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编号:10273826
溶血磷脂酰胆碱对内皮细胞表面粘附分子表达的影响
http://www.100md.com 《生物医学工程学杂志》 2000年第2期
     作者:陈友琴 陈槐卿 吴立志

    单位:陈友琴(云南省大理医学院);陈槐卿 吴立志(华西医科大学 生物医学工程研究室,成都 610041)

    关键词:内皮细胞;溶血磷脂酰胆碱;细胞间粘附分子;血管细胞粘附分子;E-选择素

    生物医学工程学杂志000206 摘要 大量的单核细胞募集是动脉粥样损伤形成的早期表现之一,相关的内皮细胞粘附分子在其中具有积极作用。本文研究了溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine, Lyso-PC)对培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)膜上细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、E选择素(Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1,ELAM-1,E-selectin)和血管细胞粘附分子(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)表达的影响。用流式细胞仪分析Lyso-PC介导的粘附分子表达的变化。结果显示:与基础水平相比,用Lyso-PC处理后的HUVECs表面ICAM-1和VCAM-1的表达增加,50 μg/ml的Lyso-PC刺激1 h后介导ICAM-1和VCAM-1最大表达,但3 h后则下降到基础水平以下;而Lyso-PC对E-selectin的表达无显著影响,仅在50 μg/ml的Lyso-PC刺激3 h后开始显著上调。表明Lyso-PC可以选择性地诱导内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达,提示Lyso-PC不仅能够趋化单核细胞,而且还能介导单核细胞与内皮细胞粘附,在动脉粥样硬化中起到重要作用。
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    Effect of Lysophosphatidylcholine on Endothelial Cell Surface

    Expression of Adhesion Molecules

    Chen Youqin Chen Huaiqing Wu Lizhi

    (Institue of Biomedical Engineering, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)

    Abstract Extensive monocyte recruitment is an early phenomenon associated with the development of atherosclerotic lesion, in which adhesion molecules expressed by endothelial cell play an active role. In this study we examined the effects of Lysophosphatidylcholine(Lyso-PC), a major phospholipid component of atherogenic lipoproteins, on the expression of adhesion molecules for monocytes, such as intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1),endothelial-leukocyte adhesion molecule-1(E-selectin) and vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1), in cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVECs). After treating HUVECs with different concentration Lyso-PC at different times, the expression of adhesion molecules on the surface of HUVECs induced by Lyso-PC were analyzed using flow cytometry. The results showed that compared with control group, the surface expression of ICAM-1 and VCAM-1 was increased on HUVECs treated with Lyso-PC. ICAM-1 and VCAM-1 expression was maximally induced 1 h after stimulated with 50 μg/mg Lyso-PC, compared to basal values. At the 3 h after stimulation, ICAM-1 dropped to basal level while VCAM-1 dropped below to basal level. The effects of Lyso-PC on E-selectin expression were negligible with in 3 h. However, at the 3 h of treatment with 50 μg/ml, the E-selectin expression on HUVECs began to be up-regulated significantly. We conclude that in addition to its monocyte chemoattractant activity, Lyso-PC can selectively induce ICAM-1 and VCAM-1 expression on the surface of HUVECs. Lyso-PC may play an important role in monocyte recruitment into athersclerotic lesions.
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    Key words Endothelial cells Lysophosphatidylcholine(Lyso-PC) Intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1(E-selectin) Vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1)

    1 引 言

    动脉粥样硬化(Atherosclerosis, As)的形成涉及许多过程。近年来,随着分子生物学的迅速发展,As发生机制中细胞粘附机制已经受到人们的重视。在As的发生发展中与血管内皮细胞相关的粘附成分有白细胞、血小板和红细胞,其中白细胞的粘附可能起着较为重要的作用。体外实验证明三种分子:细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1,CD54)、E选择素(Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1, ELAM-1,E-selectin,CD62E)和血管细胞粘附分子(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1,CD106)可在内皮细胞上诱导表达,并且有助于各种白细胞、包括单核细胞的粘附[1]。单核细胞与内皮细胞的粘附和跨壁转移是动脉粥样硬化形成机制的第一步。基础研究、临床研究和流行病学研调查表明:氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein, Ox-LDL)在众多致As病变因素中作用最为重要。最近的研究表明,Ox-LDL能够诱导血管内皮细胞和白细胞生成粘附分子,介导白细胞和血管内皮细胞的粘附作用,粘附分子对As早期病变形成有重要作用[2,3]。LDL在磷酸脂酶A2作用下,LDL中脂质过氧化物显著升高,LDL中大量卵磷脂转化为Lyso-PC,Lyso-PC亦是轻度修饰低密度脂蛋白(Minimally modified LDL,mm-LDL)和Ox-LDL的重要成分。为此我们研究了Lyso-PC对内皮细胞粘附分子表达的影响,为了解体内发生于血管壁的As的病理生理过程中粘附分子表达的调控机制提供依据。
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    2 材料与方法

    2.1 主要试剂与仪器

    FITC-抗CD54(ICAM-1)、PE-抗CD62E和FITC-抗CD106的单克隆抗体(Immunotech,美国)、溶血磷脂酰胆碱(Lyso-PC,Sigma,美国)。其它细胞培养试剂(GBICO BRL,美国)。

    流式细胞仪(ELITE ESP,Coulter,美国)。

    2.2 内皮细胞的培养及鉴定

    按Jaffe等[4]的方法,本室加以改进。培养的细胞在相差显微镜下呈多角形,单层铺路石状排列;透射电镜下,胞浆内有Weibel-Palade小体;免疫组化染色Ⅷ因子相关抗原阳性。

    2.3 Lyso-PC对内皮细胞的作用
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    无菌条件下将培养有单层内皮细胞的载玻片分别用浓度为10、30、50 μg/ml的Lyso-PC的M199培养液处理,在37 ℃、5%CO2条件下分别孵育30、60、180 min。

    2.4 内皮细胞膜表面ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达的检测

    2.4.1 荧光染色 将实验处理后培养有单层内皮细胞的载玻片用无酚红的Hanks液冲洗两遍,以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化内皮细胞,200 g条件下离心取沉淀,用饱和浓度的荧光标记的抗CD54、CD62E和CD106单克隆体,4 ℃避光条件下处理20 min,加入PBS混匀,调整细胞悬液浓度为2×105/ml。

    2.4.2 流式细胞仪测定 采用荧光标记的抗CD54、CD62E和CD106单克隆抗体,在流式细胞仪上检测荧光强度,荧光强度值分别与CD54、CD62E和CD106的含量相关,用平均荧光强度表示细胞表面各种粘附分子的表达量。
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    2.5 结果处理

    以对照组培养的内皮细胞的平均荧光强度值为100%,各处理条件下的相应数值与之相比较,相对值用配对t检验进行统计学处理,P<0.05为显著性差异。

    3 结 果

    3.1 Lyso-PC对内皮细胞表面ICAM-1表达的影响

    由图1可以看出,与未刺激细胞的基础水平相比,Lyso-PC处理后内皮细胞表面ICAM-1表达水平的增加具有时间和剂量依赖性。用50 μg/ml的Lyso-PC处理1 h后得到ICAM-1表达的最大峰值,ICAM-1的表达量随着Lyso-PC的作用时间增加而下降,到3 h ICAM-1则下降到基础水平。不同浓度作用下,内皮细胞表面ICAM-1的表达量在各时间点具有显著性差异。另外,10 μg/ml和30 μg/ml的Lyso-PC作用下的时间过程曲线有着大致相同的趋势。
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    3.2 Lyso-PC对内皮细胞表面VCAM-1表达的影响

    由图2可以看出,与未刺激细胞的基础水平相比,Lyso-PC处理后内皮细胞表面VCAM-1的表达水平的增加,且具有时间和剂量依赖性。用50 μg/ml的Lyso-PC处理1 h后得到VCAM-1表达的最大峰值,VCAM-1的表达量随着Lyso-PC的作用时间增加而下降,到3 h VCAM-1则下降到基础水平之下(P<0.01)。50 μg/ml的Lyso-PC与10 μg/ml和30 μg/ml的Lyso-PC介导的表达具有显著性差异。10 μg/ml和30 μg/ml的Lyso-PC作用下的时间曲线基本相似。

    图1 不同浓度Lyso-PC对内皮细胞表面ICAM-1表达的影响

    Fig 1 Effects of Lyso-PC on ICAM-1 surface expressioin
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    of endothelial cells

    Compared with the value of that without biochem-

    ical stimulus:  P<0.01

    图2 不同浓度Lyso-PC对内皮细胞表面VCAM-1表达的影响

    Fig 2 Effects of Lyso-PC on VCAM-1 surface expression

    of endothelial cells

    Compared with the value of that without biochem-
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    ical stimulus:  P<0.01

    图3 不同浓度Lyso-PC对内皮细胞表面E-selectin表达的影响

    Fig 3 Effect of Lyso-PC on E-selectin surface expression

    of endothelial cells

    Compared with the value of that without biochem-

    ical stimulus:  P<0.01

    3.3 Lyso-PC对内皮细胞表面E-selectin表达的影响
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    由图3可以看出,10 μg/ml和30 μg/ml的Lyso-PC处理对内皮细胞表面E-selectin的表达没有影响,但在50 μg/ml的Lyso-PC作用3 h后,E-selectin呈现显著上调。

    4 讨 论

    白细胞与血管内皮细胞的粘附是近年来研究热点之一。这两种细胞的相互作用直接涉及炎症、缺血、动脉粥样硬化形成等病理过程,单核细胞衍生的泡沫细胞在动脉内膜斑块区域的募集是早期动脉粥样硬化形成的关键过程之一。在多种高胆固醇As动物模型中,循环着的单核细胞与动脉内皮的粘附可能先于早期泡沫细胞损伤的形成[5,6]。其分子机制并不完全明了,可能与内皮和单核细胞上粘附分子变化有关[7,8]。Martin等[9]发现用LDL孵育人胸主动脉内皮细胞,可以增加内皮细胞可溶性ICAM-1的表达,且单核细胞与内皮细胞的粘附对LDL呈剂量依赖性。实验还发现[10],在高胆固醇As兔mm-LDL可以在血管内膜下巨噬细胞聚集并吞噬脂质形成泡沫细胞前诱导内皮细胞VCAM-1的表达。Sakai等[11]研究了高胆固醇As兔和遗传性高脂血症兔两种模型,发现P-选择素和VCAM-1在胸主动脉内皮细胞的表达先于内膜下单核巨噬细胞和T淋巴细胞聚集,而E-选择 素此时尚检测不到。O'Brine等[12]亦发现在人冠状动脉As斑块中E-选择素表达的量少于VCAM-1,这些结果表明mm-LDL通过促进细胞粘附分子的表达,增强单核细胞对内皮细胞的粘附、迁移,在As病变早期起着关键作用。Lyso-PC是氧化型LDL的重要成分,Kume等[13]报道Lyso-PC与培养的人胸主动脉内皮细胞孵育,可以诱导ICAM-1和VCAM-1的表达。我们在实验中发现Lyso-PC对ICAM-1和VCAM-1表达的影响有时间和剂量依从性,Lyso-PC(50 μg/ml)与内皮细胞孵育1 h,ICAM-1和VCAM-1的含量达一最大峰值,1 h后随时间的延长而下降,而E-selectin则在孵育3 h后开始显著上调,提示AS发生与Lyso-PC对三种粘附分子表达的不同调节有关。
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    近年来研究发现,蛋白激酶C(Protein kinase C, PKC)途径可能是Lyso-PC诱导粘附分子表达的关键[14]。Lyso-PC可激活细胞内PKC促进VCAM-1和ICAM-1的表达,增加氧自由基的产生,抑制内皮细胞一氧化氮的释放。PKC激活后,可以使NF-kB与其抑制因子IkB解离,NF-kB游离活化进入核内,结合靶基因特定序列,从而激活基因的转录反应[15]。Martin等[9]发现如先用维生素E与内皮细胞孵育再经LDL处理,可见单核细胞对内皮细胞的粘附随剂量增大而减少,ICAM-1的量亦减少,维生素E的抗粘附作用与减少ICAM-1的表达有关,说明抗氧化剂可抑制粘附分子的表达。研究资料表明抗氧化剂抑制粘附分子表达的作用机制可能与上述的PKC信号转导通路有关,例如,抗氧化剂(Pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)能特异性与NF-kB结合,抑制NF-kB的活化,从而抑制VCAM-1 mRNA的表达和蛋白合成[16]。结合文献报道和本文的实验结果,我们推测采用抗氧化剂抑制Lyso-PC诱导粘附分子表达可能会为AS的防治开辟一条新途径。
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    高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(97-58)

    陈友琴 博士研究生

    参考文献

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    (收稿:1999-06-25), 百拇医药