急性脑缺血白细胞与内皮细胞粘附性变化的实验研究*
作者：周华东 李志敏 李敬诚 陈曼娥
单位：周华东 李志敏 陈曼娥 (第三军医大学 大坪医院，重庆 400042)；李敬诚 (重庆大学 光机系，重庆 400041)
关键词：再灌注损伤；脑缺血；白细胞；内皮细胞；粘附力
生物医学工程学杂志990405 摘要 为探讨脑缺血再灌注损伤时局灶区白细胞的粘附性变化，通过免疫荧光标记技术和显微超高速摄录像系统观察脑缺血再灌注损伤局灶区白细胞的粘附性。结果显示脑缺血再灌注损伤局灶区微动脉白细胞附壁指数升高，白细胞与内皮细胞间断裂应力降低，粘附力显著增强。上述结果表明脑缺血再灌注损伤时内皮细胞和白细胞粘附性显著增强，白细胞在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。
An Experimental Study on the Change of Adhesion Between Leukocyte
, http://www.100md.com
and Endothelium in Acute Cerebral Ischemia
Zhou Huadong1 Li Zhimin1 Li Jingcheng2 Chen Mane1
1 (Department of Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
2 (Department of Light System, Chongqing University, Chongqing 400042)
Abstract The objective of this experiment was to investigate the change of leukocyte adhesion in the focus of cerebral ischemia-reperfusion injury. Immune fluorescent microscope equipped with image tube camera and high speed recording TV sets was used to study the leukocyte adhesion in the focus of cerebral ischemia-reperfusion injury. The result showed that the density index of adherent leukocyte was significantly elevated, the fracture stress between leukocyte and endothelium dropped, and the adhesion increased in the focus of cerebral ischmic-reperfusion injury. These findings indicated that leukocyte adhesion was increased significantly and leukocytes played an important role in the cerebral ischemia-reperfusion injury.
, 百拇医药
Key words Ischemia-reperfusion injury Cerebral ischemia Leukocyte Endothelium Adhesion
白细胞在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用[1]。已有研究证明，脑缺血再灌注损伤时局灶区粘附分子ICAM-1表达增强，由于ICAM-1可与它的配体，白细胞表面的Mac-1和LAF-1结合，所以ICAM-1表达增强可以使白细胞在局灶区大量的粘附、聚集，但是目前尚无直接的实验依据来证明。本项研究通过使用免疫荧光技术，超高速摄录像系统，观察脑缺血再灌注损伤局灶区白细胞的附壁数目和流速流态，计算粘附力的变化。
1 材料与方法
1.1 动物分组及准备
雄性Wistar大鼠24只，体重250～300 g，8只为对照组，16只为实验组。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(400mg/kg体重)，切开颈部，暴露一侧颈内动脉，用尼龙线阻塞大脑中动脉，2 h后放开，造成再灌注损伤。开颅窗暴露软脑膜微血管，在连接有照像和超高速摄像装置的显微镜下观察微动脉(直径30 mm，长100 mm)的循环状态。
, 百拇医药
1.2 白细胞与内皮细胞粘附力的观察
对照组和实验组再灌注后2 h，以吖啶橙荧光素溶于生理盐水中，浓度为10 mg/ml，用0.2 ml从股静脉注入动物体内，约3～5 min后，在荧光显微镜下可见到软脑膜微动脉内荧光阳性白细胞，用显微照像和超高速显微摄录像装置记录发光的白细胞60 s，在单位长度的动脉内检测通过动脉中央每个白细胞流速和此动脉中的附壁白细胞数量，并计算白细胞的附壁密度指数(DI)。DI=Nt/Mo,Nt为再灌注后每次记录的白细胞附壁数，Mo为脑缺血前记录的白细胞附壁数。
以1 000幅/秒的超高速摄下3 s微动脉的血流，再以3幅/s慢放，用血流测速仪测量红细胞的流速(VRBC)，结合荧光阳性的白细胞流速(VWBC)，计算白细胞与内皮细胞间的断裂应力F(F=VWBC/VRBC)。
, 百拇医药 2 结 果
2.1 脑缺血再灌注损伤软脑膜微动脉附壁白细胞密度指数的变化见图1。白细胞附壁密度指数实验组明显大于对照组(P均<0.01)，8～48 h附壁密度指数持续较高，24小时为最高。
图1 鼠软脑膜微动脉白细胞粘附密度指数的变化
Fig 1 Change of density index of adherent leukocyte in pia mater encephali arteriole of rats
* P<0.01,compared with control group
2.2 脑缺血再灌注损伤软脑膜微动脉白细胞和内皮细胞间断裂应力的变化见图2。白细胞与内皮细胞间断裂应力明显降低，与对照组比较有显著性差别(P<0.01)，8～24 h持续较低，12 h为最低。
, http://www.100md.com
图2 鼠软脑膜微动脉白细胞与内皮细胞间断裂应力的变化
Fig 2 Change of fracture stress between leukocyte and endothelial cell in pia mater encephali arteriole of rats
* P<0.01，compared with control group
3 讨 论
实验证明脑缺血再灌注损伤时白细胞起到了重要的作用。大量白细胞阻塞微血管造成无复流现象。白细胞穿越内皮细胞进入缺血局灶区，释放蛋白水解酶，释放自由基使组织损伤。白细胞在缺血再灌注时在局灶区微血管的聚集除血流动力学和血液流变学等原因外，近来发现与局灶区粘附分子表达增强密切相关。已经证明，脑缺血再灌注损伤时局灶区血管内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及ICAM-1 mRNA表达明显增强。用抗ICAM-1单抗与抗Mac-1(ICAM-1的配体)单抗可以使脑缺血再灌注损伤局灶区明显缩小[2，3]。临床研究也已经证明脑梗塞患者血清sICAM-1明显增加[4]，可见粘附分子在促进白细胞聚集于局灶区中起到了重要作用。
, http://www.100md.com
虽然白细胞与内皮细胞的粘附在脑缺血再灌注损伤中起重要作用，但是到目前为止，仍然没有理想的方法直观的探讨白细胞在局灶粘附性增加并聚集的变化和规律。有学者利用微管吸吮进行白细胞与内皮细胞粘附的离体实验[5]。本项研究利用先进的微循环观察手段，进行在体实验，证明脑缺血再灌注损伤后白细胞在微动脉内附壁数明显增加，破裂力显著下降，粘附性明显增强，为白细胞在脑缺血再灌注损伤中的作用提供了较为客观的依据。由于红细胞是血流中促使白细胞流动的重要因素，所以通过血管中白细胞流速与中心流动的红细胞速度变化的函数，判断白细胞与血管内皮细胞间的粘附力变化是比较客观、切实可行的[6，7]。
目前防治脑缺血再灌注损伤有多种方法，包括建立侧支循环、清除自由基、阻止钙超载等，但治疗效果仍然不够满意。如果能在早期积极、有效的进行抗白细胞在局灶区粘附、聚集治疗，这可能是一条治疗脑缺血再灌注损伤的有效途径。
* 国家自然科学基金资助项目(39670268)
, 百拇医药
参考文献
1 Kochane PM, Hasllenbeck JM. Polymorphonuclear leukocytes and monocytes/macrophages in the pathogensis of cerebral ischemia and stroke. Stroke, 1992; 23∶1367
2 Chopp M, Zhang Ruilan, Chen Hua et al. Postischemic administration of an anti-Mac-1 antibody reduces ischemic cell damage after transient middel cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1994; 25∶869
3 Chen Hua, Chopp M, Zhang Ruilan et al. Anti-CD11b monoclonal antibody reduces ischemic cell damage after transient focal cerebral ischemia in rat. Ann Neurol, 1994; 35∶458
, http://www.100md.com
4 Zhou Huandong, Chen Man'e, Yan Jianhua. Changes of soluble intercellular adhesion molecule-Ⅰ in the serum from patients with acute cerebral infarction. 1997; 12(4)∶328
5 周华东，琚亚非，陈曼娥.抗巨噬细胞活化趋化因子-1抗体对脑缺血-再灌注大鼠保护作用的实验研究.中国危重病急救医学，1998；10(4)∶204
6 Schmid-Schonbein GW, Skalak R, Simon SI et al. The interaction between leukocytes and endothelium in vivo. Ann NY Acad Sci, 1987; 516∶348
7 王兆铖，陈德春，何 杨等.白细胞——内皮细胞的体外粘附反应及眼镜蛇毒的影响.中国病理生理杂志，1991；7∶550
(收稿：1998-06-01 修回：1998-12-23), http://www.100md.com
单位：周华东 李志敏 陈曼娥 (第三军医大学 大坪医院，重庆 400042)；李敬诚 (重庆大学 光机系，重庆 400041)
关键词：再灌注损伤；脑缺血；白细胞；内皮细胞；粘附力
生物医学工程学杂志990405 摘要 为探讨脑缺血再灌注损伤时局灶区白细胞的粘附性变化，通过免疫荧光标记技术和显微超高速摄录像系统观察脑缺血再灌注损伤局灶区白细胞的粘附性。结果显示脑缺血再灌注损伤局灶区微动脉白细胞附壁指数升高，白细胞与内皮细胞间断裂应力降低，粘附力显著增强。上述结果表明脑缺血再灌注损伤时内皮细胞和白细胞粘附性显著增强，白细胞在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。
An Experimental Study on the Change of Adhesion Between Leukocyte
, http://www.100md.com
and Endothelium in Acute Cerebral Ischemia
Zhou Huadong1 Li Zhimin1 Li Jingcheng2 Chen Mane1
1 (Department of Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)
2 (Department of Light System, Chongqing University, Chongqing 400042)
Abstract The objective of this experiment was to investigate the change of leukocyte adhesion in the focus of cerebral ischemia-reperfusion injury. Immune fluorescent microscope equipped with image tube camera and high speed recording TV sets was used to study the leukocyte adhesion in the focus of cerebral ischemia-reperfusion injury. The result showed that the density index of adherent leukocyte was significantly elevated, the fracture stress between leukocyte and endothelium dropped, and the adhesion increased in the focus of cerebral ischmic-reperfusion injury. These findings indicated that leukocyte adhesion was increased significantly and leukocytes played an important role in the cerebral ischemia-reperfusion injury.
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Key words Ischemia-reperfusion injury Cerebral ischemia Leukocyte Endothelium Adhesion
白细胞在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用[1]。已有研究证明，脑缺血再灌注损伤时局灶区粘附分子ICAM-1表达增强，由于ICAM-1可与它的配体，白细胞表面的Mac-1和LAF-1结合，所以ICAM-1表达增强可以使白细胞在局灶区大量的粘附、聚集，但是目前尚无直接的实验依据来证明。本项研究通过使用免疫荧光技术，超高速摄录像系统，观察脑缺血再灌注损伤局灶区白细胞的附壁数目和流速流态，计算粘附力的变化。
1 材料与方法
1.1 动物分组及准备
雄性Wistar大鼠24只，体重250～300 g，8只为对照组，16只为实验组。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(400mg/kg体重)，切开颈部，暴露一侧颈内动脉，用尼龙线阻塞大脑中动脉，2 h后放开，造成再灌注损伤。开颅窗暴露软脑膜微血管，在连接有照像和超高速摄像装置的显微镜下观察微动脉(直径30 mm，长100 mm)的循环状态。
, 百拇医药
1.2 白细胞与内皮细胞粘附力的观察
对照组和实验组再灌注后2 h，以吖啶橙荧光素溶于生理盐水中，浓度为10 mg/ml，用0.2 ml从股静脉注入动物体内，约3～5 min后，在荧光显微镜下可见到软脑膜微动脉内荧光阳性白细胞，用显微照像和超高速显微摄录像装置记录发光的白细胞60 s，在单位长度的动脉内检测通过动脉中央每个白细胞流速和此动脉中的附壁白细胞数量，并计算白细胞的附壁密度指数(DI)。DI=Nt/Mo,Nt为再灌注后每次记录的白细胞附壁数，Mo为脑缺血前记录的白细胞附壁数。
以1 000幅/秒的超高速摄下3 s微动脉的血流，再以3幅/s慢放，用血流测速仪测量红细胞的流速(VRBC)，结合荧光阳性的白细胞流速(VWBC)，计算白细胞与内皮细胞间的断裂应力F(F=VWBC/VRBC)。
, 百拇医药 2 结 果
2.1 脑缺血再灌注损伤软脑膜微动脉附壁白细胞密度指数的变化见图1。白细胞附壁密度指数实验组明显大于对照组(P均<0.01)，8～48 h附壁密度指数持续较高，24小时为最高。
图1 鼠软脑膜微动脉白细胞粘附密度指数的变化
Fig 1 Change of density index of adherent leukocyte in pia mater encephali arteriole of rats
* P<0.01,compared with control group
2.2 脑缺血再灌注损伤软脑膜微动脉白细胞和内皮细胞间断裂应力的变化见图2。白细胞与内皮细胞间断裂应力明显降低，与对照组比较有显著性差别(P<0.01)，8～24 h持续较低，12 h为最低。
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图2 鼠软脑膜微动脉白细胞与内皮细胞间断裂应力的变化
Fig 2 Change of fracture stress between leukocyte and endothelial cell in pia mater encephali arteriole of rats
* P<0.01，compared with control group
3 讨 论
实验证明脑缺血再灌注损伤时白细胞起到了重要的作用。大量白细胞阻塞微血管造成无复流现象。白细胞穿越内皮细胞进入缺血局灶区，释放蛋白水解酶，释放自由基使组织损伤。白细胞在缺血再灌注时在局灶区微血管的聚集除血流动力学和血液流变学等原因外，近来发现与局灶区粘附分子表达增强密切相关。已经证明，脑缺血再灌注损伤时局灶区血管内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及ICAM-1 mRNA表达明显增强。用抗ICAM-1单抗与抗Mac-1(ICAM-1的配体)单抗可以使脑缺血再灌注损伤局灶区明显缩小[2，3]。临床研究也已经证明脑梗塞患者血清sICAM-1明显增加[4]，可见粘附分子在促进白细胞聚集于局灶区中起到了重要作用。
, http://www.100md.com
虽然白细胞与内皮细胞的粘附在脑缺血再灌注损伤中起重要作用，但是到目前为止，仍然没有理想的方法直观的探讨白细胞在局灶粘附性增加并聚集的变化和规律。有学者利用微管吸吮进行白细胞与内皮细胞粘附的离体实验[5]。本项研究利用先进的微循环观察手段，进行在体实验，证明脑缺血再灌注损伤后白细胞在微动脉内附壁数明显增加，破裂力显著下降，粘附性明显增强，为白细胞在脑缺血再灌注损伤中的作用提供了较为客观的依据。由于红细胞是血流中促使白细胞流动的重要因素，所以通过血管中白细胞流速与中心流动的红细胞速度变化的函数，判断白细胞与血管内皮细胞间的粘附力变化是比较客观、切实可行的[6，7]。
目前防治脑缺血再灌注损伤有多种方法，包括建立侧支循环、清除自由基、阻止钙超载等，但治疗效果仍然不够满意。如果能在早期积极、有效的进行抗白细胞在局灶区粘附、聚集治疗，这可能是一条治疗脑缺血再灌注损伤的有效途径。
* 国家自然科学基金资助项目(39670268)
, 百拇医药
参考文献
1 Kochane PM, Hasllenbeck JM. Polymorphonuclear leukocytes and monocytes/macrophages in the pathogensis of cerebral ischemia and stroke. Stroke, 1992; 23∶1367
2 Chopp M, Zhang Ruilan, Chen Hua et al. Postischemic administration of an anti-Mac-1 antibody reduces ischemic cell damage after transient middel cerebral artery occlusion in rats. Stroke, 1994; 25∶869
3 Chen Hua, Chopp M, Zhang Ruilan et al. Anti-CD11b monoclonal antibody reduces ischemic cell damage after transient focal cerebral ischemia in rat. Ann Neurol, 1994; 35∶458
, http://www.100md.com
4 Zhou Huandong, Chen Man'e, Yan Jianhua. Changes of soluble intercellular adhesion molecule-Ⅰ in the serum from patients with acute cerebral infarction. 1997; 12(4)∶328
5 周华东，琚亚非，陈曼娥.抗巨噬细胞活化趋化因子-1抗体对脑缺血-再灌注大鼠保护作用的实验研究.中国危重病急救医学，1998；10(4)∶204
6 Schmid-Schonbein GW, Skalak R, Simon SI et al. The interaction between leukocytes and endothelium in vivo. Ann NY Acad Sci, 1987; 516∶348
7 王兆铖，陈德春，何 杨等.白细胞——内皮细胞的体外粘附反应及眼镜蛇毒的影响.中国病理生理杂志，1991；7∶550
(收稿：1998-06-01 修回：1998-12-23), http://www.100md.com