聚-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺组织相容性的初步观察
作者：翁立红 汤谷平 周俊 王斌 周涛 陈启琪
单位：翁立红(浙江大学 医学院 组胚教研室，杭州 310006)；周俊(浙江大学 医学院 组胚教研室，杭州 310006)；汤谷平(浙江大学 药学院，杭州 310006)；王斌(浙江大学 药学院，杭州 310006)；陈启琪(浙江大学 药学院，杭州 310006)；周涛(宁波大学 食工系，宁波 315211)
关键词：聚-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺；PHPA；生物相容性；埋植
生物医学工程学杂志000106 摘 要：药物控释高分子材料要求有良好的生物相容性。我们对聚-(3-羟丙基)-DL-天冬酶胺(PHPA)材料进行了皮下埋植实验、组织病理学观察、血生化和微核等检测。早期，在埋植部位出现了异物反应，第13天部分小鼠肝组织小血管边出现轻度炎症反应，34 d后上述反应逐渐减轻或消失，肝肾组织细胞形态和功能基本正常。实验表明，PHPA具有良好的生物相容性。
, 百拇医药
Evaluation for Biocompatibility of Poly-(3-hydroxypropyl)-
DL-Aspartamide
Weng Lihong Zhou Jun
(Department of Histology and Embryology, Zhejiang University, Hangzhou 310006)
Tang Gupin Wang Bin Chen Qiqi
(Department of Pharmacy, Zhejiang University, Hangzhou 310006)
Zhou Tao
, 百拇医药
(Department of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211)
Abstract：To evaluate the biocompatibility of poly-(3-hydroxypropyl)-DL-aspartamide(PHPA), we utilized the laboratory methods, including subcutaneous implantation, histological examination, blood biochemical and micronucleus test. Histological examination revealed a nonspecific foreign body reaction around the PHPA and a slight inflammation around the small blood vessels of the liver on the 13th day, but all these reactions diminished or disappeared gradually after 34 days of implantation. The structures and functions of liver and kidney were normal. The results indicate that PHPA possesses a good nature in biocompatibility.
, 百拇医药
Key words：Poly-(3-hydropropyl)-DL-aspartamide PHPA Biocompatibility Implantation▲
1 引 言
从Antoni G等提出PHPA可以作为一种新的血浆代用品和药物控释材料以来[1，2]，聚天冬酰胺材料已引起医药界的广泛重视，国内外学者对聚天冬酰胺为母体的材料进行了研究[3，4]。本课题组对其已进行了近十年的研究，发现这种材料易合成和修饰，可和多种药物结合，通过材料的修饰可得到不同性质的材料，从而满足多种药物释放的需要，是极具应用前景的药物控释材料[5～7]，为此，我们对PHPA材料进行了一些生物相容性指标的检测，期望为这种材料的生物应用提供依据。
2 材料和方法
2.1 材料
, 百拇医药
PHPA小棒(长5 mm，直径2.5 mm，重量45～50 mg)由本课题组合成制作[8]。
2.2 动物
ICR纯种小鼠90只，雌雄各半，体重20～30 g，随机分为实验组和对照组。
2.3 方法
2.3.1 药棒的植入 每组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，剪去背部的毛，75%酒精皮肤消毒后，开一小口，将紫外线灭菌后的PHPA小棒埋于实验组小鼠皮下组织，缝合切口，及时拆线，定时观察切口愈合情况。对照组不埋植，缝合切口。两组饲养于相同条件下。
2.3.2 组织切片制作 分别于埋植后第6、13、20、27、34 d，每组随机取出4只小鼠，眼眶取血后处死，立即取出埋植部位和肝肾组织，用10%福尔马林固定，常规制片，H.E染色，显微镜下观察。
, http://www.100md.com
2.3.3 电镜标本制作 分别于第6、13、20、27、34 d，每组随机处死小鼠，取出埋植部位和肝肾组织，2.5%冰戊二醛固定后，常规制片，PHILIPS-EM410透射电镜观察。
2.3.4 血常规、血谷丙转氨酶(GPT)、血肌酐(Cr)检测 将每组各阶段血液标本用Cobasfara Ⅱ全自动检测仪检测，结果见表1。
2.3.5 微核标本的制作 分别于第6、13、20、27 d，每组随机取出4只小鼠，眼眶取血，去纤维蛋白，3%明胶液悬浮(37 ℃水浴箱)30 min，取上清液，离心，弃大部分上清液，0.075M KCl低渗10～15 min，离心，弃上清液，弹指法混匀后，滴片，1%瑞氏染液染色后，显微镜下观察计数，每例计数1000个淋巴细胞。结果见表1。
表1 血红蛋白，白细胞，血谷丙转氨酶，血肌酐和微核检测结果
, http://www.100md.com Table 1 Results of examination of hemoglobin(Hb),white blood cell (WBC), blood glutamate pyruvate transminase (GPT), blood creatinine(Cr) and micronucleus(MN)
Hb(g/100ml)
WBC(个/cm3)
×104
ALT(nmol/L)
×104
Cr(nmol/L)
×104
, 百拇医药
Ratio of
MN(Number/%)
Test
Group
Contrast
Group
Test
Group
Contrast
Group
Test
Group
, 百拇医药
Contrast
Group
Test
Group
Contrast
Group
Test
Group
Contrast
Group
6 days
13.1±0.30
, 百拇医药 13.1±0.30
1.12±0.13
1.03±0.01
2.62±0.52
2.96±0.09
2.07±0.94
2.90±0.14
2.63±1.83
2.10±0.17
13 days
13.0±0.30
13.9±0.40
, http://www.100md.com
1.09±0.40
1.12±0.05
3.62±0.23
4.33±0.70
2.67±0.04
2.70±0.28
1.97±0.66
2.30±0.18
20 days
13.6±0.40
12.5±0.40
1.32±0.20
, http://www.100md.com
1.58±0.10
3.98±0.92
3.64±0.64
2.71±0.02
2.91±0.08
1.63±0.53
2.00±1.00
27 days
13.6±0.50
13.1±0.10
1.50±0.06
1.54±0.12
, 百拇医药
3.35±0.03
3.59±0.31
3.63±0.41
3.64±0.09
2.25±1.05
2.67±0.50
34 days
13.4±0.40
13.6±0.40
1.46±0.15
1.20±0.18
3.72±0.38
, 百拇医药
3.29±0.77
1.58±0.24
2.82±0.03
3 结果和讨论
PHPA埋植3～4 h后，体外已看不到材料棒形，触之有软化现象，全部小鼠在实验期间饮食，活动正常，毛色光亮。切口愈合良好，无感染、硬结、红肿现象。镜下观察发现PHPA在体内经历了固态，凝胶状，细小颗粒，溶解消失等一系列变化，表明PHPA是一种水溶性极好的聚氨基酸类高分子材料，体内埋植后易吸水溶解而被吸收。早期(第6 d)，在埋植部位出现了异物反应，可见巨噬细胞，中性粒细胞，淋巴细胞等炎性细胞的渗出，同时有成纤维细胞的增生，纤维组织形成包膜将PHPA包裹，但随着PHPA的溶解吸收，这种反应逐渐减轻。34 d时，局部主要是少量异物巨细胞，成纤维细胞和胶原纤维，其它炎性细胞很少见，纤维组织也明显减少(图略)。对照组的皮下组织主要表现为切口的修复过程。
, 百拇医药
PHPA从埋植部吸收后到达肝脏，13～20 d时在实验组部分小鼠肝组织小血管边出现少量轻度炎症反应，27 d以后逐渐减轻消失。肝小叶的结构正常。在肝细胞内可以看到PHPA所形成的颗粒(图略)，颗粒多位于细胞核旁或粗面内质网附近，表明PHPA的产物可以进入肝细胞内并在肝细胞内进行代谢。未见肝细胞形态和结构有异常现象。从表1可见反应肝功能状态的指标血清谷丙转氨酯(GPT)与对照组相比无明显异常，说明PHPA对肝细胞的形态和功能没有明显的影响作用。
我们在肾脏近曲小管内看到PHPA颗粒的存在，颗粒明显较埋植部位小，肾小管上皮细胞内溶酶体数量较对照组有明显增加，但细胞的形态无异常。肾小球的结构和形态正常，从表1可见血肌酐(Cr)与对照组相比无明显差异。表明有PHPA对肾组织形态和其清除肌酐的功能无明显影响。
PHPA组在各时间段的Hb和白细胞数量均较稳定(表1)，一方面间接反映了PHPA对造血组织没有明显的破坏作用，没有影响Hb的合成；另一方面反映了PHPA有较好的组织相容性，没有引起白细胞的反应性增加。
, 百拇医药
PHPA组的微核率没有高于对照组，两组均低于5‰的药典阳性标准，PHPA及其代谢产物是安全的。
目前判断高分子材料生物相容性的指标较多，常采用的方法有两类，一类为体外方法，如细胞培养法，将材料或材料提取液与细胞一起培养，研究材料对细胞生长，增殖及代谢方面的影响。另一类为体内方法，如将材料植入体内，定期将埋植部位组织取出作组织学检查，并检测各项生物指标，这种方法较体外培养法能更真实地反映动物组织对埋植物的反应。Cohen等[9]学者认为除检查埋植部位以外，尚需观察远隔器官的组织和生化分析。本实验采用体内方法来初步判断PHPA的生物相容性。选择即有代谢作用又有免疫作用的肝脏和排泄器官肾脏进行形态和功能的检测，能够敏感而客观地反应PHPA对器官组织的影响。通过以上实验结果，我们可以看出PHPA易溶解吸收，不会成为异物长期存留在局部组织，同时对肝肾组织，血红蛋白，白细胞等无明显毒性作用，是一种组织相容性较好的医用高分子材料。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570219)
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Antoni G, Neri P. Hydrodynamic properties of a new plasma expander: Polyhydroxyethylasparthamide. Biopolymers, 1974; 13∶1721
[2]Giammona G, Carlisi B, Cavallaro G et al. A new water soluble synthetic polymer, α,β-polyasparthydrazide, as potential plasma expander and drug carrier. J Controlled Release, 1994; 29∶63
[3]Claudia S, Leopold, David R. In vitro study for the assessment of Poly(L-aspartic acid) as a drug carrier for colon-apecific drug delivery. Int J Pharm, 1995; 126∶139
, http://www.100md.com
[4]Filipovic-Grcic J, Maysinger D, Zorc B et al. Macromolecular produrgs Ⅳ. Alginate-chitosan microspheres of PHEA-L-dopa adduct. Int J Pharm, 1995; 116∶39
[5]汤谷平，陈启琪，吴莜丹.高分子药物的研究(1)，炔诺酮-聚-α，β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺高分子药物体外释放的研究.中国药物化学杂志，1994；4(1)∶28
[6]单达先，朱加进，陈启琪.乙酰水杨酸-聚-α，β-(2-3-3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物的合成.中国药物化学杂志，1994；4(4)∶279
[7]朱亚尔，单达先，李士敏.阿斯匹林-聚天冬酰胺共价复合物的合成方法改进.中国药物化学杂志，1997；7(2)∶146
[8]汤谷平，单达先，陈启琪.聚-α，β-(3-3-羟丙基)-DL-天冬酰胺的合成和表征.功能高分子，1994；7∶445
[9]Cohen J. Biomaterials in orthopedic surgery. Am J Surg, 1967, 31∶114
收稿日期：1998-09-18
修改日期：1999-01-15, 百拇医药
单位：翁立红(浙江大学 医学院 组胚教研室，杭州 310006)；周俊(浙江大学 医学院 组胚教研室，杭州 310006)；汤谷平(浙江大学 药学院，杭州 310006)；王斌(浙江大学 药学院，杭州 310006)；陈启琪(浙江大学 药学院，杭州 310006)；周涛(宁波大学 食工系，宁波 315211)
关键词：聚-(3-羟丙基)-DL-天冬酰胺；PHPA；生物相容性；埋植
生物医学工程学杂志000106 摘 要：药物控释高分子材料要求有良好的生物相容性。我们对聚-(3-羟丙基)-DL-天冬酶胺(PHPA)材料进行了皮下埋植实验、组织病理学观察、血生化和微核等检测。早期，在埋植部位出现了异物反应，第13天部分小鼠肝组织小血管边出现轻度炎症反应，34 d后上述反应逐渐减轻或消失，肝肾组织细胞形态和功能基本正常。实验表明，PHPA具有良好的生物相容性。
, 百拇医药
Evaluation for Biocompatibility of Poly-(3-hydroxypropyl)-
DL-Aspartamide
Weng Lihong Zhou Jun
(Department of Histology and Embryology, Zhejiang University, Hangzhou 310006)
Tang Gupin Wang Bin Chen Qiqi
(Department of Pharmacy, Zhejiang University, Hangzhou 310006)
Zhou Tao
, 百拇医药
(Department of Food Science and Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211)
Abstract：To evaluate the biocompatibility of poly-(3-hydroxypropyl)-DL-aspartamide(PHPA), we utilized the laboratory methods, including subcutaneous implantation, histological examination, blood biochemical and micronucleus test. Histological examination revealed a nonspecific foreign body reaction around the PHPA and a slight inflammation around the small blood vessels of the liver on the 13th day, but all these reactions diminished or disappeared gradually after 34 days of implantation. The structures and functions of liver and kidney were normal. The results indicate that PHPA possesses a good nature in biocompatibility.
, 百拇医药
Key words：Poly-(3-hydropropyl)-DL-aspartamide PHPA Biocompatibility Implantation▲
1 引 言
从Antoni G等提出PHPA可以作为一种新的血浆代用品和药物控释材料以来[1，2]，聚天冬酰胺材料已引起医药界的广泛重视，国内外学者对聚天冬酰胺为母体的材料进行了研究[3，4]。本课题组对其已进行了近十年的研究，发现这种材料易合成和修饰，可和多种药物结合，通过材料的修饰可得到不同性质的材料，从而满足多种药物释放的需要，是极具应用前景的药物控释材料[5～7]，为此，我们对PHPA材料进行了一些生物相容性指标的检测，期望为这种材料的生物应用提供依据。
2 材料和方法
2.1 材料
, 百拇医药
PHPA小棒(长5 mm，直径2.5 mm，重量45～50 mg)由本课题组合成制作[8]。
2.2 动物
ICR纯种小鼠90只，雌雄各半，体重20～30 g，随机分为实验组和对照组。
2.3 方法
2.3.1 药棒的植入 每组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，剪去背部的毛，75%酒精皮肤消毒后，开一小口，将紫外线灭菌后的PHPA小棒埋于实验组小鼠皮下组织，缝合切口，及时拆线，定时观察切口愈合情况。对照组不埋植，缝合切口。两组饲养于相同条件下。
2.3.2 组织切片制作 分别于埋植后第6、13、20、27、34 d，每组随机取出4只小鼠，眼眶取血后处死，立即取出埋植部位和肝肾组织，用10%福尔马林固定，常规制片，H.E染色，显微镜下观察。
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2.3.3 电镜标本制作 分别于第6、13、20、27、34 d，每组随机处死小鼠，取出埋植部位和肝肾组织，2.5%冰戊二醛固定后，常规制片，PHILIPS-EM410透射电镜观察。
2.3.4 血常规、血谷丙转氨酶(GPT)、血肌酐(Cr)检测 将每组各阶段血液标本用Cobasfara Ⅱ全自动检测仪检测，结果见表1。
2.3.5 微核标本的制作 分别于第6、13、20、27 d，每组随机取出4只小鼠，眼眶取血，去纤维蛋白，3%明胶液悬浮(37 ℃水浴箱)30 min，取上清液，离心，弃大部分上清液，0.075M KCl低渗10～15 min，离心，弃上清液，弹指法混匀后，滴片，1%瑞氏染液染色后，显微镜下观察计数，每例计数1000个淋巴细胞。结果见表1。
表1 血红蛋白，白细胞，血谷丙转氨酶，血肌酐和微核检测结果
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Hb(g/100ml)
WBC(个/cm3)
×104
ALT(nmol/L)
×104
Cr(nmol/L)
×104
, 百拇医药
Ratio of
MN(Number/%)
Test
Group
Contrast
Group
Test
Group
Contrast
Group
Test
Group
, 百拇医药
Contrast
Group
Test
Group
Contrast
Group
Test
Group
Contrast
Group
6 days
13.1±0.30
, 百拇医药 13.1±0.30
1.12±0.13
1.03±0.01
2.62±0.52
2.96±0.09
2.07±0.94
2.90±0.14
2.63±1.83
2.10±0.17
13 days
13.0±0.30
13.9±0.40
, http://www.100md.com
1.09±0.40
1.12±0.05
3.62±0.23
4.33±0.70
2.67±0.04
2.70±0.28
1.97±0.66
2.30±0.18
20 days
13.6±0.40
12.5±0.40
1.32±0.20
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1.58±0.10
3.98±0.92
3.64±0.64
2.71±0.02
2.91±0.08
1.63±0.53
2.00±1.00
27 days
13.6±0.50
13.1±0.10
1.50±0.06
1.54±0.12
, 百拇医药
3.35±0.03
3.59±0.31
3.63±0.41
3.64±0.09
2.25±1.05
2.67±0.50
34 days
13.4±0.40
13.6±0.40
1.46±0.15
1.20±0.18
3.72±0.38
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3.29±0.77
1.58±0.24
2.82±0.03
3 结果和讨论
PHPA埋植3～4 h后，体外已看不到材料棒形，触之有软化现象，全部小鼠在实验期间饮食，活动正常，毛色光亮。切口愈合良好，无感染、硬结、红肿现象。镜下观察发现PHPA在体内经历了固态，凝胶状，细小颗粒，溶解消失等一系列变化，表明PHPA是一种水溶性极好的聚氨基酸类高分子材料，体内埋植后易吸水溶解而被吸收。早期(第6 d)，在埋植部位出现了异物反应，可见巨噬细胞，中性粒细胞，淋巴细胞等炎性细胞的渗出，同时有成纤维细胞的增生，纤维组织形成包膜将PHPA包裹，但随着PHPA的溶解吸收，这种反应逐渐减轻。34 d时，局部主要是少量异物巨细胞，成纤维细胞和胶原纤维，其它炎性细胞很少见，纤维组织也明显减少(图略)。对照组的皮下组织主要表现为切口的修复过程。
, 百拇医药
PHPA从埋植部吸收后到达肝脏，13～20 d时在实验组部分小鼠肝组织小血管边出现少量轻度炎症反应，27 d以后逐渐减轻消失。肝小叶的结构正常。在肝细胞内可以看到PHPA所形成的颗粒(图略)，颗粒多位于细胞核旁或粗面内质网附近，表明PHPA的产物可以进入肝细胞内并在肝细胞内进行代谢。未见肝细胞形态和结构有异常现象。从表1可见反应肝功能状态的指标血清谷丙转氨酯(GPT)与对照组相比无明显异常，说明PHPA对肝细胞的形态和功能没有明显的影响作用。
我们在肾脏近曲小管内看到PHPA颗粒的存在，颗粒明显较埋植部位小，肾小管上皮细胞内溶酶体数量较对照组有明显增加，但细胞的形态无异常。肾小球的结构和形态正常，从表1可见血肌酐(Cr)与对照组相比无明显差异。表明有PHPA对肾组织形态和其清除肌酐的功能无明显影响。
PHPA组在各时间段的Hb和白细胞数量均较稳定(表1)，一方面间接反映了PHPA对造血组织没有明显的破坏作用，没有影响Hb的合成；另一方面反映了PHPA有较好的组织相容性，没有引起白细胞的反应性增加。
, 百拇医药
PHPA组的微核率没有高于对照组，两组均低于5‰的药典阳性标准，PHPA及其代谢产物是安全的。
目前判断高分子材料生物相容性的指标较多，常采用的方法有两类，一类为体外方法，如细胞培养法，将材料或材料提取液与细胞一起培养，研究材料对细胞生长，增殖及代谢方面的影响。另一类为体内方法，如将材料植入体内，定期将埋植部位组织取出作组织学检查，并检测各项生物指标，这种方法较体外培养法能更真实地反映动物组织对埋植物的反应。Cohen等[9]学者认为除检查埋植部位以外，尚需观察远隔器官的组织和生化分析。本实验采用体内方法来初步判断PHPA的生物相容性。选择即有代谢作用又有免疫作用的肝脏和排泄器官肾脏进行形态和功能的检测，能够敏感而客观地反应PHPA对器官组织的影响。通过以上实验结果，我们可以看出PHPA易溶解吸收，不会成为异物长期存留在局部组织，同时对肝肾组织，血红蛋白，白细胞等无明显毒性作用，是一种组织相容性较好的医用高分子材料。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570219)
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参考文献：
[1]Antoni G, Neri P. Hydrodynamic properties of a new plasma expander: Polyhydroxyethylasparthamide. Biopolymers, 1974; 13∶1721
[2]Giammona G, Carlisi B, Cavallaro G et al. A new water soluble synthetic polymer, α,β-polyasparthydrazide, as potential plasma expander and drug carrier. J Controlled Release, 1994; 29∶63
[3]Claudia S, Leopold, David R. In vitro study for the assessment of Poly(L-aspartic acid) as a drug carrier for colon-apecific drug delivery. Int J Pharm, 1995; 126∶139
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[4]Filipovic-Grcic J, Maysinger D, Zorc B et al. Macromolecular produrgs Ⅳ. Alginate-chitosan microspheres of PHEA-L-dopa adduct. Int J Pharm, 1995; 116∶39
[5]汤谷平，陈启琪，吴莜丹.高分子药物的研究(1)，炔诺酮-聚-α，β-(羟烷基)-DL-天冬酰胺高分子药物体外释放的研究.中国药物化学杂志，1994；4(1)∶28
[6]单达先，朱加进，陈启琪.乙酰水杨酸-聚-α，β-(2-3-3-羟丙基)-DL-天冬酰胺共价复合物的合成.中国药物化学杂志，1994；4(4)∶279
[7]朱亚尔，单达先，李士敏.阿斯匹林-聚天冬酰胺共价复合物的合成方法改进.中国药物化学杂志，1997；7(2)∶146
[8]汤谷平，单达先，陈启琪.聚-α，β-(3-3-羟丙基)-DL-天冬酰胺的合成和表征.功能高分子，1994；7∶445
[9]Cohen J. Biomaterials in orthopedic surgery. Am J Surg, 1967, 31∶114
收稿日期：1998-09-18
修改日期：1999-01-15, 百拇医药