兔海水淹溺肺水肿发生机制的实验研究
作者：董文度 刘新卷 傅更锋 丁勇 张敏华 骆云 王琰 刘虹 徐根兴 赵增荣 袁驾南
单位：(第二军医大学 南京军医学院分子医学研究所，南京 210099)
关键词：肺水肿；海水淹溺；细胞色素氧化酶；c-fos基因
生物医学工程学杂志000220 摘要 为探讨海水淹溺肺水肿(PE-SWD)的发生机理 ，应用丹麦产ABL-Ⅲ型血气-酸碱分析仪，对兔动脉血气和酸碱指标进行自动检测；采用 计算机图像分析系统，对肺Na+-K+-ATPase、细胞色素氧化酶(CYTO)和碱性磷酸酶(AL P)进行自动检测和定量分析；采用原位杂交和免疫组化技术，对肺组织c-fos mRNA和Fos蛋 白进行定量检测；采用磷脂和Ca2+超微结构定位方法，对肺磷脂和Ca2+的分布 进行定位定量观察。结果表明：PE-SWD组动脉氧分压(PaO2)、血氧饱和度(SaO2)、pH 值、实际碳酸氢盐(AB)、剩余碱(BE)、肺Na+-K+-ATPase和CYTO显著降低。PE-SWD组 兔肺上 皮组织中ALP、c-fos mRNA和Fos蛋白的表达水平比正常对照组(NC)明显升高(P<0.01) 。PE-SWD组肺泡Ⅱ型上皮细胞磷脂反应产物明显减少，肺毛细血管内皮细胞和肺泡Ⅰ、 Ⅱ型上皮细胞Ca2+沉淀颗粒明显增多。作者认为，海水损伤性作用、低氧血症和代谢 性酸中毒是PE-SWD发生机制中三种重要因素。肺Na+-K+-ATPase、CYTO活力降低和 细胞内钙超载既是上述三大因素造成的直接恶果，又是促进PE-SWD不断发生发展的继发性 原因。Ca2+-fos传导途径可能也是导致PE-SWD不断恶化的重要环节。
, 百拇医药
Study on the Mechanism of Pulmonary Edema after Seawater Drow ning in Rabbit
Dong Wendu Liu Xingjuan Fu Gengfeng Ding Yong Zhang Minhua Luo Yun Wang Yan Liu Hong Xu Genxing Zhao Zengrong Yuan Jianan
(Institute of Molecular Medicine, Nanjing Military Medical College of the Second Military Medical University, Nanjing 210099)
Abstract To study the mechanism of pulmonary edema after s eawater drowning (PE-SWD), the indexes of blood-gas and acid-base in rabbits arter y blood were measured by the blood-gas analyser. The activity of Na+-K+- ATPase, cytochrome oxidase(CYTO) and alkaline phosph arase(ALP) in the lungs were measured and analysed by computer image system. C-fos mRNA and Fos protein in the lungs were respectively determined by situ hybrioization and immunohisto che m ical techniques. The distribution of phospholipid and Ca2+ of rabbits lung s was quantitatively analysed by ultrastructual location method. The results sho wed that, five parameters of PaO2, oxygen saturation(SaO2), pH, actual bicar bonite(AB) and base excess(BE) and the activity of Na+-K+-ATPase and CYTO d ecreased remarkably in PE-SWD. Both c-fos mRNA and Fos protein expression in p ulmonary epithelial cells in PE-SWD were significantly elevated compared with t he normal controls(P<0.01). The phospholipids products in the pulmonary alv eolar type Ⅱ epithelial cells were decreased, however, the Ca2+ precipit ate pellets inside the lung capillary endothelial cells and the pulmonary alveol ar type Ⅰ and Ⅱ epithelial cells increased obviously. The arthors suggest that the injuny action of the seawater, hypoxia and metabolic acidosis may be the mi an three mechanisms of the pulmonary edema induced seawater drowning. The loweri ng activity of Na+-K+-ATPase and CYTO in the lungs and calcium overload in the cells are not only evil consequence resulted from above three factors, but also the importent causes leading to the worse of PE-SWD. The transmiting line of Ca2+-fos may be also a key link to bring about the worse of PE-SWD.
, 百拇医药
Key words Pulmonary edema Seawater drowning Cytochrome ox idase C-fos gene
1 引 言
本研究在连续观察兔海水淹溺肺水肿(Pulmonary edema after seawater drowning, PE-SW D)动脉血气和酸碱指标变化的基础上，对兔肺Na+-K+-ATPase、细胞色素氧化酶(Cy tochrome oxidase, CYTO)、碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, ALP)、c-fos mRNA和Fos 蛋白进行自动检测和定量分析。对肺磷脂和Ca2+的分布进行定位定量观察。对肺损伤 程度和组织形态变化进行系统的病理学观察。旨在揭示FE-SWD的发生机制，为PE-SWD的救 治提供科学依据。
2 材料和方法
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实验动物为一级纯种新西兰兔(由江苏省农科院动物实验中心提供)18只，雄性，体重(2.48 ±0.24) kg。随机分为PE-SWD组14只和不灌海水对照组(Normal control, NC)4只。海水 取自东径120.3°北纬36.1°的胶洲湾海域，含盐度为3.0-3.5%。
2.1 模型复制
20%氨基甲酸乙酯(1.0 g/kg体重)耳缘静脉注射麻醉，气管切开插入“Y”型玻璃套管。右股 动脉插入塑料导管供取血用。用20 ml注射器连接20 cm塑料管插入“Y”型气管套管内，快 速向兔肺内灌入海水4 ml/kg，1 min内灌完，复制出PE-SWD动物模型[1]。
2.2 血气和酸碱指标检测
每只兔在灌海水前及灌海水后不同时间分别由股动脉取血0.5 ml。用ABL-Ⅲ型血气酸碱分 析仪对动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)、血氧饱和度(Oxygen saturation SaO2)、pH、实际碳酸氢盐(Actual bocarbonate.AB)和剩余碱(Base excess, BE)等6项指 标进行检测。
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2.3 肺酶定量测定
两组兔肺Na+-K+-ATPase、CYTO和ALP细胞化学反应和图像定量测定9种参数按照徐根 兴建立的方法进行[2]。参数分别为(1)酶阳性反应面积(A1)； (2)酶阴性反应面积(A2)；(3)酶阳性反应区平均灰度 (G1)；(4)酶阴性反应区平均灰度(G2)；(5)酶阳 性反应区最大灰度(G4)；(6)酶阳性反应区最小灰度(G5)；( 7)酶阳性反应区灰度范围(G6)；(8)酶阳性反应区积分光密度( D1)；(9)酶阳性反应区光密度(D2)。上述参数均由 图像分析仪自动测量，由计算机对各组参数进行F检验。若两组参数方差不齐，用t′检 验，反之则用t检验。
2.4 c-fos基因表达水平的图像分析
, 百拇医药
c-fos mRNA和蛋白原位杂交、免疫组化和图像分析按照参考文献2和3中的方法进行。
2.5 肺磷脂和Ca2+超微结构观察
从两组肺下叶背侧取材，按照改进的磷脂和Ca2+超微结构定位方法处理[2] 。EPON812包埋，超薄切片，不经铀-铅电子染色，直接在JEM-100S型及带有能谱仪的JEM -200CX透射电镜下进行观察和能谱分析。
2.6 肺组织形态学观察
从两肺下叶背侧取材，常规固定制片，进行光镜、电镜观察。
3 结果
3.1 PE-SWD时血气和酸碱指标变化
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灌海水后30 min，兔PaO2和SaO2显著下降，尔后虽有缓慢回升趋势，但仍处于较低水平 。动脉血pH、AB和BE均在灌海水后10 min明显下降，且呈进行性下降趋势(见表1)。
表1 海水淹溺肺水肿时血气和酸碱指标变化(
±s,n=14)
Table 1 Changes of blood-gas and acid-base indexes during pulmonary ede ma after seawater drowning Time(min)
PaO2(kPa)
PaCO2(kPa)
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SO2(%)
pH
AB(mmol/L)
BE(mmol/L)
Before infusion
11.19±0.53
5.10±0.21
94.49±1.58
7.37±0.02
23. 37±1.41
-1.66±1.69
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After infusion
10
3.78±0.54**
6.98±0.55**
45.29±12.86**
7.28±0.03**
17.82±2.69 **
-6.84±3.31**
30
3.65±0.47**
, 百拇医药
6.94±0.33**
40.00±13.77**
7.19±0.04**
15.98±2.79 **
-11.68±3.88**
60
4.77±1.16**
4.33±0.31**
55.67±13.92**
, 百拇医药
7.20±0.03**
12.89±2.54 **
-14.47±2.83**
90
5.42±0.96**
3.83±0.24**
61.91±12.82**
7.19±0.07**
10.63±2.69 **
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-16.70±3.53**
120
6.38±0.92**
3.23±0.62**
66.61 ±11.13**
7.16±0.07**
8.28±2.96**
-19.61±3.78**
Compared with before infusion ** P<0.01
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3.2 PE-SWD对肺3种酶的影响
酶的定位分布显示，Na+-K+-ATPase反应产物主要位于细胞膜上，CYTO反应产物主要 位于线粒体中，ALP产物主要分布于Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮和肺毛细血管内皮细胞膜上。PE-SWD 组中Na+-K+-ATPase和CYTO含量和活力降低。而ALP阳性反应面积和阳性反应区积分光 密度则显著增高(见表2)。图像分析仪灰度级为0-255级，酶阳性反应越强，测量得到的 灰度值就越低，反之则灰度值就越高[2]。表2 海水淹溺肺水肿时肺三种酶活力的变化(±s)
Table 2 Changes of Na+-K+-ATPase, CYTO and ALP activity in the lung s during pulmonary edema after seawater drowing
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Parameter item
Na+-K+-ATPase
CYTO
ALP
NC
PE-SWD
NC
PE-SWD
NC
PE-SWD
A1 Area of enzyme positive
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reaction(μm2)
80 .72±21.24
35. 59±10.91**
84.45±10.95
39.83±8.74**
56.36±10.50
81.91±15.31**
A2 Area of enzyme negative reaction(μm2)
1188. 42±21.42
, 百拇医药
12 33.55±10.91**
1184.70±10.95
1229.31±8.74**
1212.78±10.50
1187.23±15.31**
G1 Average grey of enzyme positive reaction area
7 0.79±2.77
70.07±4.02**
83.75±2.40
, 百拇医药
85.61±3.84*
9 5.03±2.63
93.13±1.85**
G2 Average grey of enzyme negative reaction area
1 03.42±2.52
105.41±1.75**
107.20±1.89
108.87±2.68
106.50±1.73
, 百拇医药
106.00±1.28
G4 Maximal grey of enzyme positive reaction area
7 7.92±2.50
81.67±3.17**
88.83±2.02
89.58±3.23
96.9 4±2.12
95.89±1.55*
G5 Minimal grey of enzyme positive reaction area
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5 2.17±5.91
64.06±6.46**
66.92±4.70
73.58±5.99**
86.64±4.18
81.44±8.75**
G6 Grey range of enzyme positive reaction area
25. 75±5.34
17 .61±3.93**
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21.92±3.73
16.00±4.82**
10.31±2.94
14.44±8.19**
D1 Integral luminosity of enzyme positive reaction area
73597.83 ±19280.48
35186.44±10140.04**
913 58.33±12503.91
43967.56±9853.66**
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69127.72±12984.34
93568.56±19050.86**
D2 Luminosity of enzyme positive reaction area
11. 18±0.25
10 .43±0.29**
11.41±0.14
10.67±0.22**
11.13±0.19
11.48±0.20**
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PE-SWD组与NC组比 PE-SWD group vs NC group * P<0.05 ** P <0.01
3.3 c-fos基因在PE-SWD兔肺中的表达水平
C-fos mRNA原位杂交的阳性反应区定位在细胞质中，颜色反应呈淡黄色 。图像定量分析结果显示，PE-SWD组兔肺上皮细胞中c-fos mRNA和Fos蛋白含量均有 显著增加(见表3)。表明c-fos基因表达在转录和翻译水平方面显著增强。表3 海水淹溺肺水肿组兔肺c-fos基因表达图像定量分 析(±s)
Table 3 Image quantitative analysis of c-fos gene expression in rabbits lungs during PE-SWD group
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Parameter item
c-fos mRNA
fos-protein
NC
PE-SW D
NC
PE-SWD
A1 Area of positive reaction(μm2)
155.93±40.21
325.46±145.18**
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59.76±24.50
128.93±26.87**
A2 Area of negative reaction(μm2)
1113.21±40.21
943.68±145.18 **
1209.37±24.50
1145.21±26.87**
G1 Avemge grey of positive reaction area
, 百拇医药
85.02±2.62
81.67 ±4.95**
85.47±2.49
69.86±3.62**
G4 Maximal grey of positive reaction area
88.68±2.46
88.25 ±2.82
90.67±1.57
80.11±2.49**
G5 Minimal grey of positive reaction area
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65.67±12.86
61.25 ±10.12
64.89±10.51
37.11±7.03**
G6 Grey range of positive reaction area
23.00±14.70
27.00±8,75
25.78±9.97
43.00±6.06**
D1 Integral luminosity of positive reaction area
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171267.00±45399.41
338960.7±142458.39**
65384.42±25 435.28
112001.54±26347.02**
D2 Luminosity of positive reaction area
12.01±0.29
1.65±0.43**
11.01±0.40
11.60±0.26**
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PE-SWD组与NC组比 PE-SWD group vs NC group ** P<0.01
3.4 两组肺磷脂和Ca2+超微结构变化
3.4.1 肺磷脂反应 NC组肺泡Ⅱ型细胞板层小体、肺泡上皮细胞表面 可见有较多的磷脂沉淀物，有的连成一片形成片层结构。用能谱仪进行X射线微区元素分析 ，表明含有Pb峰和Fe峰，证明磷反应的特异性。PE-SWD组肺Ⅱ型细胞板层体部分破坏或有 排空现象，磷脂反应产物明显少于NC组，但毛细血管腔内磷脂反应产物明显多于NC组。
3.4.2 Ca2+沉淀反应 PE-SWD组Ⅰ 、Ⅱ型肺泡上皮和毛细血管内皮Ca2+沉淀物明显多于NC组，两肺巨噬细胞内Ca2+ 沉 淀颗粒明显少于NC组。
3.5 肺形态结构变化
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肺表面淡红色，可见暗红色片状区和出血区，以肺下叶背侧为甚。切面呈暗红色，有粉红色 水肿液溢出。
3.5.1 光镜变化 肺泡腔及肺间质水肿；局灶性肺不张代偿 性肺气肿；肺泡壁毛细血管扩张、充血及肺泡泡腔内出血；肺间质炎细胞浸润及肺泡腔炎细 胞渗出。
3.5.2 电镜观察 Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮受损、胞体肿胀，板层 小 体多被破坏或有排空现象；肺毛细血管内皮细胞肿胀，胞膜明显受损；线粒体嵴肿胀、断裂 、有空泡化现象；血管基底膜暴露，管腔内有血小板聚集、附壁现象。
4 讨论
灌海水后动物出现呼吸困难、呼吸频率明显增加，紫绀明显，两肺布满湿罗音，气管内溢出 泡沫状液体。PaO2、SaO2、pH、AB 5项指标显著降低(表1)，表现出严重的进行性低氧 血症和代谢性酸中毒。结合肺病理形态变化，表明发生了PE-SWD[4，5]。PE-SWD 既不属于单纯流体静压性肺水肿，又不属于单纯通透性肺水肿，属于混合性肺水肿。其形成 过程为：海水被吸入肺内首先引起肺泡腔水肿，继而海水渗入肺间质引起肺间质水肿，此为 原发性PE-SWD。由于海水的高渗作用和/或肺毛细血管的通透性增加。使肺毛细血管内的 液体转移至肺间质增多，进一步发展为继发性PE-SWD(见图1)。
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图1 PE-SWD的形成和转归
Fig 1 Formation and transformation of PE-SWD
PE-SWD发生机制较为复杂，可能与下列四大因素有关(图2)。(1)[ STBZ〗海水的直接 作用：海水淹溺时由于吸气动作，海水被直吸入肺内形成肺泡腔和肺间质水肿。这一阶段肺 水肿持续时间短，随后因其它因素的参与而发生变化。(2)肺组织液渗透 压增高：海水含盐 度高达30%左右，当吸进肺内后，造成肺组织液渗透压高于血浆渗透压3倍之多，致使毛细血 管内的水迅速转移至肺间质或肺泡腔，形成继发性PE-SWD，此时肺内水肿液既有吸入的海 水，又有毛细血管内液的渗出，较之原发性PE-SWD更为严重。(3)肺毛细 血管通透性增加： 由于肺毛细血管内液体外渗，致使血液浓缩，血流淤滞，微循环障碍，发生循环性缺氧，与 PE-SWD原有的乏氧性缺氧合并存在，形成混合性缺氧。在缺氧和酸中毒的影响下，肺毛细 血管内皮细胞严重受损，毛细血管通透性增加，血管内水外渗增多，加重原发性PE-SWD的 程 度。(4)肺毛细血管内压增高：肺泡腔和肺间质水肿不断发生和发展，造 成肺静脉和肺毛细 血管受压扭曲和变形，肺毛细血管内压升高，组织液生成增多，肺水肿更为严重。当肺内液 体增多，肺重量增加，体积增大，肺包膜紧张度增加时，致使肺表面淋巴管受压扭曲，造成 肺淋巴回流障碍。这可能也是加重PE-SWD的重要因素之一。
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肺内Na+-K+-ATPase和CYTO活性降低是PE-SWD发生机制中很值得注意的一个问题。在 PE-SWD组中，两种酶的阳性反应面积(A1)、阳性反应区积分光密度(D1)和阳性反应区 光 密度(D2)三项参数显著降低(表2)，G1、G2、G4和G5等4项灰度参数明显升高(实 际表明酶活性降低)。这足以说明PE-SWD引起肺Na+-K+-ATPase和CYTO的含量、密度 、分布范围和活性降低。肺细胞内Na+-K+-ATPase与离子转运密切相关。该酶活性的 改变直接影响细胞膜内外Na+、K+、等离子的浓度和分布[6]。CYTO是线粒体(M itochondria,MIT)内膜上的镶嵌蛋白质，是MIT电子传递链的主要环节。CYTO活性降低时， 肺 细胞中MIT氧化一磷酸化障碍，合成ATP的能力降低。作为细胞各种反应的原动力ATP减少将 对细胞产生一系列继发性影响[7]。PE-SWD组中肺内细胞肿胀、胞膜受损、MIT嵴 肿胀、断裂、空泡化等病理改变与肺Na+-K+-ATPase和CYTO活力降低，导致细胞内Na +增多有关。当细胞内Na+增多时，可诱发Ca2+平衡失调，使原有的细胞内钙超载 更为严重，加速和加重PE-SWD不断发生和发展(见图2)。ALP是一组水解磷酸键的碱性磷酸 酶，广泛位于细胞膜上，与物质转运密切相关。通过影响细胞膜上载体蛋白磷酸化，参与物 质跨膜运动的调控。PE-SWD时肺内ALP活性增强，提示细胞膜的转运功能增强，可视为缺 氧机体发生的一种代偿性反应[8]。
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图2 海水淹溺肺水肿发生机理网络图
Fig 2 Mechanism network of PE-SWD
PE-SWD组中Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞Ca2+沉淀物明显增加 ，表明海水淹溺引起了细胞内钙超载。细胞内Ca2+浓度与细胞受损程度呈现正相关， 细胞内Ca2+过量积聚可引起组织器官结构和功能严重障碍。PE-SWD肺细胞内钙超载 的机理尚无定论，可能与低氧血症和酸中毒有密切关系。在缺氧状态下，肺内Na+-K+ -ATPase活力降低，细胞内Na+大量积聚，Na+、Ca2+交换增强，细胞外Ca2+ 大量内流，造成细胞内钙超载；肺内CYTO活性降低，细胞内线粒体氧化一磷酸化障碍 ，ATP生成减少，Ca2+效应降低而造成细胞内Ca2+增多；肺泡上皮和肺毛细血 管内皮受损，细胞膜通透性增加，Ca2+内流增多引起细胞内钙载超(见图3)。
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图3 PE-SWD肺酶活力、Ca2+内流和基因表达
Fig 3 Interrelation of enzyme activity, calcium overload in the cells and gene expression in the lungs after PE-SWD
PE-SWD组中兔肺上皮细胞中c-fos mRNA和fos蛋白的阳性反应面积(A1)、 阳性反应区积 分光密度(D1)和阳性反应区光密度(D2)3项参数明显增高。表明该基因在转录和释译水 平方面的表达显著增强，c-fos mRNA和fos蛋白明显增多(表3)。Ca2+内流是造成c- fos基因表达增强的重要原因，Ca2+-fos传导途径是PE-SWD应激反应的重要组成环 节。当细胞膜Ca2+通道开放，细胞外大量Ca2+进入细胞内，结合胞质中的钙调 素，可诱发c-fos基 因表达，其快速表达可形成大量fos蛋白。fos蛋白是一种能调节核内其 它基因表达的反式作用因子，与细胞内另一种核蛋白jun结合，形成异源二聚体Fos/jun，即 激活剂蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)。AP-1是转录因子，通过与特殊DNA序列结 合而调节目的基因表达，使快速短暂的刺激发挥长时程效应[9]。进而导致PE-SW D不断发展和恶化(见图3)。
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综上所述，海水损伤性作用、低氧血症和代谢性酸中毒是PE-SWD发生机制中 三大重要因素。肺内Na+-K+-ATPase和CYTO活力降低和细胞内钙超载既是前三种因素 造成的直接恶果，又是加重PE-SWD发生发展的继发性原因。Ca2+-fos传导途径是PE -SWD应激反应的重要环节，使快速短暂的病理生理变化发挥长时程效应，导致PE-SWD不断 发展和恶化，应引起临床救治工作者的高度重视。
中国人民解放军总后医药卫生立项课题(96M036)
参考文献
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8，董文度，陈峰，徐根兴等.高压氧中毒小鼠脑微血管图像分析定量研究.中 国病理生理杂志.1996；12∶433
9，陈 瑷，周 玖.氧化应激与c-fos和 c-jun转录和AP-1激活，生物化学与生物物理进展，1995；5∶386
(收稿：1999-10-13 修回：2000-04-03), 百拇医药
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关键词：肺水肿；海水淹溺；细胞色素氧化酶；c-fos基因
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Study on the Mechanism of Pulmonary Edema after Seawater Drow ning in Rabbit
Dong Wendu Liu Xingjuan Fu Gengfeng Ding Yong Zhang Minhua Luo Yun Wang Yan Liu Hong Xu Genxing Zhao Zengrong Yuan Jianan
(Institute of Molecular Medicine, Nanjing Military Medical College of the Second Military Medical University, Nanjing 210099)
Abstract To study the mechanism of pulmonary edema after s eawater drowning (PE-SWD), the indexes of blood-gas and acid-base in rabbits arter y blood were measured by the blood-gas analyser. The activity of Na+-K+- ATPase, cytochrome oxidase(CYTO) and alkaline phosph arase(ALP) in the lungs were measured and analysed by computer image system. C-fos mRNA and Fos protein in the lungs were respectively determined by situ hybrioization and immunohisto che m ical techniques. The distribution of phospholipid and Ca2+ of rabbits lung s was quantitatively analysed by ultrastructual location method. The results sho wed that, five parameters of PaO2, oxygen saturation(SaO2), pH, actual bicar bonite(AB) and base excess(BE) and the activity of Na+-K+-ATPase and CYTO d ecreased remarkably in PE-SWD. Both c-fos mRNA and Fos protein expression in p ulmonary epithelial cells in PE-SWD were significantly elevated compared with t he normal controls(P<0.01). The phospholipids products in the pulmonary alv eolar type Ⅱ epithelial cells were decreased, however, the Ca2+ precipit ate pellets inside the lung capillary endothelial cells and the pulmonary alveol ar type Ⅰ and Ⅱ epithelial cells increased obviously. The arthors suggest that the injuny action of the seawater, hypoxia and metabolic acidosis may be the mi an three mechanisms of the pulmonary edema induced seawater drowning. The loweri ng activity of Na+-K+-ATPase and CYTO in the lungs and calcium overload in the cells are not only evil consequence resulted from above three factors, but also the importent causes leading to the worse of PE-SWD. The transmiting line of Ca2+-fos may be also a key link to bring about the worse of PE-SWD.
, 百拇医药
Key words Pulmonary edema Seawater drowning Cytochrome ox idase C-fos gene
1 引 言
本研究在连续观察兔海水淹溺肺水肿(Pulmonary edema after seawater drowning, PE-SW D)动脉血气和酸碱指标变化的基础上，对兔肺Na+-K+-ATPase、细胞色素氧化酶(Cy tochrome oxidase, CYTO)、碱性磷酸酶(Alkaline phospharase, ALP)、c-fos mRNA和Fos 蛋白进行自动检测和定量分析。对肺磷脂和Ca2+的分布进行定位定量观察。对肺损伤 程度和组织形态变化进行系统的病理学观察。旨在揭示FE-SWD的发生机制，为PE-SWD的救 治提供科学依据。
2 材料和方法
, 百拇医药
实验动物为一级纯种新西兰兔(由江苏省农科院动物实验中心提供)18只，雄性，体重(2.48 ±0.24) kg。随机分为PE-SWD组14只和不灌海水对照组(Normal control, NC)4只。海水 取自东径120.3°北纬36.1°的胶洲湾海域，含盐度为3.0-3.5%。
2.1 模型复制
20%氨基甲酸乙酯(1.0 g/kg体重)耳缘静脉注射麻醉，气管切开插入“Y”型玻璃套管。右股 动脉插入塑料导管供取血用。用20 ml注射器连接20 cm塑料管插入“Y”型气管套管内，快 速向兔肺内灌入海水4 ml/kg，1 min内灌完，复制出PE-SWD动物模型[1]。
2.2 血气和酸碱指标检测
每只兔在灌海水前及灌海水后不同时间分别由股动脉取血0.5 ml。用ABL-Ⅲ型血气酸碱分 析仪对动脉血氧分压(PaO2)、二氧化碳分压(PaCO2)、血氧饱和度(Oxygen saturation SaO2)、pH、实际碳酸氢盐(Actual bocarbonate.AB)和剩余碱(Base excess, BE)等6项指 标进行检测。
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2.3 肺酶定量测定
两组兔肺Na+-K+-ATPase、CYTO和ALP细胞化学反应和图像定量测定9种参数按照徐根 兴建立的方法进行[2]。参数分别为(1)酶阳性反应面积(A1)； (2)酶阴性反应面积(A2)；(3)酶阳性反应区平均灰度 (G1)；(4)酶阴性反应区平均灰度(G2)；(5)酶阳 性反应区最大灰度(G4)；(6)酶阳性反应区最小灰度(G5)；( 7)酶阳性反应区灰度范围(G6)；(8)酶阳性反应区积分光密度( D1)；(9)酶阳性反应区光密度(D2)。上述参数均由 图像分析仪自动测量，由计算机对各组参数进行F检验。若两组参数方差不齐，用t′检 验，反之则用t检验。
2.4 c-fos基因表达水平的图像分析
, 百拇医药
c-fos mRNA和蛋白原位杂交、免疫组化和图像分析按照参考文献2和3中的方法进行。
2.5 肺磷脂和Ca2+超微结构观察
从两组肺下叶背侧取材，按照改进的磷脂和Ca2+超微结构定位方法处理[2] 。EPON812包埋，超薄切片，不经铀-铅电子染色，直接在JEM-100S型及带有能谱仪的JEM -200CX透射电镜下进行观察和能谱分析。
2.6 肺组织形态学观察
从两肺下叶背侧取材，常规固定制片，进行光镜、电镜观察。
3 结果
3.1 PE-SWD时血气和酸碱指标变化
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灌海水后30 min，兔PaO2和SaO2显著下降，尔后虽有缓慢回升趋势，但仍处于较低水平 。动脉血pH、AB和BE均在灌海水后10 min明显下降，且呈进行性下降趋势(见表1)。
表1 海水淹溺肺水肿时血气和酸碱指标变化(
±s,n=14)Table 1 Changes of blood-gas and acid-base indexes during pulmonary ede ma after seawater drowning Time(min)
PaO2(kPa)
PaCO2(kPa)
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SO2(%)
pH
AB(mmol/L)
BE(mmol/L)
Before infusion
11.19±0.53
5.10±0.21
94.49±1.58
7.37±0.02
23. 37±1.41
-1.66±1.69
, 百拇医药
After infusion
10
3.78±0.54**
6.98±0.55**
45.29±12.86**
7.28±0.03**
17.82±2.69 **
-6.84±3.31**
30
3.65±0.47**
, 百拇医药
6.94±0.33**
40.00±13.77**
7.19±0.04**
15.98±2.79 **
-11.68±3.88**
60
4.77±1.16**
4.33±0.31**
55.67±13.92**
, 百拇医药
7.20±0.03**
12.89±2.54 **
-14.47±2.83**
90
5.42±0.96**
3.83±0.24**
61.91±12.82**
7.19±0.07**
10.63±2.69 **
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-16.70±3.53**
120
6.38±0.92**
3.23±0.62**
66.61 ±11.13**
7.16±0.07**
8.28±2.96**
-19.61±3.78**
Compared with before infusion ** P<0.01
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3.2 PE-SWD对肺3种酶的影响
酶的定位分布显示，Na+-K+-ATPase反应产物主要位于细胞膜上，CYTO反应产物主要 位于线粒体中，ALP产物主要分布于Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮和肺毛细血管内皮细胞膜上。PE-SWD 组中Na+-K+-ATPase和CYTO含量和活力降低。而ALP阳性反应面积和阳性反应区积分光 密度则显著增高(见表2)。图像分析仪灰度级为0-255级，酶阳性反应越强，测量得到的 灰度值就越低，反之则灰度值就越高[2]。表2 海水淹溺肺水肿时肺三种酶活力的变化(
±s)Table 2 Changes of Na+-K+-ATPase, CYTO and ALP activity in the lung s during pulmonary edema after seawater drowing
, 百拇医药
Parameter item
Na+-K+-ATPase
CYTO
ALP
NC
PE-SWD
NC
PE-SWD
NC
PE-SWD
A1 Area of enzyme positive
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reaction(μm2)
80 .72±21.24
35. 59±10.91**
84.45±10.95
39.83±8.74**
56.36±10.50
81.91±15.31**
A2 Area of enzyme negative reaction(μm2)
1188. 42±21.42
, 百拇医药
12 33.55±10.91**
1184.70±10.95
1229.31±8.74**
1212.78±10.50
1187.23±15.31**
G1 Average grey of enzyme positive reaction area
7 0.79±2.77
70.07±4.02**
83.75±2.40
, 百拇医药
85.61±3.84*
9 5.03±2.63
93.13±1.85**
G2 Average grey of enzyme negative reaction area
1 03.42±2.52
105.41±1.75**
107.20±1.89
108.87±2.68
106.50±1.73
, 百拇医药
106.00±1.28
G4 Maximal grey of enzyme positive reaction area
7 7.92±2.50
81.67±3.17**
88.83±2.02
89.58±3.23
96.9 4±2.12
95.89±1.55*
G5 Minimal grey of enzyme positive reaction area
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5 2.17±5.91
64.06±6.46**
66.92±4.70
73.58±5.99**
86.64±4.18
81.44±8.75**
G6 Grey range of enzyme positive reaction area
25. 75±5.34
17 .61±3.93**
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21.92±3.73
16.00±4.82**
10.31±2.94
14.44±8.19**
D1 Integral luminosity of enzyme positive reaction area
73597.83 ±19280.48
35186.44±10140.04**
913 58.33±12503.91
43967.56±9853.66**
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69127.72±12984.34
93568.56±19050.86**
D2 Luminosity of enzyme positive reaction area
11. 18±0.25
10 .43±0.29**
11.41±0.14
10.67±0.22**
11.13±0.19
11.48±0.20**
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PE-SWD组与NC组比 PE-SWD group vs NC group * P<0.05 ** P <0.01
3.3 c-fos基因在PE-SWD兔肺中的表达水平
C-fos mRNA原位杂交的阳性反应区定位在细胞质中，颜色反应呈淡黄色 。图像定量分析结果显示，PE-SWD组兔肺上皮细胞中c-fos mRNA和Fos蛋白含量均有 显著增加(见表3)。表明c-fos基因表达在转录和翻译水平方面显著增强。表3 海水淹溺肺水肿组兔肺c-fos基因表达图像定量分 析(
±s)Table 3 Image quantitative analysis of c-fos gene expression in rabbits lungs during PE-SWD group
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Parameter item
c-fos mRNA
fos-protein
NC
PE-SW D
NC
PE-SWD
A1 Area of positive reaction(μm2)
155.93±40.21
325.46±145.18**
, 百拇医药
59.76±24.50
128.93±26.87**
A2 Area of negative reaction(μm2)
1113.21±40.21
943.68±145.18 **
1209.37±24.50
1145.21±26.87**
G1 Avemge grey of positive reaction area
, 百拇医药
85.02±2.62
81.67 ±4.95**
85.47±2.49
69.86±3.62**
G4 Maximal grey of positive reaction area
88.68±2.46
88.25 ±2.82
90.67±1.57
80.11±2.49**
G5 Minimal grey of positive reaction area
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65.67±12.86
61.25 ±10.12
64.89±10.51
37.11±7.03**
G6 Grey range of positive reaction area
23.00±14.70
27.00±8,75
25.78±9.97
43.00±6.06**
D1 Integral luminosity of positive reaction area
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171267.00±45399.41
338960.7±142458.39**
65384.42±25 435.28
112001.54±26347.02**
D2 Luminosity of positive reaction area
12.01±0.29
1.65±0.43**
11.01±0.40
11.60±0.26**
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PE-SWD组与NC组比 PE-SWD group vs NC group ** P<0.01
3.4 两组肺磷脂和Ca2+超微结构变化
3.4.1 肺磷脂反应 NC组肺泡Ⅱ型细胞板层小体、肺泡上皮细胞表面 可见有较多的磷脂沉淀物，有的连成一片形成片层结构。用能谱仪进行X射线微区元素分析 ，表明含有Pb峰和Fe峰，证明磷反应的特异性。PE-SWD组肺Ⅱ型细胞板层体部分破坏或有 排空现象，磷脂反应产物明显少于NC组，但毛细血管腔内磷脂反应产物明显多于NC组。
3.4.2 Ca2+沉淀反应 PE-SWD组Ⅰ 、Ⅱ型肺泡上皮和毛细血管内皮Ca2+沉淀物明显多于NC组，两肺巨噬细胞内Ca2+ 沉 淀颗粒明显少于NC组。
3.5 肺形态结构变化
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肺表面淡红色，可见暗红色片状区和出血区，以肺下叶背侧为甚。切面呈暗红色，有粉红色 水肿液溢出。
3.5.1 光镜变化 肺泡腔及肺间质水肿；局灶性肺不张代偿 性肺气肿；肺泡壁毛细血管扩张、充血及肺泡泡腔内出血；肺间质炎细胞浸润及肺泡腔炎细 胞渗出。
3.5.2 电镜观察 Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮受损、胞体肿胀，板层 小 体多被破坏或有排空现象；肺毛细血管内皮细胞肿胀，胞膜明显受损；线粒体嵴肿胀、断裂 、有空泡化现象；血管基底膜暴露，管腔内有血小板聚集、附壁现象。
4 讨论
灌海水后动物出现呼吸困难、呼吸频率明显增加，紫绀明显，两肺布满湿罗音，气管内溢出 泡沫状液体。PaO2、SaO2、pH、AB 5项指标显著降低(表1)，表现出严重的进行性低氧 血症和代谢性酸中毒。结合肺病理形态变化，表明发生了PE-SWD[4，5]。PE-SWD 既不属于单纯流体静压性肺水肿，又不属于单纯通透性肺水肿，属于混合性肺水肿。其形成 过程为：海水被吸入肺内首先引起肺泡腔水肿，继而海水渗入肺间质引起肺间质水肿，此为 原发性PE-SWD。由于海水的高渗作用和/或肺毛细血管的通透性增加。使肺毛细血管内的 液体转移至肺间质增多，进一步发展为继发性PE-SWD(见图1)。
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图1 PE-SWD的形成和转归
Fig 1 Formation and transformation of PE-SWD
PE-SWD发生机制较为复杂，可能与下列四大因素有关(图2)。(1)[ STBZ〗海水的直接 作用：海水淹溺时由于吸气动作，海水被直吸入肺内形成肺泡腔和肺间质水肿。这一阶段肺 水肿持续时间短，随后因其它因素的参与而发生变化。(2)肺组织液渗透 压增高：海水含盐 度高达30%左右，当吸进肺内后，造成肺组织液渗透压高于血浆渗透压3倍之多，致使毛细血 管内的水迅速转移至肺间质或肺泡腔，形成继发性PE-SWD，此时肺内水肿液既有吸入的海 水，又有毛细血管内液的渗出，较之原发性PE-SWD更为严重。(3)肺毛细 血管通透性增加： 由于肺毛细血管内液体外渗，致使血液浓缩，血流淤滞，微循环障碍，发生循环性缺氧，与 PE-SWD原有的乏氧性缺氧合并存在，形成混合性缺氧。在缺氧和酸中毒的影响下，肺毛细 血管内皮细胞严重受损，毛细血管通透性增加，血管内水外渗增多，加重原发性PE-SWD的 程 度。(4)肺毛细血管内压增高：肺泡腔和肺间质水肿不断发生和发展，造 成肺静脉和肺毛细 血管受压扭曲和变形，肺毛细血管内压升高，组织液生成增多，肺水肿更为严重。当肺内液 体增多，肺重量增加，体积增大，肺包膜紧张度增加时，致使肺表面淋巴管受压扭曲，造成 肺淋巴回流障碍。这可能也是加重PE-SWD的重要因素之一。
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肺内Na+-K+-ATPase和CYTO活性降低是PE-SWD发生机制中很值得注意的一个问题。在 PE-SWD组中，两种酶的阳性反应面积(A1)、阳性反应区积分光密度(D1)和阳性反应区 光 密度(D2)三项参数显著降低(表2)，G1、G2、G4和G5等4项灰度参数明显升高(实 际表明酶活性降低)。这足以说明PE-SWD引起肺Na+-K+-ATPase和CYTO的含量、密度 、分布范围和活性降低。肺细胞内Na+-K+-ATPase与离子转运密切相关。该酶活性的 改变直接影响细胞膜内外Na+、K+、等离子的浓度和分布[6]。CYTO是线粒体(M itochondria,MIT)内膜上的镶嵌蛋白质，是MIT电子传递链的主要环节。CYTO活性降低时， 肺 细胞中MIT氧化一磷酸化障碍，合成ATP的能力降低。作为细胞各种反应的原动力ATP减少将 对细胞产生一系列继发性影响[7]。PE-SWD组中肺内细胞肿胀、胞膜受损、MIT嵴 肿胀、断裂、空泡化等病理改变与肺Na+-K+-ATPase和CYTO活力降低，导致细胞内Na +增多有关。当细胞内Na+增多时，可诱发Ca2+平衡失调，使原有的细胞内钙超载 更为严重，加速和加重PE-SWD不断发生和发展(见图2)。ALP是一组水解磷酸键的碱性磷酸 酶，广泛位于细胞膜上，与物质转运密切相关。通过影响细胞膜上载体蛋白磷酸化，参与物 质跨膜运动的调控。PE-SWD时肺内ALP活性增强，提示细胞膜的转运功能增强，可视为缺 氧机体发生的一种代偿性反应[8]。
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图2 海水淹溺肺水肿发生机理网络图
Fig 2 Mechanism network of PE-SWD
PE-SWD组中Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞Ca2+沉淀物明显增加 ，表明海水淹溺引起了细胞内钙超载。细胞内Ca2+浓度与细胞受损程度呈现正相关， 细胞内Ca2+过量积聚可引起组织器官结构和功能严重障碍。PE-SWD肺细胞内钙超载 的机理尚无定论，可能与低氧血症和酸中毒有密切关系。在缺氧状态下，肺内Na+-K+ -ATPase活力降低，细胞内Na+大量积聚，Na+、Ca2+交换增强，细胞外Ca2+ 大量内流，造成细胞内钙超载；肺内CYTO活性降低，细胞内线粒体氧化一磷酸化障碍 ，ATP生成减少，Ca2+效应降低而造成细胞内Ca2+增多；肺泡上皮和肺毛细血 管内皮受损，细胞膜通透性增加，Ca2+内流增多引起细胞内钙载超(见图3)。
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图3 PE-SWD肺酶活力、Ca2+内流和基因表达
Fig 3 Interrelation of enzyme activity, calcium overload in the cells and gene expression in the lungs after PE-SWD
PE-SWD组中兔肺上皮细胞中c-fos mRNA和fos蛋白的阳性反应面积(A1)、 阳性反应区积 分光密度(D1)和阳性反应区光密度(D2)3项参数明显增高。表明该基因在转录和释译水 平方面的表达显著增强，c-fos mRNA和fos蛋白明显增多(表3)。Ca2+内流是造成c- fos基因表达增强的重要原因，Ca2+-fos传导途径是PE-SWD应激反应的重要组成环 节。当细胞膜Ca2+通道开放，细胞外大量Ca2+进入细胞内，结合胞质中的钙调 素，可诱发c-fos基 因表达，其快速表达可形成大量fos蛋白。fos蛋白是一种能调节核内其 它基因表达的反式作用因子，与细胞内另一种核蛋白jun结合，形成异源二聚体Fos/jun，即 激活剂蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)。AP-1是转录因子，通过与特殊DNA序列结 合而调节目的基因表达，使快速短暂的刺激发挥长时程效应[9]。进而导致PE-SW D不断发展和恶化(见图3)。
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综上所述，海水损伤性作用、低氧血症和代谢性酸中毒是PE-SWD发生机制中 三大重要因素。肺内Na+-K+-ATPase和CYTO活力降低和细胞内钙超载既是前三种因素 造成的直接恶果，又是加重PE-SWD发生发展的继发性原因。Ca2+-fos传导途径是PE -SWD应激反应的重要环节，使快速短暂的病理生理变化发挥长时程效应，导致PE-SWD不断 发展和恶化，应引起临床救治工作者的高度重视。
中国人民解放军总后医药卫生立项课题(96M036)
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