选择素研究进展
作者：郑立新 周晓红 石应康 李幼平
单位：郑立新(华西医科大学 附属第一医院，成都 610041)；周晓红(华西医科大学 附属第一医院，成都 610041)；石应康(华西医科大学 附属第一医院，成都 610041)；李幼平(华西医科大学 附属第一医院，成都 610041)
关键词：选择素；分子结构；功能；基因改造
生物医学工程学杂志000127 摘 要：选择素是血管粘附分子大家族中的一大类成员，近年研究表明由于选择素可介导白细胞与血管壁接触，因此在感染性疾疾、器官移植免疫、肿瘤的发展、新生血管形成、缺血—再灌注损伤及自身免疫性疾病中起重要作用。本文就选择素的结构、功能、表达的调节及其基因的改造进行综述。
Progress of Study on Selectin
, http://www.100md.com
Zheng Lixin Zhou Xiaohong Shi Yingkang Li Youping
(First Affiliated Hospital of West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
Abstract：Selectin is a member of vascular adhesion molecular family.Selectin can mediate the interaction between endothelial cell and leucocyte,therefore,it is an important factor in infectious disease,transplantation immunity,development of tumor,vascularization,ischemia-reperfusion injury and autoimmune disease.In this report,selectin's molecular structure,function,expression,regulation and gene reformation were discussed.
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Key words：Selectin Moecular structure Function Gene transform▲
选择素(selectin)是血管粘附分子大家族中的一大类成员，根据表达部位可分为三类：E-selectin(ELAM-1,CD62E)表达于活化的内皮细胞(endothelial cell,EC)表面；L-selectin(LAM-1,Leu8,TQ1,CD62L)表达于白细胞表面；P-selectin(CD62P,GMP140,PADGEM protein)则表达于活化的血小板和EC表面[1].其主要作用为在感染及其它炎性反应过程中，通过与相应配体结合介导白细胞与管壁接触，使白细胞在血管壁上缓慢滚动，从而启动一系列反应，最终导致白细胞在炎性反应区域集中。
1 选择素的分子结构
Selectin为典型的Ⅰ型糖蛋白，分子量90～140Kda,由一系列蛋白区域片段所构成[2]。包括氨基末端C型凝集素(lectin)片段；一个表皮生长因子样(epidermal growth factor like,EGF-like)片段；2～9个较短共同重复序列(short concensus repeat,SCR),亦被称为补体调节/结合蛋白样重复序列(即CR，complement regulatory protein-like repeat or complement binding protein-like repeat该区域可位于胞浆内[3，4])区域；单一跨膜区域和一个胞浆内尾段(Fig1)。
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不同种系间同一selectin的C型凝集素区域、EGF样区域和SCR区域的同源性可分别达～72%，～60%，～40%；而同种系中不同selectin的同源性仅为～52%，～47%，～35%。lectin区域和EGF样区域高度保守性，提示其与配体结合方面有重要作用[5]。大鼠的P-selectin多肽分子胞外区域中有9个潜在的N-糖基结合位点，其中7个与人类位置相同，提示胞外多肽段及其糖基结构对于P-selectin功能致关重要[4]。相比之下，SCR区域同源性相对较低，而且SCR区域中SCR片段个数也有较大差异：L-selectin为2个，E-selectin和P-selectin中为4～9个不等。如人类P-selectin含有9个SCR，而大鼠和小鼠的SCR数为8个，缺乏与SCR2相对应者，这可能是由于SCR仅起结构骨架作用，促进lectin区域和EGF样区域与其配体的相互作用[4]。同种系不同selectin间跨膜区和胞浆区无同源性而不同种间同一selectin则有较高保守性(Figl)。以P-selectin基因为例，其cDNA序列胞浆段具有高度的种间保守性，这段基因编码的信号可使P-selectin进入分泌颗粒中。对比人类P-selectin氨基酸此区域序列，大鼠和小鼠者仅有四处不同：Phe737→Leu,Glu739→Lys,Phe765→Tyr及Ser768→Thr。P-selectin在细胞表面表达后将内化(internalize),这是由于一个胞内信号YGVF在所有的种系中保守的存在[6]。
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图1 选择素的结构及同源性[2]
Fig1 Structure and homologies of selectins[2]
人和小鼠的selectin基因位于1号染色体，以P/L/E的顺序紧密连锁于一段约300kb的区域。selectin基因的转录和翻译受调控结构调节，其外显子(exon)依次翻译出lectin区，EGF-like区，SCR，跨膜区和胞内段，各区域间分别隔以内含子(intron)。如猪的E-selectin基因序列含有12个外显子和11个内含子，在内含子4和6中存在2个假外显子(pseudoexon)。这些序列与人类E-selectin基因外显子序列相似，但它们并不出现于猪E-selectin cDNA中。与翻译起始部位相比，转录起始于-498位置，第一个ATG位于外显子2，翻译停止于外显子11而外显子12并不翻译[7]。
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2 选择素的功能
selectin的功能主要为：(1)介导白细胞与血管壁接触，并在其上滚动；(2)在器官移植免疫排斥中起重要作用；(3)促进肿瘤的发展；(4)在新生血管形成方面有一定作用；(5)在缺血—再灌注损伤中起一定作用；(6)在某些自身免疫性疾病中的作用。
2.1 在感染及其它炎性反应发生过程中的作用
在感染及其它炎性反应发生过程中，selectin通过与其相应配体结合介导白细胞(中性粒细胞、T和B淋巴细胞及单核细胞等)与血管壁(特别是毛细血管后静脉)接触，并使白细胞在血管壁上缓慢滚动，从而启动一系列反应，最终导致白细胞在炎性反应区域集中[8，9]。其中L-selectin持续表达于白细胞(中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞表面)，当白细胞活化后通过蛋白水解方式释放出来，其功能为介导淋巴细胞向周围淋巴结的归巢(specific homing)及多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)与感染组织EC的粘附；E-selectin表达于受刺激的EC表面，EC中无预存的E-selectin，当受刺激4～6小时后通过转录产生[3，9]。其功能为介导中性粒细胞和记忆T细胞与感染的EC之间的粘附；P-selectin除表达于受刺激的EC外还表达于活化的血小板，分别贮存于EC的Weibel-Palade小体和血小板的α颗粒中，受炎症介质刺激后数分钟内便可移至细胞表面。P-selectin的功能为介导EC和炎性细胞的粘附以及激活的血小板与单核细胞和中性粒细胞的粘附[1，3]。
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研究表明多种感染性疾病(如感染性肝病等)均出现明显的P和E-selectin表达上调。利用胚胎干细胞(embryonic stem cells)基因打靶(gene targeting)技术去除小鼠P-selectin后，导致一系列白细胞功能缺陷，包括循环中性粒细胞增加、在注入细菌内毒素脂多糖(LPS)后肠系膜静脉上缺乏白细胞滚动现象、中性粒细胞向腹膜趋化运动延迟。这些结果证明P-selectin在白细胞与血管壁相互作用及白细胞趋向感染区域的早期步骤具有重要作用[3]。去除了P和E-selectin两种基因的小鼠显示出非常易于感染，白细胞无法向感染区正常趋化，并显示骨髓和脾脏极度的白细胞增多，白细胞向脾脏迁移，细胞因子(cytokine)增加，白细胞自我稳态被破坏。说明P和E-selectin对白细胞功能的正常发挥必不可少[10]。
2.2 在器官移植免疫排斥中的作用
selectin在器官移植免疫排斥中起重要作用。Naka等通过给予P-selectin mAb和采用去除P-selectin基因的方法，证明其在小鼠肺同种肺移植中起重要作用，由于它介导的白细胞粘附，可造成移植物的失功。同种肺原位移植入去除P-selectin基因的Lewis大鼠后，移植排斥明量减轻，白细胞在移植物中的浸润较对照组明显减少，移植后大鼠血氧饱和度较对照组提高明显。采用移植前预先注入P-selectin mAb的方法也取得了类似结果。说明去除P-selectin可对移植物起到保护作用[11]。
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2.3 对肿瘤的作用
selectin可能促进肿瘤的发展。有假说认为selectin在肿瘤的转移过程中可能起很重要的作用，原因是发现很多肿瘤细胞表面都有高水平的selectin配体(如sialyl LewisX,sialyl LewisA及相关的糖基结构)表达，并认为它帮助移行的肿瘤细胞粘附于EC[12，13]。Iwamura等首次报道于胰腺癌肿瘤细胞(SUIT-2)发现有P-selectin的表达，且当采用血栓素、氧自由基或胰蛋白酶处理后，表达可增强[1]。可能由于selectin或其配体的介导，促进了肿瘤细胞的种植播散。另外，细胞因子IFN-或TNF-α可使培养的EC表达CD40持续上调，而CD40与配体结合后可使EC表达粘附分子从而促进白细胞的粘附，启动血管的感染反应。恶性肿瘤如肾细胞癌中癌细胞可诱导EC表达CD40，由于上述机制，在癌组织血管形成及免疫方面可能有一定作用[14]。
, http://www.100md.com 2.4 在新生血管形成方面的作用
研究表明人E-selectin可促使人EC形成管状结构，也可刺激大鼠角膜血管形成[15]。说明selectin在新生血管形成方面有一定作用。但Labow等[16]研究发现纯合无E-selectin基因(E-/-)小鼠可健康成活，并无血管形成障碍，器官结构及成体微血管网均无异常。Gerritsen等[17]利用纯合E-/-小鼠肺部EC进行体外实验，发现缺乏E-selectin并不影响血管三维结构的形成。看来selectin对于血管形成的作用尚需作进一步的研究。
2.5 在缺血—再潜注损伤中的作用
Selectin介导的PMN与EC的相互作用在心肌和脑组织的缺血—再灌注损伤中起重要作用[11]。由于缺血—再灌注时大量氧自由基的产生，可直接刺激EC中Weibel-Palade小体的出胞(exocytosis)，从而导致P-selectin在再灌注后10～20分别内大量表达于细胞表面，加之L-selectin从白细胞释放(再灌注后20分钟)和E-selectin的激活(再灌注后4.5小时)，共同介导PMN浸润，引起血管EC功能紊乱和组织损伤。
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3 选择素的表达及其调节
3.1 L-selectin的表达
L-selectin表达于多种白细胞，包括所有的中性粒细胞和单核细胞、血液和骨髓中的大部分T，B淋巴细胞及一部分自然杀伤细胞(NK)，但至少有一部分记忆淋巴细胞并不表达L-selectin[2]。对于T淋巴细胞，其表达强度随淋巴细胞的成熟而逐渐减弱，即新生未成熟淋巴细胞和未成熟造血细胞表达较强，随其成熟逐渐减弱，待其移至二级淋巴器官(secondary lymphoid organs，如脾脏和周围淋巴结)时，已几乎无表达；而对于B淋巴细胞表达相对较晚，待其进行了Ig基因重排(rearrangement)后，L-selectin表达于免疫适合的，刚移出骨髓的，即将成熟的B淋巴细胞。这些说明L-selectin对于白细胞功能正常发挥及其归巢具有重要意义。
3.2 E-selectin的表达及其调节
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E-selectin主要表达于活化的EC表面，也有研究指出肝脏感染性疾病时内毒素可致肝脏Kupffercell也表达E-selectin[8]。正常EC表面并无E-selectin表达，胞浆中也无储备，当其受刺激(LPS、TNF-α、IL-1β等)[2，3，8，9]活化后通过胞内一系列信息传递使E-selectin基因激活，转录、翻译，从而使EC表面表达E-selectin(Tab1)。
核因子kB(nuclear factorkB,NF-kB)是许多细胞因子诱生的免疫和感染反应基因表达的调控者。E-selectin基因启动子近侧含有三个NF-kB家族结合位点：(NF-kBⅠⅡⅢ)，NF-kB平时以一种无活性复合体即与IkB结合的形式存在于胞浆中，细胞因子等可导致IkB与NF-kB分离，NF-kB于是进入胞核并与E-selectin基因启动子结合，使E-selectin基因开始转录[18,19,20]。大鼠实验证实在内毒素作用下，肝脏内所有细胞(包括EC、Kupffer细胞和肝实质细胞(较弱)均出现NF-kB的移位激活——即从胞浆内移入细胞核内，通过电泳可检测到其片段(subunits):p50(NF-B1)、p65(RelA)和c-Rel,但没有p52(NF-kB2)。内毒素注入1小时后，Northern杂交检测到E-selectin基因转录出现在EC和Kupffer细胞，而肝细胞则无。这一结果支持NF-kB对E-selectin基因转录起重要作用的假说，但肝实质细胞虽有NF-kB的激活却无E-selectin基因转录的事实说明，在体内E-selectin基因的转录表达不止受NF-kB激活一种因素调节[21]。Chen等[22]的研究认为E-selectin仅表达于EC等少数细胞而非其它细胞的原因是其它细胞(如人类主动脉平滑肌细胞，HASMCs)存在一种蛋白合成机制，可合成某种蛋白防止E-selectin基因转录。蛋白合成抑制剂放线菌酮(亚胺环己酮，cycloheximide)可抑制蛋白合成，当被预先注入后，于HASMCs同样可出现E-selectin基因的转录和释译。
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表1 选择素P和E的表达与调节[2，3，8，9]
Table 1 Expression and regulation of E-and P-selctin[2,3,8,9]
P-selectin
E-selectin
表达部位
EC、血小板
EC
平时储存情况
贮存于EC内Weibel-Palade小体中和血小板的α颗粒中
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正常无刺激时
无表达或持续低表达
无表达
刺激因素
LPS、组胺、血栓素、过氧化物、蛋白激酶C、补体系统、ADP、TNF-α、IL-lβ、calcium ionophoreA23187等
LPS、TNF-α、IL-1β等
刺激因素调节水平
释放表达和转录翻译水平
转录释译水平
抑制表达因素
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组胺拮抗剂(H1类)盐酸苯海拉明
放线菌素、cycloheximide、TGF-β
表达最强部位
肺部、心脏、肠系膜和胃部
肺部和小肠
表达上调开始时间
刺激后5分钟
刺激后1～2小时
表达高峰时间
4～8小时
3～6小时
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表达结束机制
表达蛋白进入溶酶体降解或重新回到Weibel-Palade小体和α颗粒中
基因转录突然下调停止、表达蛋白进入溶酶体降解
CRE/AIF家庭(cAMP-responsive element/activating transcription factor)是E-selectin基因激活的另一调控者，E-selectin基因存在CRE/ATF-like结合位点，DNA与ATFs的结合可能是E-selectin基因激活的组成部分[23]。这说明许多转录因子及其同源DNA与E-selectin基因启动子的结合对其激活起重要作用。
对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的研究表明NF-kB与E-selectin基因启动子-94/-85区域结合后，还要求NF-kB复合物结合于-126和-116区域，而且E-selectin基因启动子的激活还有赖于ATF家庭转录因子与NF-ELAM-1位置(-157区域)结合及其它蛋白与NF-ELAM-2位置(-104区域)结合。E-selectin基因的组织特异性与近端启动子的CpG甲基化有关[20]。
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HMG-I(Y)是非组染色体蛋白(non-histone chromosomal proteins)高移动性蛋白(high mobility group proteins)家庭 的一员。它可与双链DNA中NF-kB三个结合位点中间(NF-kBⅡ)的富含A/T区域的小沟槽部位(the minor groove of A/T-rich regions)结合从而使NF-kB和ATF与启动区域结合[20]。许多化合物(如distamycin,berenil,bisbenzamidine及netropsin)可与HMG-I(Y)竞争结合于富含A/T区域的较小沟槽部位，而distamycin竞争的结果为使IL-1β或TNF-α诱导产生的E-selectin表达时间延长，说明E-selectin基因启动子中NF-kBⅡ(即NF-kB-HMG-I(Y)结合区)可下调基因表达，这可能通过DNA的弯曲(DNA-bending)实现[20]。
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此外，Noble等[24]将EC与单核细胞共同培养，发现单核细胞的存在可延长E-selectin的表达；TNFmAb可抑制这一反应；培养18小时的单核细胞上清液及高浓度TNF不能使EC表达E-selectin；单核细胞与EC混合培养产生的E-selectin表达可被CD11bmAb所抑制，但不能被VLA-4或L-selectin mAb抑制，说明EC与单核细胞具有相互作用，在此过程中细胞外基质分子(如产生的可溶性胶原Ⅰ)可能起一定作用。
由此可见，E-selectin表达的调控是多因素、多环节的，还有许多细节尚不清楚，要获得完整的调控机制还需大量研究。
3.3 P-selectin的表达及其调节
P-selectin主要表达于活化的EC和血小板表面，也有研究指出肝脏感染性疾病时内毒素可致肝脏Kupffer cell也表达P-selectin[8]。P-selectin贮存于EC中的Weibel-Palade小体和血小板的α颗粒中，正常EC和血小板表面无P-selectin表达或呈持续低表达状态，当细胞受刺激(LPS、组胺、血栓素、过氧化物、蛋白激酶C、补体系统、ADP、TNF-α、ILl-β、calcium ionophore A23187等)[2，3，8，9]活化后分泌到细胞表面，其中LPS、TNF-α和IL-lβ也能导致P-selectin基因激活，从转录水平使细胞表面表达P-selectin(Tab1)。这可能是通过类似于E-selectin基因激活的方式实现的[26，27]。此过程发生于受到刺激2～4小时后，正是由于P-selectin具有两种表达方式，使它在细胞受刺激后既较早出现又较持久。
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通过分泌方式使P-selectin由Weibel-Palade小体或α颗粒移向细胞表面的过程尚未发现有复杂的机制进行调控[6]，而表达在细胞表面P-selectin的内化进入溶酶体的过程显得较为重要。此过程通过P-selectin胞浆内尾段与溶酶体相互识别介导P-selectin内移进入溶酶体降解[25]。少数缺乏跨膜段和胞浆内尾段(或该段已降解)的P-selectin则回到Weibel-Palade小体或α颗粒中。
4 选择素基因改造及其对功能的影响
Gerritsen和Milstone等[17]采用小鼠胚胎干细胞和母细胞介导的转基因形成重组的纯合胚胎细胞方法—通过无意义突变，将E-selectin基因的第一和第二个内含子之间插入一段无关序列，破坏翻译的启动子(领头肽，leader peptide,凝集素区域的5′端)，并保证可能产生的异常肽段均无功能。将此细胞移入正常C57BL/6J小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)产生子1代(E+/1)，子1代个体互相交配，再从子2代中筛选E+/+和E-/-纯合子。成熟的纯合E-/-鼠不产生E-selectin mRNA,也不表达此蛋白；而P-selectin、L-selectin及VCAM-1表达正常。他们利用纯合E-/-小鼠肺部EC进行体外实验，发现E-selectin对于血管三维结构的形成并无重要意义。Labow等研究[16]也证实E-/-小鼠可健康成活，并无血管形成障碍，器官结构及成体微血管网均无异常。
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采用类似方法，Mayadas等去除了小鼠P-selectin基因[3]；Frenette去除了P和E-selectin两种基因[10]。通过感染免疫方面的观察，有力地证明了P和E-selectin对白细胞功能的正常发挥必不可少(详见前述)。Naka等通过去除大鼠P-selectin基因的方法，展现了此技术在器官移植方面应用的广阔前景[11]。
此外，Condn等[28]将一段20-base反义寡核苷酸序列(antisense oligo-deoxynucleotide,ASO)ISIS4730引入HUVEC，因ISIS4730被设计为与人E-selectin基因的3′非翻译段(3′-untranslated region,3′-UTR)互补，且以一硫原子代替磷酸基上的氧原子，因此可在血清中保持长期稳定，从而阻止E-selectin基因的转录和翻译，经此处理后，HUVEC仅转录出一段3300bases的mRNA，而非3785bases的E-selectin mRNA(以Northern杂交检测)。这种封闭基因的方法具有应用价值。
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5 总结与展望
随着人们对选择素结构、功能及表达认识的不断深入，选择素在诸多领域(感染性疾病、肿瘤性疾病、移植免疫及自身免疫等)的重要作用逐步被揭示出来。由于选择素基因改造技术的运用，使人们对它更为了解。但目前仅对小动物选择素基因进行了改造，如能在大动物实现，将对器官移植免疫等方面的研究产生重要作用。
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收稿日期：1998-08-31, 百拇医药
单位：郑立新(华西医科大学 附属第一医院，成都 610041)；周晓红(华西医科大学 附属第一医院，成都 610041)；石应康(华西医科大学 附属第一医院，成都 610041)；李幼平(华西医科大学 附属第一医院，成都 610041)
关键词：选择素；分子结构；功能；基因改造
生物医学工程学杂志000127 摘 要：选择素是血管粘附分子大家族中的一大类成员，近年研究表明由于选择素可介导白细胞与血管壁接触，因此在感染性疾疾、器官移植免疫、肿瘤的发展、新生血管形成、缺血—再灌注损伤及自身免疫性疾病中起重要作用。本文就选择素的结构、功能、表达的调节及其基因的改造进行综述。
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选择素(selectin)是血管粘附分子大家族中的一大类成员，根据表达部位可分为三类：E-selectin(ELAM-1,CD62E)表达于活化的内皮细胞(endothelial cell,EC)表面；L-selectin(LAM-1,Leu8,TQ1,CD62L)表达于白细胞表面；P-selectin(CD62P,GMP140,PADGEM protein)则表达于活化的血小板和EC表面[1].其主要作用为在感染及其它炎性反应过程中，通过与相应配体结合介导白细胞与管壁接触，使白细胞在血管壁上缓慢滚动，从而启动一系列反应，最终导致白细胞在炎性反应区域集中。
1 选择素的分子结构
Selectin为典型的Ⅰ型糖蛋白，分子量90～140Kda,由一系列蛋白区域片段所构成[2]。包括氨基末端C型凝集素(lectin)片段；一个表皮生长因子样(epidermal growth factor like,EGF-like)片段；2～9个较短共同重复序列(short concensus repeat,SCR),亦被称为补体调节/结合蛋白样重复序列(即CR，complement regulatory protein-like repeat or complement binding protein-like repeat该区域可位于胞浆内[3，4])区域；单一跨膜区域和一个胞浆内尾段(Fig1)。
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不同种系间同一selectin的C型凝集素区域、EGF样区域和SCR区域的同源性可分别达～72%，～60%，～40%；而同种系中不同selectin的同源性仅为～52%，～47%，～35%。lectin区域和EGF样区域高度保守性，提示其与配体结合方面有重要作用[5]。大鼠的P-selectin多肽分子胞外区域中有9个潜在的N-糖基结合位点，其中7个与人类位置相同，提示胞外多肽段及其糖基结构对于P-selectin功能致关重要[4]。相比之下，SCR区域同源性相对较低，而且SCR区域中SCR片段个数也有较大差异：L-selectin为2个，E-selectin和P-selectin中为4～9个不等。如人类P-selectin含有9个SCR，而大鼠和小鼠的SCR数为8个，缺乏与SCR2相对应者，这可能是由于SCR仅起结构骨架作用，促进lectin区域和EGF样区域与其配体的相互作用[4]。同种系不同selectin间跨膜区和胞浆区无同源性而不同种间同一selectin则有较高保守性(Figl)。以P-selectin基因为例，其cDNA序列胞浆段具有高度的种间保守性，这段基因编码的信号可使P-selectin进入分泌颗粒中。对比人类P-selectin氨基酸此区域序列，大鼠和小鼠者仅有四处不同：Phe737→Leu,Glu739→Lys,Phe765→Tyr及Ser768→Thr。P-selectin在细胞表面表达后将内化(internalize),这是由于一个胞内信号YGVF在所有的种系中保守的存在[6]。
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图1 选择素的结构及同源性[2]
Fig1 Structure and homologies of selectins[2]
人和小鼠的selectin基因位于1号染色体，以P/L/E的顺序紧密连锁于一段约300kb的区域。selectin基因的转录和翻译受调控结构调节，其外显子(exon)依次翻译出lectin区，EGF-like区，SCR，跨膜区和胞内段，各区域间分别隔以内含子(intron)。如猪的E-selectin基因序列含有12个外显子和11个内含子，在内含子4和6中存在2个假外显子(pseudoexon)。这些序列与人类E-selectin基因外显子序列相似，但它们并不出现于猪E-selectin cDNA中。与翻译起始部位相比，转录起始于-498位置，第一个ATG位于外显子2，翻译停止于外显子11而外显子12并不翻译[7]。
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2 选择素的功能
selectin的功能主要为：(1)介导白细胞与血管壁接触，并在其上滚动；(2)在器官移植免疫排斥中起重要作用；(3)促进肿瘤的发展；(4)在新生血管形成方面有一定作用；(5)在缺血—再灌注损伤中起一定作用；(6)在某些自身免疫性疾病中的作用。
2.1 在感染及其它炎性反应发生过程中的作用
在感染及其它炎性反应发生过程中，selectin通过与其相应配体结合介导白细胞(中性粒细胞、T和B淋巴细胞及单核细胞等)与血管壁(特别是毛细血管后静脉)接触，并使白细胞在血管壁上缓慢滚动，从而启动一系列反应，最终导致白细胞在炎性反应区域集中[8，9]。其中L-selectin持续表达于白细胞(中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞表面)，当白细胞活化后通过蛋白水解方式释放出来，其功能为介导淋巴细胞向周围淋巴结的归巢(specific homing)及多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)与感染组织EC的粘附；E-selectin表达于受刺激的EC表面，EC中无预存的E-selectin，当受刺激4～6小时后通过转录产生[3，9]。其功能为介导中性粒细胞和记忆T细胞与感染的EC之间的粘附；P-selectin除表达于受刺激的EC外还表达于活化的血小板，分别贮存于EC的Weibel-Palade小体和血小板的α颗粒中，受炎症介质刺激后数分钟内便可移至细胞表面。P-selectin的功能为介导EC和炎性细胞的粘附以及激活的血小板与单核细胞和中性粒细胞的粘附[1，3]。
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研究表明多种感染性疾病(如感染性肝病等)均出现明显的P和E-selectin表达上调。利用胚胎干细胞(embryonic stem cells)基因打靶(gene targeting)技术去除小鼠P-selectin后，导致一系列白细胞功能缺陷，包括循环中性粒细胞增加、在注入细菌内毒素脂多糖(LPS)后肠系膜静脉上缺乏白细胞滚动现象、中性粒细胞向腹膜趋化运动延迟。这些结果证明P-selectin在白细胞与血管壁相互作用及白细胞趋向感染区域的早期步骤具有重要作用[3]。去除了P和E-selectin两种基因的小鼠显示出非常易于感染，白细胞无法向感染区正常趋化，并显示骨髓和脾脏极度的白细胞增多，白细胞向脾脏迁移，细胞因子(cytokine)增加，白细胞自我稳态被破坏。说明P和E-selectin对白细胞功能的正常发挥必不可少[10]。
2.2 在器官移植免疫排斥中的作用
selectin在器官移植免疫排斥中起重要作用。Naka等通过给予P-selectin mAb和采用去除P-selectin基因的方法，证明其在小鼠肺同种肺移植中起重要作用，由于它介导的白细胞粘附，可造成移植物的失功。同种肺原位移植入去除P-selectin基因的Lewis大鼠后，移植排斥明量减轻，白细胞在移植物中的浸润较对照组明显减少，移植后大鼠血氧饱和度较对照组提高明显。采用移植前预先注入P-selectin mAb的方法也取得了类似结果。说明去除P-selectin可对移植物起到保护作用[11]。
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2.3 对肿瘤的作用
selectin可能促进肿瘤的发展。有假说认为selectin在肿瘤的转移过程中可能起很重要的作用，原因是发现很多肿瘤细胞表面都有高水平的selectin配体(如sialyl LewisX,sialyl LewisA及相关的糖基结构)表达，并认为它帮助移行的肿瘤细胞粘附于EC[12，13]。Iwamura等首次报道于胰腺癌肿瘤细胞(SUIT-2)发现有P-selectin的表达，且当采用血栓素、氧自由基或胰蛋白酶处理后，表达可增强[1]。可能由于selectin或其配体的介导，促进了肿瘤细胞的种植播散。另外，细胞因子IFN-或TNF-α可使培养的EC表达CD40持续上调，而CD40与配体结合后可使EC表达粘附分子从而促进白细胞的粘附，启动血管的感染反应。恶性肿瘤如肾细胞癌中癌细胞可诱导EC表达CD40，由于上述机制，在癌组织血管形成及免疫方面可能有一定作用[14]。
, http://www.100md.com 2.4 在新生血管形成方面的作用
研究表明人E-selectin可促使人EC形成管状结构，也可刺激大鼠角膜血管形成[15]。说明selectin在新生血管形成方面有一定作用。但Labow等[16]研究发现纯合无E-selectin基因(E-/-)小鼠可健康成活，并无血管形成障碍，器官结构及成体微血管网均无异常。Gerritsen等[17]利用纯合E-/-小鼠肺部EC进行体外实验，发现缺乏E-selectin并不影响血管三维结构的形成。看来selectin对于血管形成的作用尚需作进一步的研究。
2.5 在缺血—再潜注损伤中的作用
Selectin介导的PMN与EC的相互作用在心肌和脑组织的缺血—再灌注损伤中起重要作用[11]。由于缺血—再灌注时大量氧自由基的产生，可直接刺激EC中Weibel-Palade小体的出胞(exocytosis)，从而导致P-selectin在再灌注后10～20分别内大量表达于细胞表面，加之L-selectin从白细胞释放(再灌注后20分钟)和E-selectin的激活(再灌注后4.5小时)，共同介导PMN浸润，引起血管EC功能紊乱和组织损伤。
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3 选择素的表达及其调节
3.1 L-selectin的表达
L-selectin表达于多种白细胞，包括所有的中性粒细胞和单核细胞、血液和骨髓中的大部分T，B淋巴细胞及一部分自然杀伤细胞(NK)，但至少有一部分记忆淋巴细胞并不表达L-selectin[2]。对于T淋巴细胞，其表达强度随淋巴细胞的成熟而逐渐减弱，即新生未成熟淋巴细胞和未成熟造血细胞表达较强，随其成熟逐渐减弱，待其移至二级淋巴器官(secondary lymphoid organs，如脾脏和周围淋巴结)时，已几乎无表达；而对于B淋巴细胞表达相对较晚，待其进行了Ig基因重排(rearrangement)后，L-selectin表达于免疫适合的，刚移出骨髓的，即将成熟的B淋巴细胞。这些说明L-selectin对于白细胞功能正常发挥及其归巢具有重要意义。
3.2 E-selectin的表达及其调节
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E-selectin主要表达于活化的EC表面，也有研究指出肝脏感染性疾病时内毒素可致肝脏Kupffercell也表达E-selectin[8]。正常EC表面并无E-selectin表达，胞浆中也无储备，当其受刺激(LPS、TNF-α、IL-1β等)[2，3，8，9]活化后通过胞内一系列信息传递使E-selectin基因激活，转录、翻译，从而使EC表面表达E-selectin(Tab1)。
核因子kB(nuclear factorkB,NF-kB)是许多细胞因子诱生的免疫和感染反应基因表达的调控者。E-selectin基因启动子近侧含有三个NF-kB家族结合位点：(NF-kBⅠⅡⅢ)，NF-kB平时以一种无活性复合体即与IkB结合的形式存在于胞浆中，细胞因子等可导致IkB与NF-kB分离，NF-kB于是进入胞核并与E-selectin基因启动子结合，使E-selectin基因开始转录[18,19,20]。大鼠实验证实在内毒素作用下，肝脏内所有细胞(包括EC、Kupffer细胞和肝实质细胞(较弱)均出现NF-kB的移位激活——即从胞浆内移入细胞核内，通过电泳可检测到其片段(subunits):p50(NF-B1)、p65(RelA)和c-Rel,但没有p52(NF-kB2)。内毒素注入1小时后，Northern杂交检测到E-selectin基因转录出现在EC和Kupffer细胞，而肝细胞则无。这一结果支持NF-kB对E-selectin基因转录起重要作用的假说，但肝实质细胞虽有NF-kB的激活却无E-selectin基因转录的事实说明，在体内E-selectin基因的转录表达不止受NF-kB激活一种因素调节[21]。Chen等[22]的研究认为E-selectin仅表达于EC等少数细胞而非其它细胞的原因是其它细胞(如人类主动脉平滑肌细胞，HASMCs)存在一种蛋白合成机制，可合成某种蛋白防止E-selectin基因转录。蛋白合成抑制剂放线菌酮(亚胺环己酮，cycloheximide)可抑制蛋白合成，当被预先注入后，于HASMCs同样可出现E-selectin基因的转录和释译。
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表1 选择素P和E的表达与调节[2，3，8，9]
Table 1 Expression and regulation of E-and P-selctin[2,3,8,9]
P-selectin
E-selectin
表达部位
EC、血小板
EC
平时储存情况
贮存于EC内Weibel-Palade小体中和血小板的α颗粒中
, 百拇医药 无储备
正常无刺激时
无表达或持续低表达
无表达
刺激因素
LPS、组胺、血栓素、过氧化物、蛋白激酶C、补体系统、ADP、TNF-α、IL-lβ、calcium ionophoreA23187等
LPS、TNF-α、IL-1β等
刺激因素调节水平
释放表达和转录翻译水平
转录释译水平
抑制表达因素
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组胺拮抗剂(H1类)盐酸苯海拉明
放线菌素、cycloheximide、TGF-β
表达最强部位
肺部、心脏、肠系膜和胃部
肺部和小肠
表达上调开始时间
刺激后5分钟
刺激后1～2小时
表达高峰时间
4～8小时
3～6小时
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表达结束机制
表达蛋白进入溶酶体降解或重新回到Weibel-Palade小体和α颗粒中
基因转录突然下调停止、表达蛋白进入溶酶体降解
CRE/AIF家庭(cAMP-responsive element/activating transcription factor)是E-selectin基因激活的另一调控者，E-selectin基因存在CRE/ATF-like结合位点，DNA与ATFs的结合可能是E-selectin基因激活的组成部分[23]。这说明许多转录因子及其同源DNA与E-selectin基因启动子的结合对其激活起重要作用。
对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)的研究表明NF-kB与E-selectin基因启动子-94/-85区域结合后，还要求NF-kB复合物结合于-126和-116区域，而且E-selectin基因启动子的激活还有赖于ATF家庭转录因子与NF-ELAM-1位置(-157区域)结合及其它蛋白与NF-ELAM-2位置(-104区域)结合。E-selectin基因的组织特异性与近端启动子的CpG甲基化有关[20]。
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HMG-I(Y)是非组染色体蛋白(non-histone chromosomal proteins)高移动性蛋白(high mobility group proteins)家庭 的一员。它可与双链DNA中NF-kB三个结合位点中间(NF-kBⅡ)的富含A/T区域的小沟槽部位(the minor groove of A/T-rich regions)结合从而使NF-kB和ATF与启动区域结合[20]。许多化合物(如distamycin,berenil,bisbenzamidine及netropsin)可与HMG-I(Y)竞争结合于富含A/T区域的较小沟槽部位，而distamycin竞争的结果为使IL-1β或TNF-α诱导产生的E-selectin表达时间延长，说明E-selectin基因启动子中NF-kBⅡ(即NF-kB-HMG-I(Y)结合区)可下调基因表达，这可能通过DNA的弯曲(DNA-bending)实现[20]。
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此外，Noble等[24]将EC与单核细胞共同培养，发现单核细胞的存在可延长E-selectin的表达；TNFmAb可抑制这一反应；培养18小时的单核细胞上清液及高浓度TNF不能使EC表达E-selectin；单核细胞与EC混合培养产生的E-selectin表达可被CD11bmAb所抑制，但不能被VLA-4或L-selectin mAb抑制，说明EC与单核细胞具有相互作用，在此过程中细胞外基质分子(如产生的可溶性胶原Ⅰ)可能起一定作用。
由此可见，E-selectin表达的调控是多因素、多环节的，还有许多细节尚不清楚，要获得完整的调控机制还需大量研究。
3.3 P-selectin的表达及其调节
P-selectin主要表达于活化的EC和血小板表面，也有研究指出肝脏感染性疾病时内毒素可致肝脏Kupffer cell也表达P-selectin[8]。P-selectin贮存于EC中的Weibel-Palade小体和血小板的α颗粒中，正常EC和血小板表面无P-selectin表达或呈持续低表达状态，当细胞受刺激(LPS、组胺、血栓素、过氧化物、蛋白激酶C、补体系统、ADP、TNF-α、ILl-β、calcium ionophore A23187等)[2，3，8，9]活化后分泌到细胞表面，其中LPS、TNF-α和IL-lβ也能导致P-selectin基因激活，从转录水平使细胞表面表达P-selectin(Tab1)。这可能是通过类似于E-selectin基因激活的方式实现的[26，27]。此过程发生于受到刺激2～4小时后，正是由于P-selectin具有两种表达方式，使它在细胞受刺激后既较早出现又较持久。
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通过分泌方式使P-selectin由Weibel-Palade小体或α颗粒移向细胞表面的过程尚未发现有复杂的机制进行调控[6]，而表达在细胞表面P-selectin的内化进入溶酶体的过程显得较为重要。此过程通过P-selectin胞浆内尾段与溶酶体相互识别介导P-selectin内移进入溶酶体降解[25]。少数缺乏跨膜段和胞浆内尾段(或该段已降解)的P-selectin则回到Weibel-Palade小体或α颗粒中。
4 选择素基因改造及其对功能的影响
Gerritsen和Milstone等[17]采用小鼠胚胎干细胞和母细胞介导的转基因形成重组的纯合胚胎细胞方法—通过无意义突变，将E-selectin基因的第一和第二个内含子之间插入一段无关序列，破坏翻译的启动子(领头肽，leader peptide,凝集素区域的5′端)，并保证可能产生的异常肽段均无功能。将此细胞移入正常C57BL/6J小鼠(Jackson Labs,Bar Harbor,Maine)产生子1代(E+/1)，子1代个体互相交配，再从子2代中筛选E+/+和E-/-纯合子。成熟的纯合E-/-鼠不产生E-selectin mRNA,也不表达此蛋白；而P-selectin、L-selectin及VCAM-1表达正常。他们利用纯合E-/-小鼠肺部EC进行体外实验，发现E-selectin对于血管三维结构的形成并无重要意义。Labow等研究[16]也证实E-/-小鼠可健康成活，并无血管形成障碍，器官结构及成体微血管网均无异常。
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采用类似方法，Mayadas等去除了小鼠P-selectin基因[3]；Frenette去除了P和E-selectin两种基因[10]。通过感染免疫方面的观察，有力地证明了P和E-selectin对白细胞功能的正常发挥必不可少(详见前述)。Naka等通过去除大鼠P-selectin基因的方法，展现了此技术在器官移植方面应用的广阔前景[11]。
此外，Condn等[28]将一段20-base反义寡核苷酸序列(antisense oligo-deoxynucleotide,ASO)ISIS4730引入HUVEC，因ISIS4730被设计为与人E-selectin基因的3′非翻译段(3′-untranslated region,3′-UTR)互补，且以一硫原子代替磷酸基上的氧原子，因此可在血清中保持长期稳定，从而阻止E-selectin基因的转录和翻译，经此处理后，HUVEC仅转录出一段3300bases的mRNA，而非3785bases的E-selectin mRNA(以Northern杂交检测)。这种封闭基因的方法具有应用价值。
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5 总结与展望
随着人们对选择素结构、功能及表达认识的不断深入，选择素在诸多领域(感染性疾病、肿瘤性疾病、移植免疫及自身免疫等)的重要作用逐步被揭示出来。由于选择素基因改造技术的运用，使人们对它更为了解。但目前仅对小动物选择素基因进行了改造，如能在大动物实现，将对器官移植免疫等方面的研究产生重要作用。
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收稿日期：1998-08-31, 百拇医药