聚醚氨酯共价键合肝素的研究
作者：罗祥林 段友容 凌鸿
单位：罗祥林(四川大学 高分子材料与工程系，成都 610065)；段友容(四川大学 高分子材料与工程系，成都 610065)；凌鸿(四川大学 高分子材料与工程系，成都 610065)
关键词：聚醚氨酯；肝素；共价键合
生物医学工程学杂志000105 摘 要：研究了用共价键合方式将肝素固定在不带侧链官能团的聚醚氨酯(PEU)表面的方法。通过测定PEU表面氨基浓度确定了合适的活化条件，通过材料表面肝素含量、再钙化时间测定，证明所使用的聚醚氨酯共价键合肝素的方法较为理想。
Study of Covalently Immobilizing Heparin to Polyetherurethane Surface
Luo Xianglin Duan Yourong Lin Hong
, http://www.100md.com
(Department of Polymer Materials and Engineering， Scihuan University, Chengdu 610065)
Abstract：In this paper an approach of covalently immobilizing heparin to the surface of polyetherurethane without functional groups was studied. By quantitation of amino groups on PEU surface, the appropriate hydrolysis conditon to PEU was determined. The assays of the heparin content heparinized PEU and the time of recalcification proved the above approach comparatively ideal.
, 百拇医药
Key words：Polyetherurethane Heparin Covalently immobilizing▲
1 前 言
自1963年Gott等人首创GBH的表面肝素化方法以来，生物材料表面的各种肝素化方法得到了广泛研究[1～3]。肝素化的方法可以分为：物理方法(表面物理涂层)和化学方法两类。化学方法包括离子键合和共价键合方式。使用表面涂层或离子键合时，肝素与材料表面的结合力较弱，容易被血流冲走或与血液成分发生离子交换，使材料表面很快失去抗凝血性。因而从80年代中期起已开始采用共价键合方式将肝素固定在生物材料表面。但是，最初使用的方法却使肝素的活性下降。对聚醚氨酯材料表面的肝素化，1985年Heyman PW报道了一种较为成功的共价键合方法[4]。但是在该方法中所用的原料毒性大，限制了其使用和推广。在此之后，聚氨酯共价键合肝素的研究主要集中于带侧链官能团的聚氨酯材料[5～7]。
, 百拇医药
我们探索了用共价键合方式将肝素固定到不带侧链官能团的聚醚氨酸(PEU)表面的方法，并避免使用剧毒的光气。本课题研究了PEU的最佳活化时间，测定了表面肝素含量及肝素化PEU的再钙化时间，证明：我们使用的共价键合方法可以使PEU材料的抗凝性能大大提高。
2 材料和方法
2.1 材料
肝素钠(135 U/mg)为成都生化试剂厂生产；2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、盐酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)均为进口试剂；甲苯胺兰、1，2-乙二胺、1，6-己二胺、1，10-癸二胺、6-氨基正己酸均为国产化学试剂；医用级PEU为本实验室合成产品(国家“九五”重点攻关项目)。
2.2 方法
2.2.1 聚醚氨酯片的制备及活化 医用级PEU切粒，在THF中溶解后浇铸成膜(厚～0.3 mm)。将膜切成5 mm×20 mm的小片，用异丙醇、蒸馏水充分洗涤后浸入1 ml 3 M NaOH和10 ml异丙醇的混合液中活化，取出活化的PEU片，用蒸馏水洗涤至中性，置于60 ℃真空烘箱中烘干，记为PEU(a)。
, 百拇医药
2.2.2 PEU(a)表面肝素化 我们采用了两种肝素化方法。
肝素化方法(一)流程示意图：
2.2.3 PEU(a)表面氨基浓度的测定 氨基官能团的测定按Ito Y等报道的方法进行[8]。
2.2.4 肝素化聚醚氨酯表面肝素浓度的测定 固定在PEU表面的肝素浓度按Smith等人报道的方法进行[9]。将样品剪碎后加到甲苯胺兰水溶液中，剧烈振荡。形成的肝素/甲苯胺兰络合物用n-正己烷萃取。重复操作一次。肝素/甲苯胺兰用紫外分光光度计(631 mm)测定，计算肝素量。
2.2.5 再钙化时间测定 按“四川省生物材料监测中心”制定的“再钙化时间测定”方法，用约2.5 kg的大耳白兔取血，加入3.8%柠檬酸三钠，放入肝素化PEU样品后，于4 ℃～8 ℃冰箱中放置48 h，分离血浆，加入一定量钙离子，在37 ℃恒温下观察纤维蛋白丝形成所需时间。
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3 结果与讨论
3.1 活化条件对PEU对表面水解的影响
不同活化时间和温度下PEU表面氨基的浓度如表1所示。在同一温度下，表面氨基的浓度随活化时间的增加而加大。但是在78 ℃下，当活化时间增加到10 min时，材料表面发粘，强度开始降低。由表1数据可知，30 min/25 ℃与5 min/78 ℃条件下产生的氨基浓度相近。因此，我们选择78 ℃、活化5 min为最佳条件。这样PEU表面的轻微水解提供了进一步反应的官能团，又不会影响PEU本体的物理机械性能。
3.2 肝素化PEU材料的再钙化时间
一般认为，在相同实验条件下，再钙化时间长的材料的抗凝血性较好，即血液相容性好。我们测定的PEU材料的再钙化时间如图1所示，使用本文所述的肝素化方法(一)、(二)将肝素共价键合到PEU材料表面，其再钙化时间均比空白样品明显增加，表明肝素化PEU材料的抗凝血性提高。在肝素化方法(二)中，使用1，2-乙二胺，1，6-己二胺、1，10-癸二胺作为“空间臂”，随着碳原子数的增多，再钙化时间显著增加，与文献报道的结果相一致[10]。
, 百拇医药
表1 水解条件对PEU(a)表面NH2浓度的影响
Table 1 Influence of hydrolysis conditioin on amount of -NH2 groups on PEU(a) surface Hydrolysis condition
Amount of -NH2 groups on
PEU(a) surface (mmol/cm2)
Time(min)
Temper(℃)
1
25
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0
5
25
5.5×10-5
10
25
9.9×10-5
30
25
1.86×10-4
1
78
, 百拇医药
8.8×10-5
5
78
1.5×10-4
10
78
1.6×10-4
图1 PEU材料的再钙化时间
Fig 1 Time of recalcification of PEU materlals
3.3 肝素化PEU表面肝素浓度与再钙化时间的关系
, http://www.100md.com
材料表面肝素浓度(mg/cm2)的测定结果列于表2。由表中数据可以看出，在肝素化方法(二)中，随着“空间臂”的增长，材料表面肝素浓度增大，因而钙化时间延长。虽然直接肝素化PEU(s)材料的表面肝素浓度比以1，2-乙二胺作“空间臂”的肝素化PEU-N2NH的浓度要高一倍，但是其再钙化时间却明显低得多。我们认为，肝素的作用是与各种凝血因子形成络合物，而肝素的活性表现与肝素具有的天然构象密切相关。因此接入“空间臂”能使肝素维持其天然构象，使肝素的抗凝血活性得以表现。同时，比较PEU-N5CH和PEU-N10NH可知，采用不同的肝素方法使材料肝素化之后，当表面肝素浓度相近时，肝素化材料的再钙化时间有较大差异。这可能除了“空间臂”的影响因素外，还由于共价键合肝素时，方法(一)中发生反应的是肝素上的氨基，而方法(二)中是肝素上的羧基所致。氨基和羧基各处于肝素中不同的活性部位，使键合肝素的抗凝血活性产生了差异。
表2 键合肝素量及肝素化PEU的再钙化时间
, 百拇医药
Table 2 Amount of immob. hep. and time of recal. of hep. PEU Sample
Amount of immobilized
heparin(mg/cm2)
Time of recalcification
(s)
PEU
～
27±5
PEU-N5CH
124
, http://www.100md.com
80±7
PEU(s)
10
37±5
PEU-N2NH
5
50±5
PEU-N6NH
24
62±10
PEU-N10NH
114
113±17
, 百拇医药
4 结 论
(1)通过聚醚氨酯表面微水解的活化作用，可以提供表面共价键肝素所需的官能团：不同温度下的最佳活化时间不同。
(2)使用肝素化方法(一)或(二)均可将肝素共价键合到聚醚氨酯的表面，并使其再钙化时间延长。
(3)“空间臂”长度及共价键合肝素时反应的官能团均可能对肝素化聚醚氨酯的抗凝活性产生影响。
(4)使用肝素化方法(二)，以1，10-癸二胺作为“空间臂”时，其肝素化聚醚氨酯的抗凝效果更佳。■
基金项目：四川省科委资助项目(川科委计 1997-016)
参考文献：
[1]Eloy R, Belleville J, Rissoan MC et al. Heparinization of medical grade polyurethanes. J Biomater Applicat, 1988; 4(2)∶475
, 百拇医药
[2]林思聪.高分子生物材料分子工程研究进展.高分子通报，1997；1∶1
[3]Valiathan MS. Heparin bonding:Then and now. Bull Mater Sci, 1994; 17(7)∶1199
[4]Heyman PW, Cho CS, McRea JC et al. Heparinized polyureth-
anes:In vitro and in vivo Studies. J Biomed Mater Res, 1985; 19∶419
[5]Ito Y, Imanishi Y. In vitro platelet adhesion and in vivo antithrombogenicity of heparinized polyetherurethaneureas. Biomaterials, 1988; 9(5)∶235
, 百拇医药
[6]Liu L, Ito Y, Imanishi Y. Synthesis and antithrombogenicity of heparinized polyurethanes with intervening spacer chains of various kinds. Biomaterials, 1991; 12(5)∶390
[7]Lindhout T, Blezer R. Antithrombin activity of surface-bound heparin studied under flow condition. Biomed. Mater Res, 1995; 29(10)∶1255
[8]Ito Y, Sisdo M, Imanishi Y. Synthesis and antihtrombogenicity of anionic polyurethanes and heparin-bound polyurethanes. J Biomed Mater Res, 1986; 20∶1157
[9]Smith PK, Nalia AK, Hermason. Colorimetric method for the assay of heparin content in immobilized heparin preparations. Anal Biochem, 1980; 109∶466
[10]Ebert CD, Kim SW. Immobilized heparin:Spacer arm effects on biologic interactons. Thromb Res, 1982; 26∶43
收稿日期：1998-09-03, 百拇医药
单位：罗祥林(四川大学 高分子材料与工程系，成都 610065)；段友容(四川大学 高分子材料与工程系，成都 610065)；凌鸿(四川大学 高分子材料与工程系，成都 610065)
关键词：聚醚氨酯；肝素；共价键合
生物医学工程学杂志000105 摘 要：研究了用共价键合方式将肝素固定在不带侧链官能团的聚醚氨酯(PEU)表面的方法。通过测定PEU表面氨基浓度确定了合适的活化条件，通过材料表面肝素含量、再钙化时间测定，证明所使用的聚醚氨酯共价键合肝素的方法较为理想。
Study of Covalently Immobilizing Heparin to Polyetherurethane Surface
Luo Xianglin Duan Yourong Lin Hong
, http://www.100md.com
(Department of Polymer Materials and Engineering， Scihuan University, Chengdu 610065)
Abstract：In this paper an approach of covalently immobilizing heparin to the surface of polyetherurethane without functional groups was studied. By quantitation of amino groups on PEU surface, the appropriate hydrolysis conditon to PEU was determined. The assays of the heparin content heparinized PEU and the time of recalcification proved the above approach comparatively ideal.
, 百拇医药
Key words：Polyetherurethane Heparin Covalently immobilizing▲
1 前 言
自1963年Gott等人首创GBH的表面肝素化方法以来，生物材料表面的各种肝素化方法得到了广泛研究[1～3]。肝素化的方法可以分为：物理方法(表面物理涂层)和化学方法两类。化学方法包括离子键合和共价键合方式。使用表面涂层或离子键合时，肝素与材料表面的结合力较弱，容易被血流冲走或与血液成分发生离子交换，使材料表面很快失去抗凝血性。因而从80年代中期起已开始采用共价键合方式将肝素固定在生物材料表面。但是，最初使用的方法却使肝素的活性下降。对聚醚氨酯材料表面的肝素化，1985年Heyman PW报道了一种较为成功的共价键合方法[4]。但是在该方法中所用的原料毒性大，限制了其使用和推广。在此之后，聚氨酯共价键合肝素的研究主要集中于带侧链官能团的聚氨酯材料[5～7]。
, 百拇医药
我们探索了用共价键合方式将肝素固定到不带侧链官能团的聚醚氨酸(PEU)表面的方法，并避免使用剧毒的光气。本课题研究了PEU的最佳活化时间，测定了表面肝素含量及肝素化PEU的再钙化时间，证明：我们使用的共价键合方法可以使PEU材料的抗凝性能大大提高。
2 材料和方法
2.1 材料
肝素钠(135 U/mg)为成都生化试剂厂生产；2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、盐酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)均为进口试剂；甲苯胺兰、1，2-乙二胺、1，6-己二胺、1，10-癸二胺、6-氨基正己酸均为国产化学试剂；医用级PEU为本实验室合成产品(国家“九五”重点攻关项目)。
2.2 方法
2.2.1 聚醚氨酯片的制备及活化 医用级PEU切粒，在THF中溶解后浇铸成膜(厚～0.3 mm)。将膜切成5 mm×20 mm的小片，用异丙醇、蒸馏水充分洗涤后浸入1 ml 3 M NaOH和10 ml异丙醇的混合液中活化，取出活化的PEU片，用蒸馏水洗涤至中性，置于60 ℃真空烘箱中烘干，记为PEU(a)。
, 百拇医药
2.2.2 PEU(a)表面肝素化 我们采用了两种肝素化方法。
肝素化方法(一)流程示意图：
2.2.3 PEU(a)表面氨基浓度的测定 氨基官能团的测定按Ito Y等报道的方法进行[8]。
2.2.4 肝素化聚醚氨酯表面肝素浓度的测定 固定在PEU表面的肝素浓度按Smith等人报道的方法进行[9]。将样品剪碎后加到甲苯胺兰水溶液中，剧烈振荡。形成的肝素/甲苯胺兰络合物用n-正己烷萃取。重复操作一次。肝素/甲苯胺兰用紫外分光光度计(631 mm)测定，计算肝素量。
2.2.5 再钙化时间测定 按“四川省生物材料监测中心”制定的“再钙化时间测定”方法，用约2.5 kg的大耳白兔取血，加入3.8%柠檬酸三钠，放入肝素化PEU样品后，于4 ℃～8 ℃冰箱中放置48 h，分离血浆，加入一定量钙离子，在37 ℃恒温下观察纤维蛋白丝形成所需时间。
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3 结果与讨论
3.1 活化条件对PEU对表面水解的影响
不同活化时间和温度下PEU表面氨基的浓度如表1所示。在同一温度下，表面氨基的浓度随活化时间的增加而加大。但是在78 ℃下，当活化时间增加到10 min时，材料表面发粘，强度开始降低。由表1数据可知，30 min/25 ℃与5 min/78 ℃条件下产生的氨基浓度相近。因此，我们选择78 ℃、活化5 min为最佳条件。这样PEU表面的轻微水解提供了进一步反应的官能团，又不会影响PEU本体的物理机械性能。
3.2 肝素化PEU材料的再钙化时间
一般认为，在相同实验条件下，再钙化时间长的材料的抗凝血性较好，即血液相容性好。我们测定的PEU材料的再钙化时间如图1所示，使用本文所述的肝素化方法(一)、(二)将肝素共价键合到PEU材料表面，其再钙化时间均比空白样品明显增加，表明肝素化PEU材料的抗凝血性提高。在肝素化方法(二)中，使用1，2-乙二胺，1，6-己二胺、1，10-癸二胺作为“空间臂”，随着碳原子数的增多，再钙化时间显著增加，与文献报道的结果相一致[10]。
, 百拇医药
表1 水解条件对PEU(a)表面NH2浓度的影响
Table 1 Influence of hydrolysis conditioin on amount of -NH2 groups on PEU(a) surface Hydrolysis condition
Amount of -NH2 groups on
PEU(a) surface (mmol/cm2)
Time(min)
Temper(℃)
1
25
, http://www.100md.com
0
5
25
5.5×10-5
10
25
9.9×10-5
30
25
1.86×10-4
1
78
, 百拇医药
8.8×10-5
5
78
1.5×10-4
10
78
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图1 PEU材料的再钙化时间
Fig 1 Time of recalcification of PEU materlals
3.3 肝素化PEU表面肝素浓度与再钙化时间的关系
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材料表面肝素浓度(mg/cm2)的测定结果列于表2。由表中数据可以看出，在肝素化方法(二)中，随着“空间臂”的增长，材料表面肝素浓度增大，因而钙化时间延长。虽然直接肝素化PEU(s)材料的表面肝素浓度比以1，2-乙二胺作“空间臂”的肝素化PEU-N2NH的浓度要高一倍，但是其再钙化时间却明显低得多。我们认为，肝素的作用是与各种凝血因子形成络合物，而肝素的活性表现与肝素具有的天然构象密切相关。因此接入“空间臂”能使肝素维持其天然构象，使肝素的抗凝血活性得以表现。同时，比较PEU-N5CH和PEU-N10NH可知，采用不同的肝素方法使材料肝素化之后，当表面肝素浓度相近时，肝素化材料的再钙化时间有较大差异。这可能除了“空间臂”的影响因素外，还由于共价键合肝素时，方法(一)中发生反应的是肝素上的氨基，而方法(二)中是肝素上的羧基所致。氨基和羧基各处于肝素中不同的活性部位，使键合肝素的抗凝血活性产生了差异。
表2 键合肝素量及肝素化PEU的再钙化时间
, 百拇医药
Table 2 Amount of immob. hep. and time of recal. of hep. PEU Sample
Amount of immobilized
heparin(mg/cm2)
Time of recalcification
(s)
PEU
～
27±5
PEU-N5CH
124
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80±7
PEU(s)
10
37±5
PEU-N2NH
5
50±5
PEU-N6NH
24
62±10
PEU-N10NH
114
113±17
, 百拇医药
4 结 论
(1)通过聚醚氨酯表面微水解的活化作用，可以提供表面共价键肝素所需的官能团：不同温度下的最佳活化时间不同。
(2)使用肝素化方法(一)或(二)均可将肝素共价键合到聚醚氨酯的表面，并使其再钙化时间延长。
(3)“空间臂”长度及共价键合肝素时反应的官能团均可能对肝素化聚醚氨酯的抗凝活性产生影响。
(4)使用肝素化方法(二)，以1，10-癸二胺作为“空间臂”时，其肝素化聚醚氨酯的抗凝效果更佳。■
基金项目：四川省科委资助项目(川科委计 1997-016)
参考文献：
[1]Eloy R, Belleville J, Rissoan MC et al. Heparinization of medical grade polyurethanes. J Biomater Applicat, 1988; 4(2)∶475
, 百拇医药
[2]林思聪.高分子生物材料分子工程研究进展.高分子通报，1997；1∶1
[3]Valiathan MS. Heparin bonding:Then and now. Bull Mater Sci, 1994; 17(7)∶1199
[4]Heyman PW, Cho CS, McRea JC et al. Heparinized polyureth-
anes:In vitro and in vivo Studies. J Biomed Mater Res, 1985; 19∶419
[5]Ito Y, Imanishi Y. In vitro platelet adhesion and in vivo antithrombogenicity of heparinized polyetherurethaneureas. Biomaterials, 1988; 9(5)∶235
, 百拇医药
[6]Liu L, Ito Y, Imanishi Y. Synthesis and antithrombogenicity of heparinized polyurethanes with intervening spacer chains of various kinds. Biomaterials, 1991; 12(5)∶390
[7]Lindhout T, Blezer R. Antithrombin activity of surface-bound heparin studied under flow condition. Biomed. Mater Res, 1995; 29(10)∶1255
[8]Ito Y, Sisdo M, Imanishi Y. Synthesis and antihtrombogenicity of anionic polyurethanes and heparin-bound polyurethanes. J Biomed Mater Res, 1986; 20∶1157
[9]Smith PK, Nalia AK, Hermason. Colorimetric method for the assay of heparin content in immobilized heparin preparations. Anal Biochem, 1980; 109∶466
[10]Ebert CD, Kim SW. Immobilized heparin:Spacer arm effects on biologic interactons. Thromb Res, 1982; 26∶43
收稿日期：1998-09-03, 百拇医药