Ala
Glu
Leu
Gly
Lys
Leu
Gly
Gly
Pro
Pro
Thr
Arg
Leu
, http://www.100md.com
Asp
Leu
Val
Asp
Arg656
Asp
↓
Met
Glu
Pro
↓
Gly
Tyr
, 百拇医药
Leu
Asp131
Lys743
Asp
?
Glu
Val
Ala
Met
Pro
Val911
* GPA：血型糖蛋白A 带Ⅲ蛋白是一种多次穿过红细胞膜的大分子量蛋白质，与一次性穿膜蛋白质不同，它有多个与脂质双分子层相互作用的位点，穿膜的C-结构域又是离子交换的活性部位，因此有关带Ⅲ蛋白C-结构域构造与功能的研究一直是这一领域的热点和难点，这些研究的目的之一就是明确哪些氨基酸在脂质分子层内，哪些为连接穿膜序列之间的多肽袢，以及与其他蛋白质相互作用的位点。但是在自然状态下，带Ⅲ蛋白C-结构域对胰蛋白酶具有抵抗性，无法对其进行深入研究。国内外这一领域的研究报告甚少，尚无确切结论。我们采用NaOH对红细胞膜进行预处理，目的使多肽袢部位的氨基酸序列暴露出膜表面，再用胰蛋白酶消化。结果表明，多肽袢释放量对NaOH呈浓度依赖性，当NaOH浓度在100 mmol/L时，多肽的释放量最多，用这种方法我们获得了带Ⅲ蛋白C-结构域的4个多肽链。同时还有血型糖蛋白A(GPA)的C末端。GPA为存在于红细胞膜上的一次性穿膜蛋白质其功能目前尚不十分清楚，这一结果为进一步研究带Ⅲ蛋白C-结构域的功能及其与其它蛋白质的相互作用具有重要意义，我们将对其进行深入研究探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 Fu Guohui, Jiang Xiaoshu.Study of the C-terminal properties of human erythrocyte membrane protein band 3(英文稿).哈尔滨医科大学学报，1998；32(1)∶8
2 傅国辉，姜晓姝，王孝铭.带Ⅲ蛋白C1肽链的纯化及其功能的研究.中国病理生理杂志，投稿中
3 Kang DK,Kenshi Okubo, Naotaka Hamasaki.Structural study of the membrane domain of band 3 by tryptic digestion. J Biol Chem, 1992;267∶19211
4 Hamasaki N,Kenshi Okubo. Band 3 protein physiology, function and structure. Cell Mol Biol, 1996；42(7)∶1025
(收稿：1998-07-12 修回：1998-11-06), 百拇医药
单位：傅国辉 姜晓姝 (哈尔滨医科大学 病理生理教研室，哈尔滨 150086)；滨崎直孝 (日本国九州大学 医学部)
关键词：氢氧化钠；带Ⅲ蛋白；红细胞膜
摘要 本实验以红细胞膜带 摘要 本实验以红细胞膜带Ⅲ蛋白C1(Ala S93-Val 911)及KS-2(Ser 731-Lys 743)/肽链的释放量为指标，研究了不同浓度的氢氧化钠对带Ⅲ蛋白的影响。结果证明随着氢氧化钠浓度的升高多肽的释放量明显增多，用100mM NaOH预处理红细胞膜，再用胰蛋白酶消化，对从红细胞膜释放的多肽进行了氨基酸测序分析。
The Effect of NaOH on Erythrocyte Membrane Protein Band 3
, 百拇医药 Fu Guohui1 Jiang Xiaoshu1 Naotaka Hamasaki2
1 (Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086)
2 (Faculty of Medicine, Kyushu University, Japan)
Abstract We used the C1 (Ala 893-Val 911) and KS-2(Ser 731-Lys 743) peptides of band 3 protein as indicators to study the effect of NaOH on the band 3. Five peptides were released from the band 3 molecule when 100mM NaOH-stripped membrane was digested with trypsin. All of the five peptides were sequenced.
, 百拇医药
Key words NaOH Band 3 protein Erythrocyte membrane
1 引 言
带Ⅲ蛋白是存在于红细胞膜上的一种内在性膜蛋白质，它占红细胞膜蛋白质总量的25%，其主要功能是负责红细胞内外的Cl-/HCO-3离子交换，在结构上，与这种离子交换功能有关的区域是C末端的膜贯通区域，预测在该部位，带Ⅲ蛋白14次穿过红细胞膜，并在两个穿膜肽链之间的形成袢(图1)，带Ⅲ蛋白N末端、C末端的多肽袢以及C末端的尾部均具有高度的亲水性，但在一般情况下，胰蛋白酶只对N末端的酶切位点起作用，对后两者却不发挥作用。这两个部位对胰蛋白酶的抵抗性表明他们虽然具有亲水性但并不游离于细胞浆中，而是以某种形式结合或隐藏在红细胞膜中。
, 百拇医药
图1 带Ⅲ蛋白构造模型
Fig 1 Topological model of band3 protein
我们用100mmol/L NaOH对红细胞膜进行预处理，以期待多肽袢及C末端的尾部能够裸露出红细胞膜的表面，然后用高效液相色谱(HPLC)法检定NaOH处理后的红细胞膜带Ⅲ蛋白对胰蛋白酶的反应性，并用氨基酸测序仪检定了所释放的主要肽链的氨基酸序列。
2 材料与方法
2.1 红细胞血影的制备
正常人血(在4℃保存少于2周)，用PBS洗4次，向洗后的红细胞悬液中加入胰蛋白酶，在37 ℃环境中温育1小时，以切掉红细胞表面粘附的蛋白质，再用PBS洗4次去除胰蛋白酶，然
后加入20倍体积的5 mmol/L NaHCO3使红细胞溶解，同时加入对甲苯磺酰氟(PMSF 0.2 mg/ml)，并在冰浴条件下搅拌5 min，以1 500 g，在4℃离心20 min后，用5 mmol/L NaHCO3洗3次，沉淀调蛋白浓度为1 mg/ml，加胰蛋白酶15 μg/ml，在冰浴中搅拌1 h，切断带Ⅲ蛋白N末端，以27 200 g，在4 ℃离心20 min，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次，再调蛋白浓度为1 mg/ml。
, 百拇医药
2.2 NaOH血影的制备
向1 mg/ml蛋白浓度的红细胞血影中加入5倍体积的100 mmol/L NaOH，在冰浴环境下搅拌15 min，以27 200 g，在4 ℃离心20分钟，沉淀用5 mmol/L NaHCO3洗3次，再调蛋白浓度为1 mg/ml。
2.3 胰蛋白酶处理
分别取制备的红细胞血影及NaOH血影1 ml，加入Enppendorf试管中，再向其中加入胰蛋白酶(15 μg/ml)，在37 ℃温浴1 h，然后以27 200 g，在4 ℃离心20 min，取上清部分进行高效液相色谱(HPLC)分析。
2.4 HPLC分析条件
采用逆相色谱分析柱(Cosmosil,C-18, 4.6×250mm)，以0-100%乙腈(内含0.1%三氟乙酸)线性梯度，流速为0.5 ml/min。
, 百拇医药
2.5 蛋白定量采用Lowry法
3 结果与讨论
我们以C-1和KS-2肽链的释放量为指标，测定了在不同浓度NaOH作用下多肽的释放量(图2)，多肽的释放量以31 min时释放的肽链为标准，该肽链在一般条件下释放量是恒定的，随着NaOH浓度的升高，C-1和KS-2肽链的释放逐渐增加，最终确定100 mmol/L NaOH为最适浓度，图3(PanelA)为红细胞血影(已切除带Ⅲ蛋白N末端)未经NaOH处理在胰蛋白酶的作用下释放至上清液中多肽的HPLC分析图谱，该图谱未显示明显的主峰，在保留时间为20 min的较高波峰经氨基酸测序也无法确定其主要多肽成分，这一结果证明，在自然状态下红细胞膜带Ⅲ蛋白除N末端的其它亲水部分都以某种形式隐藏在红细胞膜中。
, 百拇医药
图2 氢氧化钠预处理的红细胞膜再用胰蛋白酶消化所释放的C1和KS-2的定量分析，两种多肽释放量以保留时间为31分的多肽释放量为标准
Fig 2 Quantitative analyses of C1 and KS-2 peptides from NaOH-treated membrane by trypsin The amounts of peptides released from membrane were expressed as the relative amounts to that of an internal standard peptide, the peak 31 fraction, which was always released in the same way into the supernatant under different digestion conditions
, 百拇医药
图3 从红细胞膜释放至上清中的多肽HPLC图谱
A：单纯的胰蛋白酶消化；B：胰蛋白酶消化前先用NaOH预处理。1：KS-2；2：Cl;3:GPA;4:ks-4;5:ks-5
Fig 3 HPLC analysis of membrane peptides released into the supernatant
Panel A:trypsin treatment; Panel B:pretreated by 100mM NaOH before trypsin treatment.1：KS-2；2：Cl;3:GPA;4:ks-4;5:ks-5
当用100 mmol/L NaOH预处理红细胞血影之后，在胰蛋白酶的作用下，带Ⅲ蛋白释放之上清中的多肽图谱发生了明显变化，多肽的释放增加(图3，PanelB)，对主要波峰进行氨基酸测序的结果见表1。
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表1 释放至上清中多肽的氨基酸序列
Table 1 Amino acid sequence of peptides released into supernatant
KS-2
C1
KS-4
KS-5
GPA*
Ser731
Ala893
Gly647
Gly361
, 百拇医药
Lys101
Val
Thr
Trp
Leu
Ser
Thr
Phe
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Asp
Pro
His
Asp
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Ile
Leu
Ser
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Glu
His
Asn
Asp
Asn
Glu
Pro
Gly
Val
, 百拇医药
Ala
Glu
Leu
Gly
Lys
Leu
Gly
Gly
Pro
Pro
Thr
Arg
Leu
, http://www.100md.com
Asp
Leu
Val
Asp
Arg656
Asp
↓
Met
Glu
Pro
↓
Gly
Tyr
, 百拇医药
Leu
Asp131
Lys743
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?
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Val
Ala
Met
Pro
Val911
* GPA：血型糖蛋白A 带Ⅲ蛋白是一种多次穿过红细胞膜的大分子量蛋白质，与一次性穿膜蛋白质不同，它有多个与脂质双分子层相互作用的位点，穿膜的C-结构域又是离子交换的活性部位，因此有关带Ⅲ蛋白C-结构域构造与功能的研究一直是这一领域的热点和难点，这些研究的目的之一就是明确哪些氨基酸在脂质分子层内，哪些为连接穿膜序列之间的多肽袢，以及与其他蛋白质相互作用的位点。但是在自然状态下，带Ⅲ蛋白C-结构域对胰蛋白酶具有抵抗性，无法对其进行深入研究。国内外这一领域的研究报告甚少，尚无确切结论。我们采用NaOH对红细胞膜进行预处理，目的使多肽袢部位的氨基酸序列暴露出膜表面，再用胰蛋白酶消化。结果表明，多肽袢释放量对NaOH呈浓度依赖性，当NaOH浓度在100 mmol/L时，多肽的释放量最多，用这种方法我们获得了带Ⅲ蛋白C-结构域的4个多肽链。同时还有血型糖蛋白A(GPA)的C末端。GPA为存在于红细胞膜上的一次性穿膜蛋白质其功能目前尚不十分清楚，这一结果为进一步研究带Ⅲ蛋白C-结构域的功能及其与其它蛋白质的相互作用具有重要意义，我们将对其进行深入研究探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 Fu Guohui, Jiang Xiaoshu.Study of the C-terminal properties of human erythrocyte membrane protein band 3(英文稿).哈尔滨医科大学学报，1998；32(1)∶8
2 傅国辉，姜晓姝，王孝铭.带Ⅲ蛋白C1肽链的纯化及其功能的研究.中国病理生理杂志，投稿中
3 Kang DK,Kenshi Okubo, Naotaka Hamasaki.Structural study of the membrane domain of band 3 by tryptic digestion. J Biol Chem, 1992;267∶19211
4 Hamasaki N,Kenshi Okubo. Band 3 protein physiology, function and structure. Cell Mol Biol, 1996；42(7)∶1025
(收稿：1998-07-12 修回：1998-11-06), 百拇医药