肝癌细胞侵袭行为与其流变特性相关
作者：罗向东 吴泽志 王宪航 张钢 龙勉 蔡绍皙
单位：罗向东(第三军医大学 烧伤研究所，重庆 400038)；吴泽志 王宪航 张钢 龙勉 蔡绍皙(重庆大学 生物工程学院，国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室，重庆 400044)
关键词：癌，肝细胞；胶原蛋白Ⅰ；Matrigel；肝血窦内皮细胞；细胞流变学
生物医学工程学杂志000205 摘要 以原代肝细胞、肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)细胞及对人工基底膜Matrigel具有侵袭能力的HCC细胞(HCC-Inv细胞)为研究对象，研究了三种细胞的粘弹特性、与胶原蛋白Ⅰ的粘附力学特性及与肝血窦内皮细胞(Liver sinosoidal endothelial cell, LEC)的粘附力学特性。结果发现，HCC细胞的上述流变特性较之于肝细胞发生明显的变化；与肝细胞及HCC细胞相比较，HCC-Inv细胞表现出高的粘弹特性，高的与胶原蛋白Ⅰ的粘附力，高的与LEC的粘附力；免疫细胞化学的结果证实了HCC细胞与HCC-Inv细胞形态与细胞骨架结构的差异。作者对肝癌细胞流变特性改变及病理学意义作了简要讨论。
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Invasion Behavior of Hepatocellular Carcinoma Cells Correlates with Their Rheological Properties
Wu Zezhi Wang Xianhang Zhang Gang Long Mian Cai Shaoxi
(College of Bioengineering, Chongqing University,Chongqing 400044)
Luo Xiangdong
(Burn Institute，The 3rdMillitary Medical University,Chongqing 400038)
Abstract We investigated the viscoelasticity,mechanics of adhesion to collagen I coated surfaces and mechanics of adhesin to liver sinosoidal endothelial cells(LECs) among primary culture human hepatocytes,hepatocellular carcinoma(HCC) cells as well as HCC-Inv cells,namely HCC cells capable of invading the artificial basement membrane,Matrigel.The results showed that the above-mentioned rheological properties of HCC cells differed obviously from those of normal hepatocytes.HCC-Inv cells exhibited higher viscoelastic coefficients,higher adhesion forces to collagen I coated surfaces as well as higher adhesion forces to LECs than those of normal hepatocytes and HCC cells.Immunocytochemistry showed the differences in cell morphology and cytoskeleton structure between HCC cells and HCC-Inv cells.A brief discussion was presented in relation to the changes in cell rheological properties of hepatocellular carcinoma cells and their pathological significance.
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Key words Carcinoma，hepatocellular Collagen I Matrigel Liver sinosoidal endothelial cells Cell rheology
1 引 言
恶性肿瘤的侵袭行为及机制是当今肿瘤学的前沿性研究课题。80年代，美国国立癌症研究所Liotta等人[1]提出了肿瘤细胞侵袭心指导和大力协助的三步设想，这使人们对肿瘤细胞的侵袭过程有了一个更清晰的认识。现今人们知道，肿瘤细胞的侵袭是以细胞的粘附、运动及变形为基础的复杂病理生理过程，其间伴随机体多种屏障机制的丧失。为了阐明恶性肿瘤细胞侵袭和转移的机制，人们重视研究肿瘤细胞的粘附、运动行为以及与之相关的肿瘤细胞粘附分子和细胞骨架的改变[2，3]，与此同时，在癌组织中作为肿瘤组织侵袭屏障和肿瘤细胞运动和变形的力学支撑结构的胞外基质也越来越引起人们广泛的研究兴趣[1，2]。尽管如此，对恶性肿瘤细胞侵袭和转移机制的认识还远未深入和完善。在这里，以新的研究手段从新的角度进行有关研究已成为必要。
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我们以原代培养肝细胞、肝癌(HCC)细胞以及对人工基底膜Matrigel具有侵袭能力的侵袭性肝癌细胞(HCC-Inv细胞)为研究对象，首先以微管吸吮技术(Micropipette aspiration technique)研究了3种细胞的粘弹特性、在胶原蛋白I裱衬表面和与肝血窦内皮细胞(LEC)的粘附力学特性，进一步，为了了解细胞流变特性改变与细胞骨架的关系，作者用抗生物素—生物素—过氧化酶复合物免疫细胞化学染色法(Avidin biotin-peroxidase complex technique，ABC法)考查了HCC细胞和HCC-Inv细胞微丝、微管及中间丝在胞内的状态。作者对肝癌细胞流变特性改变及其病理意义进行了简要讨论。
2 材料与方法
2.1 主要试剂及药品
胶原蛋白酶IV购自美国Sigma公司，以Hanks液配成0.05%的溶液备用。RPMI1640培养液购自美国Gibco公司，完全培养基含10%的小牛血清，0.03%的谷胺酰胺，100 单位/ml的青霉素及100 μg/ml的链霉素。多聚赖氨酸(Poly-D-lysine,PDL)购自美国Sigma公司，以三蒸水稀释至2 μg/ml后分装备用。胶原蛋白I购自美国Sigma公司，以0.1 N的醋酸(pH3.5)溶解后，用三蒸水稀释成500 μg/ml的储备液，临用前以三蒸水进一步稀释至工作浓度(1、2、5 μg/ml)。牛血清白蛋白(BSA)购自华美公司，以等渗磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.4)配成浓度为0.5%的溶液备用。Matrigel购自美国Collaborative Res公司，以RPMI1640培养液稀释至500 ng/ml备用。鼠抗人单克隆抗体Anti-β-tubulin购自德国宝灵曼公司，编号1111876，储备液浓度50 μg/ml，工作稀释度为1∶25；鼠抗人单克隆抗体Anti-actin购自德国宝灵曼公司，编号1378996，储备液浓度为1 000 μg/ml,工作稀释度为1∶100；鼠抗人多克隆抗体Anti-keratin购自重庆医科大学病理生理教研室，储备液浓度为1 000 μg/ml,工作稀释度为1∶45。ABC法免疫细胞化学试剂盒购自华美公司，批号6020。3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)显色试剂盒购自重庆医科大学病理生理教研室。其余试剂均为国产AR级。
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2.2 细胞分离、培养及细胞样品的制备
正常胎肝组织取自第三军医大学附属西南医院，肝组织经0.05%胶原蛋白酶IV消化后用分步离心沉降或等密度梯度离心的方法分离和纯化正常肝细胞[4，5]，LEC的进一步纯化采用在玻璃表面及PDL裱衬表面的选择性粘附的方法进行[5]。肝细胞以约2×105/ml的浓度接种于普通细胞培养皿，LEC以约1×106/ml的浓度接种于经下述PDL裱衬的园形小室的玻璃表面。以RPMI1640完全培养基常规培养，肝细胞经至少48 h的稳定贴壁培养后经制样用于微管吸吮实验，LEC经2～3 d形成融合单层后用于细胞粘附力学实验。
HCC细胞(SMMC7721)购自第二军医大学并在本实验室传代培养。HCC-Inv细胞的筛选采用Boyden小室法。Boyden小室上下室之间用孔径8 μm的无PVP聚碳酸酯膜(Neuro Probe公司，美国)隔开，膜上涂布500 ng/ml的Matrigel(人工基底膜)，下室加入NIH3T3细胞培养液，在上室内加入5万/0.5 ml肝癌细胞悬液，常规培养6～12 h，收集滤膜底面的细胞于下室内常规培养约10 d，HCC-Inv细胞密度增加并铺满下室底面。
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2.3 微管吸吮实验
2.3.1 细胞粘弹性实验 正常肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞经0.02%EDTA/0.05胰蛋白酶消化后以RPMI 1640细胞培养液制成细胞悬液，粘弹性实验参照先前报道的方法进行[6]。以K1、K2和μ作为表征细胞粘弹特性的客观物理量。
2.3.2 细胞在胶原蛋白I裱衬表面的粘附力测定 玻璃表面的裱衬：取一以玻璃为底表面的特制园形小室，在约0.5 cm2的园形区域内依次裱衬如下成分：(1)2 μg/ml的PDL200 μl，37 ℃裱衬40 min；(2)不同浓度(1、2、5 μg/ml)的胶原蛋Ⅰ200 μl，37 ℃裱衬30 min；(3)0.5%BSA 200 μl,37 ℃作用15 min。各步裱衬结束后均以PBS轻轻洗涤1～2次。制备好的裱衬小室在37 ℃的细胞培养箱内保存，于24小时内完成有关实验。
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粘附力的测定系将约0.5 ml浓度约1×105个细胞/ml的肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞悬液加入上述裱衬好的园形小室，37 ℃静置15 min后，轻轻吸出细胞悬浮液以去掉未粘附细胞，重新加入RPMI 1640培养液，将小室置于倒置显微镜载物台上进行微管吸吮实验。于显微镜下确定待实验的细胞后利用显微操作器引导微管尖端(内经约5～6μm)靠近细胞表面，通过压力控制系统产生一阶跃负压以吸吮细胞，使细胞的一小部分被吸入微管并密封管口，以显微操作器轻轻侧向牵引细胞离开其粘附的裱衬表面。逐步加大负压(步长5～10mmH2O)直至求得能使细胞与相应裱衬表面间粘附分离的临界负压值。在实验中，以电视摄像磁带记录的方式记录实验过程，经电视回放输入图像处理仪进行有关测量。整个微管吸吮实验在2 h内完成。
细胞粘附力采用下式计算：F=ΔΡπ(Rp)2。其中ΔP为细胞粘附分离的临界负压值，π为园周率，Rp为微管尖端内半径。
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2.3.3 细胞与LEC的粘附力测定 取出经方法1.2制备的含融合单层LEC的特制园形小室，丢弃培养液，以Hanks液清洗1～2次，分别加入浓度约1×105个/ml的肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞。37 ℃静置60 min，参照文献[7]及上述方法2.3.2进行细胞粘附力测定，选取细胞粘附于LEC靠近核的中央区域的粘附细胞对进行测量，压力步长为1～2 mmH2O。整个微管吸吮实验在2 h内完成。
2.4 免疫细胞化学实验[8]
将HCC细胞及HCC-Inv细胞分别接种于盖玻片上，2～3 d后即良好贴壁生长，选取细胞密度适中的玻片，微温热风干1 h，甲醛丙酮液常规固定2 min。以ABC法进行常规免疫化学染色[8]，明胶封片，油镜镜检，1000×照像。
2.5 统计学处理
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粘弹性及粘附力的结果以
±s表示，组间数据的比较采用两样本均数的t检验。
3 结 果
3.1 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞的粘弹特性
表1为肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞的粘弹性系数。从表中可见，3种细胞的弹性系数K1及K2均呈HCC-Inv细胞>HCC细胞>肝细胞的变化趋势，HCC细胞与肝细胞的粘性系数μ无显著性差异，HCC-Inv细胞的粘性系数μ较这HCC细胞和肝细胞呈明显升高(P<0.001)。
表1 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞的粘弹性系数
Table 1 Viscoelastic coefficients of hepatocytes,HCC cells and HCC-inv cells
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K1(N/m2)
K2(N/m2)
μ(N*S/m2)
n
Hepatocytes
87.5±12.1
33.3±10.3
5.9±3.0
24
HCC cells
103.6±12.6+++
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42.5±10.4++
4.5±1.9
30
HCC-Inv cells
134.4±21.1+++***
72.9±28.1+++***
9.5±4.5+++***
35
Compared with those of hepatocytes:++P<0.01；+++P<0.001；Compared with those of HCC cells:***P<0.001；n:nmuber of cells measured
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3.2 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力学特性
表2为肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞在不同浓度(1、2、5μg/ml)胶原蛋白Ⅰ裱衬表面上的粘附力。从表中可见：(1)肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞粘附力对胶原蛋白I裱衬浓度均有较好的依赖性。胶原蛋白I裱衬浓度从1 μg/ml增加至5μg/ml，肝细胞粘附力增加幅度为1333×10-10 N(196%)，HCC细胞为571×10-10 N(41%)，HCC-Inv细胞为728×10-10 N(50%)；(2)低浓度(1、2μg/ml)胶原蛋白Ⅰ裱衬时，HCC细胞粘附力大于肝细胞(P<0.001)，高浓度(5μg/ml)胶原蛋白Ⅰ裱衬时肝细胞与HCC细胞粘附力无明显差异。在所用的3个裱衬浓度，HCC-Inv细胞粘附力均较HCC细胞和肝细胞的相应粘附力值明显升高(P<0.05)。
表2 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力
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Table 2 Adhesion forces of hepatocytes,HCC cells and HCC-Inv cells onto collagen I coated surfaces
1μg/ml collagen I coated
surfaces(10-10N)
2μg/ml collagen I coated
surfaces(10-10N)
5μg/ml collagen I coated
suofaces(10-10N)
, http://www.100md.com Hepatocytes
681±93
(n=92)
1223±140
(n=85)
2014±197
(n=77)
HCC cells
1383±179+++
(n=111)
1622±244+++
(n=101)
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1954±302
(n=77)
HCC-Inv cells
1446±196+++*
(n=130)
2057±247+++***
(n=81)
2174±274+++***
(n=78)
Compared with those of hepatocytes:+++P<0.001；Compared with those of HCC cells:*P<0.05,***P<0.001；n:number of cells measured
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3.3 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞与LEC的粘附力学特性
表3为肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞与LEC的粘附力。从表中可见，HCC细胞粘附力较之肝细胞粘附力明显升高(P<0.001)，HCC-Inv细胞与LEC的粘附力较之肝细胞和HCC细胞都明显升高(P<0.001)。
表3 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞与LEC的粘附力
Table 3 Adhesion forces of hepatocytes,HCC cells and HCC-Inv cells to LEC
Hepatcytes
HCC cells
HCC-Inv cells
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Adhesion forces
20±4
27±4+++
41±7+++***
(10-10N)
(n=35)
(n=41)
(n=44)
Compared with those of hepatocytes:+++P<0.001；Compared with those of HCC cells:***P<0.001；n:number of cells measured
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3.4 免疫细胞化学染色
图1为HCC细胞及HCC-Inv细胞经ABC免疫细胞化学染色法显示的微管、微丝及中间丝的结构状态。从图中可见，HCC细胞形态呈较均匀的梭形，微丝(anti-actin)和中间丝(anti-keratin)染色均匀布满整个胞浆，可见张力纤维结构；微管(anti-β-tubulin)染色明显，均匀分布于胞浆，而以靠近核的中央区胞浆更明显。HCC-Inv细胞极度铺展，形态较不规则，部分细胞核浆比例明显增大，微丝和中间丝染色遍步于胞浆，张力纤维结构较HCC细胞增加，排列不规则较HCC细胞更明显；微管染色十分浅淡。
图1 HCC细胞(a,b,c)及HCC-Inv细胞(d,e,f)经鼠抗人anti-β-tubulin单克隆抗体(a,d)、anti-actin单克隆抗体(b,e)及anti-keratin多克隆抗体(c,f)ABC免疫细胞化学染色法显示的微管、微丝及中间丝的结构状态。×1000
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Fig 1 Demonstration of the structure of microtubule,microfilaments and intermediate filaments of HCC cells(a,b,c) and HCC-Inv cells (d,e,f)by means of avidin-biotin-peroxidase complex(ABC) technique with mouse monoclonal antibodies against human β-tubulin (a,d),human actin(b,e) and mouse polyclonal antibody against human keratin(c,f).×1000
4 讨 论
近20年有关领域的研究已使人们认识到，癌细胞侵袭是以细胞与胞外基质的粘附为始动步骤，通过胞内复杂信号通路触发细胞蛋白水解酶的分泌并进而引起癌细胞的运动和变形及其对基质的侵袭。细胞流变学是研究细胞的粘附、运动及变形的生物流变学的一个重要的分支，将细胞流变学的研究手段用于癌细胞侵袭的研究是一个初步的偿试，它对于从流变学的角度认识癌细胞侵袭的机制具有重要的意义。
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细胞的粘弹性是与其运动与变形能力有关的一个重要的细胞流变学指标，对于恶性肿瘤细胞而言，它可能影响到细胞的侵袭与转移能力。我们研究发现，HCC细胞的弹性系数较肝细胞大，而HCC-Inv细胞的弹性系数、粘性系数均较HCC细胞和肝细胞增高，这提示肝癌细胞侵袭性可能与较高的粘弹特性有关。癌细胞的粘弹特性与细胞骨架的相关关系是一个值得进一步深入研究的问题。由于免疫细胞化学及电子显微镜技术的应用，癌细胞及恶性转化细胞细胞骨架的改变早已引起研究者的重视[3]，我们以免疫细胞化学的方法也发现HCC-Inv细胞较之于普通HCC细胞的形态及细胞骨架结构发生改变。我们曾经以细胞松驰素D(CD)、秋水仙素(Col)及长春花碱(VBL)分别处理肝细胞及HCC细胞研究两种细胞粘弹性与其细胞骨架结构的相关性(文献[6]及另文发表资料)，结果发现CD作用引起微丝结构破坏后HCC细胞粘弹性系数下降幅度较肝细胞大，Col和VBL作用引起微管解聚后肝细胞粘弹性系数升高而肝癌细胞粘弹性系数下降，肝癌细胞受三种细胞骨架干扰剂作用后以CD引起粘弹性系数下降幅度最大。这说明微丝对于决定肝细胞和肝癌细胞的粘弹特性具有极其重要的作用，肝癌细胞较高的粘弹特性很可能是微丝的异常结构和排列的结果。细胞骨架与细胞粘弹特性的关系还可以从细胞骨架成分的力学特性与微管吸吮实验的加载方式得到进一步的说明。按照Ingber[9]的观点，微丝及张力纤维结构在胞内具有抗拉的力学特性，微管在胞内主要具有抗压的力学特性。微丝抗拉的力学特性对于细胞外形和体积的维持和稳定具有重要作用，细胞经低渗作用体积膨胀后再用CD处理则会明显干扰和防止体积回缩至初始水平[10]。从这一点上不难理解微管吸吮实验中吸吮负压拉伸加载所测定的粘弹特性与微丝结构的关系。与微丝的作用相反，微管的作用主要为抗压，在细胞内这两方面的作用可能相互平衡，因此以微管结构干扰剂作用于细胞后，由于微丝抗拉作用相对增强，肝细胞同中性粒细胞一样表现为粘弹性系数升高或趋于升高[6]。HCC细胞在微管结构干扰剂作用下粘弹性系数下降[6]很可能是微管微丝的相互作用发生改变并进而对微丝结构和功能产生影响的结果。上述分析表明，研究发现HCC-Inv细胞具有较高的粘弹特性除与其微丝结构的异常有关外，可能也与其微管结构的异常有关。
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细胞在胶原蛋白裱衬表面的粘附力学特性取决于胶原蛋白配体的裱衬浓度、细胞上相应的受体密度、受体—配体亲合力以及胞内与膜受体相联系的细胞骨架的结构和机能状态[11]。我们曾经研究了肝细胞和肝癌细胞在胶原蛋白Ⅳ裱衬表面的粘附力学特性(另文发表)，结果表明，两种细胞的粘附力均呈现出对胶原蛋白Ⅳ裱衬浓度较好的依赖性，当裱衬浓度从1 μg/ml增加至5 μg/ml时，肝癌细胞粘附力增加幅度(202×10-10N，26%)远远小于肝细胞粘附力增加幅度(1566×10-10N，742%)，并呈现出饱和效应，低浓度(1、2μg/ml)胶原蛋白Ⅳ裱衬时，肝癌细胞粘附力大于肝细胞，高浓度(5 μg/ml)胶原蛋白裱衬时，肝细胞粘附力大于肝癌细胞。这一结果与我们对肝细胞和HCC细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力学特性研究结果一致。Ward,Dembo和Hammer[11]曾对细胞在裱衬表面的粘附强度与配体裱衬浓度、细胞受体密度及受体—配体亲合力的关系作了深入的分析，结果表明，在高配体浓度裱衬的表面(配体过剩)，细胞粘附强度主要取决于细胞表面相关受体的密度。结合Ward等人的结果，我们推测，在较高浓度(5 μg/ml)胶原蛋白裱衬表面上肝细胞和HCC细胞粘附力的差异可能反映了两种细胞胶原蛋白相关受体含量的差异，肝癌细胞膜上胶原蛋白相关受体的含量可能不高于甚至低于肝癌细胞上相应受体的含量，低浓度(1.2 μg/ml)胶原蛋白裱衬表面上肝细胞和HCC细胞粘附力差异可能主要反映受体—配体亲合力的差异，肝癌细胞膜上受体与胶原蛋白配体的亲合力可能高于肝细胞上受体的亲合力(尽管Ward等认为受体—配体亲合力与粘附强度只有较弱的函数关系)。HCC-Inv细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面较高的粘附力除了与细胞膜上相应受体密度及受体—配体亲合力改变有关外，可能也与细胞骨架的改变有关。
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恶性肿瘤细胞侵袭与转移行为与其流变特性的相关关系是一个值得深入研究的问题。研究结果表明HCC-Inv细胞较之HCC细胞具有较高的粘弹特性，较高的与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力，这可能反映了HCC-Inv细胞结构与功能的变化。迄今还很难肯定本实验中HCC-Inv细胞上述变化的形成机制，Lindblad等[12]的结果表明细胞与Matrigel等液性基质相互作用引起细胞结构蛋白(如β-tubulin)及胶原的转录及合成下降。HCC-Inv细胞较之HCC细胞具有较高的与LEC的粘附力(恶性肿瘤细胞血道转移的必备条件)提示HCC-Inv细胞可能具有不同的转移潜能，有关这一问题尚须进一步的实验研究。
致谢：重庆医科大学病理生理教研室范维珂教授和李培然教授在免疫组化实验上的精心指导和大力协助，在此表示感谢!
国家自然科学基金资助项目(39500037，39370198，19732003-2)
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参考文献
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7，吴泽志，李志清，龙 勉等.烧伤大鼠粒细胞与内皮细胞粘附力学特性的研究.生物医学工程学杂志，1996；13(3)∶219
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12，Lindblad WJ,Schuetz EG,Redford KS et al.Hepatocellular phenotype in vitro is influenced by biophysical features of the collagenous substratum.Hepatology,1991;13∶282
(收稿：1998-12-08 修回：1999-04-14), 百拇医药
单位：罗向东(第三军医大学 烧伤研究所，重庆 400038)；吴泽志 王宪航 张钢 龙勉 蔡绍皙(重庆大学 生物工程学院，国家教育部生物力学及生物流变学开放实验室，重庆 400044)
关键词：癌，肝细胞；胶原蛋白Ⅰ；Matrigel；肝血窦内皮细胞；细胞流变学
生物医学工程学杂志000205 摘要 以原代肝细胞、肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)细胞及对人工基底膜Matrigel具有侵袭能力的HCC细胞(HCC-Inv细胞)为研究对象，研究了三种细胞的粘弹特性、与胶原蛋白Ⅰ的粘附力学特性及与肝血窦内皮细胞(Liver sinosoidal endothelial cell, LEC)的粘附力学特性。结果发现，HCC细胞的上述流变特性较之于肝细胞发生明显的变化；与肝细胞及HCC细胞相比较，HCC-Inv细胞表现出高的粘弹特性，高的与胶原蛋白Ⅰ的粘附力，高的与LEC的粘附力；免疫细胞化学的结果证实了HCC细胞与HCC-Inv细胞形态与细胞骨架结构的差异。作者对肝癌细胞流变特性改变及病理学意义作了简要讨论。
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Wu Zezhi Wang Xianhang Zhang Gang Long Mian Cai Shaoxi
(College of Bioengineering, Chongqing University,Chongqing 400044)
Luo Xiangdong
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Abstract We investigated the viscoelasticity,mechanics of adhesion to collagen I coated surfaces and mechanics of adhesin to liver sinosoidal endothelial cells(LECs) among primary culture human hepatocytes,hepatocellular carcinoma(HCC) cells as well as HCC-Inv cells,namely HCC cells capable of invading the artificial basement membrane,Matrigel.The results showed that the above-mentioned rheological properties of HCC cells differed obviously from those of normal hepatocytes.HCC-Inv cells exhibited higher viscoelastic coefficients,higher adhesion forces to collagen I coated surfaces as well as higher adhesion forces to LECs than those of normal hepatocytes and HCC cells.Immunocytochemistry showed the differences in cell morphology and cytoskeleton structure between HCC cells and HCC-Inv cells.A brief discussion was presented in relation to the changes in cell rheological properties of hepatocellular carcinoma cells and their pathological significance.
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1 引 言
恶性肿瘤的侵袭行为及机制是当今肿瘤学的前沿性研究课题。80年代，美国国立癌症研究所Liotta等人[1]提出了肿瘤细胞侵袭心指导和大力协助的三步设想，这使人们对肿瘤细胞的侵袭过程有了一个更清晰的认识。现今人们知道，肿瘤细胞的侵袭是以细胞的粘附、运动及变形为基础的复杂病理生理过程，其间伴随机体多种屏障机制的丧失。为了阐明恶性肿瘤细胞侵袭和转移的机制，人们重视研究肿瘤细胞的粘附、运动行为以及与之相关的肿瘤细胞粘附分子和细胞骨架的改变[2，3]，与此同时，在癌组织中作为肿瘤组织侵袭屏障和肿瘤细胞运动和变形的力学支撑结构的胞外基质也越来越引起人们广泛的研究兴趣[1，2]。尽管如此，对恶性肿瘤细胞侵袭和转移机制的认识还远未深入和完善。在这里，以新的研究手段从新的角度进行有关研究已成为必要。
, http://www.100md.com
我们以原代培养肝细胞、肝癌(HCC)细胞以及对人工基底膜Matrigel具有侵袭能力的侵袭性肝癌细胞(HCC-Inv细胞)为研究对象，首先以微管吸吮技术(Micropipette aspiration technique)研究了3种细胞的粘弹特性、在胶原蛋白I裱衬表面和与肝血窦内皮细胞(LEC)的粘附力学特性，进一步，为了了解细胞流变特性改变与细胞骨架的关系，作者用抗生物素—生物素—过氧化酶复合物免疫细胞化学染色法(Avidin biotin-peroxidase complex technique，ABC法)考查了HCC细胞和HCC-Inv细胞微丝、微管及中间丝在胞内的状态。作者对肝癌细胞流变特性改变及其病理意义进行了简要讨论。
2 材料与方法
2.1 主要试剂及药品
胶原蛋白酶IV购自美国Sigma公司，以Hanks液配成0.05%的溶液备用。RPMI1640培养液购自美国Gibco公司，完全培养基含10%的小牛血清，0.03%的谷胺酰胺，100 单位/ml的青霉素及100 μg/ml的链霉素。多聚赖氨酸(Poly-D-lysine,PDL)购自美国Sigma公司，以三蒸水稀释至2 μg/ml后分装备用。胶原蛋白I购自美国Sigma公司，以0.1 N的醋酸(pH3.5)溶解后，用三蒸水稀释成500 μg/ml的储备液，临用前以三蒸水进一步稀释至工作浓度(1、2、5 μg/ml)。牛血清白蛋白(BSA)购自华美公司，以等渗磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.4)配成浓度为0.5%的溶液备用。Matrigel购自美国Collaborative Res公司，以RPMI1640培养液稀释至500 ng/ml备用。鼠抗人单克隆抗体Anti-β-tubulin购自德国宝灵曼公司，编号1111876，储备液浓度50 μg/ml，工作稀释度为1∶25；鼠抗人单克隆抗体Anti-actin购自德国宝灵曼公司，编号1378996，储备液浓度为1 000 μg/ml,工作稀释度为1∶100；鼠抗人多克隆抗体Anti-keratin购自重庆医科大学病理生理教研室，储备液浓度为1 000 μg/ml,工作稀释度为1∶45。ABC法免疫细胞化学试剂盒购自华美公司，批号6020。3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)显色试剂盒购自重庆医科大学病理生理教研室。其余试剂均为国产AR级。
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2.2 细胞分离、培养及细胞样品的制备
正常胎肝组织取自第三军医大学附属西南医院，肝组织经0.05%胶原蛋白酶IV消化后用分步离心沉降或等密度梯度离心的方法分离和纯化正常肝细胞[4，5]，LEC的进一步纯化采用在玻璃表面及PDL裱衬表面的选择性粘附的方法进行[5]。肝细胞以约2×105/ml的浓度接种于普通细胞培养皿，LEC以约1×106/ml的浓度接种于经下述PDL裱衬的园形小室的玻璃表面。以RPMI1640完全培养基常规培养，肝细胞经至少48 h的稳定贴壁培养后经制样用于微管吸吮实验，LEC经2～3 d形成融合单层后用于细胞粘附力学实验。
HCC细胞(SMMC7721)购自第二军医大学并在本实验室传代培养。HCC-Inv细胞的筛选采用Boyden小室法。Boyden小室上下室之间用孔径8 μm的无PVP聚碳酸酯膜(Neuro Probe公司，美国)隔开，膜上涂布500 ng/ml的Matrigel(人工基底膜)，下室加入NIH3T3细胞培养液，在上室内加入5万/0.5 ml肝癌细胞悬液，常规培养6～12 h，收集滤膜底面的细胞于下室内常规培养约10 d，HCC-Inv细胞密度增加并铺满下室底面。
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2.3 微管吸吮实验
2.3.1 细胞粘弹性实验 正常肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞经0.02%EDTA/0.05胰蛋白酶消化后以RPMI 1640细胞培养液制成细胞悬液，粘弹性实验参照先前报道的方法进行[6]。以K1、K2和μ作为表征细胞粘弹特性的客观物理量。
2.3.2 细胞在胶原蛋白I裱衬表面的粘附力测定 玻璃表面的裱衬：取一以玻璃为底表面的特制园形小室，在约0.5 cm2的园形区域内依次裱衬如下成分：(1)2 μg/ml的PDL200 μl，37 ℃裱衬40 min；(2)不同浓度(1、2、5 μg/ml)的胶原蛋Ⅰ200 μl，37 ℃裱衬30 min；(3)0.5%BSA 200 μl,37 ℃作用15 min。各步裱衬结束后均以PBS轻轻洗涤1～2次。制备好的裱衬小室在37 ℃的细胞培养箱内保存，于24小时内完成有关实验。
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粘附力的测定系将约0.5 ml浓度约1×105个细胞/ml的肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞悬液加入上述裱衬好的园形小室，37 ℃静置15 min后，轻轻吸出细胞悬浮液以去掉未粘附细胞，重新加入RPMI 1640培养液，将小室置于倒置显微镜载物台上进行微管吸吮实验。于显微镜下确定待实验的细胞后利用显微操作器引导微管尖端(内经约5～6μm)靠近细胞表面，通过压力控制系统产生一阶跃负压以吸吮细胞，使细胞的一小部分被吸入微管并密封管口，以显微操作器轻轻侧向牵引细胞离开其粘附的裱衬表面。逐步加大负压(步长5～10mmH2O)直至求得能使细胞与相应裱衬表面间粘附分离的临界负压值。在实验中，以电视摄像磁带记录的方式记录实验过程，经电视回放输入图像处理仪进行有关测量。整个微管吸吮实验在2 h内完成。
细胞粘附力采用下式计算：F=ΔΡπ(Rp)2。其中ΔP为细胞粘附分离的临界负压值，π为园周率，Rp为微管尖端内半径。
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2.3.3 细胞与LEC的粘附力测定 取出经方法1.2制备的含融合单层LEC的特制园形小室，丢弃培养液，以Hanks液清洗1～2次，分别加入浓度约1×105个/ml的肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞。37 ℃静置60 min，参照文献[7]及上述方法2.3.2进行细胞粘附力测定，选取细胞粘附于LEC靠近核的中央区域的粘附细胞对进行测量，压力步长为1～2 mmH2O。整个微管吸吮实验在2 h内完成。
2.4 免疫细胞化学实验[8]
将HCC细胞及HCC-Inv细胞分别接种于盖玻片上，2～3 d后即良好贴壁生长，选取细胞密度适中的玻片，微温热风干1 h，甲醛丙酮液常规固定2 min。以ABC法进行常规免疫化学染色[8]，明胶封片，油镜镜检，1000×照像。
2.5 统计学处理
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粘弹性及粘附力的结果以
±s表示，组间数据的比较采用两样本均数的t检验。3 结 果
3.1 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞的粘弹特性
表1为肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞的粘弹性系数。从表中可见，3种细胞的弹性系数K1及K2均呈HCC-Inv细胞>HCC细胞>肝细胞的变化趋势，HCC细胞与肝细胞的粘性系数μ无显著性差异，HCC-Inv细胞的粘性系数μ较这HCC细胞和肝细胞呈明显升高(P<0.001)。
表1 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞的粘弹性系数
Table 1 Viscoelastic coefficients of hepatocytes,HCC cells and HCC-inv cells
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K1(N/m2)
K2(N/m2)
μ(N*S/m2)
n
Hepatocytes
87.5±12.1
33.3±10.3
5.9±3.0
24
HCC cells
103.6±12.6+++
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42.5±10.4++
4.5±1.9
30
HCC-Inv cells
134.4±21.1+++***
72.9±28.1+++***
9.5±4.5+++***
35
Compared with those of hepatocytes:++P<0.01；+++P<0.001；Compared with those of HCC cells:***P<0.001；n:nmuber of cells measured
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3.2 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力学特性
表2为肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞在不同浓度(1、2、5μg/ml)胶原蛋白Ⅰ裱衬表面上的粘附力。从表中可见：(1)肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞粘附力对胶原蛋白I裱衬浓度均有较好的依赖性。胶原蛋白I裱衬浓度从1 μg/ml增加至5μg/ml，肝细胞粘附力增加幅度为1333×10-10 N(196%)，HCC细胞为571×10-10 N(41%)，HCC-Inv细胞为728×10-10 N(50%)；(2)低浓度(1、2μg/ml)胶原蛋白Ⅰ裱衬时，HCC细胞粘附力大于肝细胞(P<0.001)，高浓度(5μg/ml)胶原蛋白Ⅰ裱衬时肝细胞与HCC细胞粘附力无明显差异。在所用的3个裱衬浓度，HCC-Inv细胞粘附力均较HCC细胞和肝细胞的相应粘附力值明显升高(P<0.05)。
表2 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力
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Table 2 Adhesion forces of hepatocytes,HCC cells and HCC-Inv cells onto collagen I coated surfaces
1μg/ml collagen I coated
surfaces(10-10N)
2μg/ml collagen I coated
surfaces(10-10N)
5μg/ml collagen I coated
suofaces(10-10N)
, http://www.100md.com Hepatocytes
681±93
(n=92)
1223±140
(n=85)
2014±197
(n=77)
HCC cells
1383±179+++
(n=111)
1622±244+++
(n=101)
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1954±302
(n=77)
HCC-Inv cells
1446±196+++*
(n=130)
2057±247+++***
(n=81)
2174±274+++***
(n=78)
Compared with those of hepatocytes:+++P<0.001；Compared with those of HCC cells:*P<0.05,***P<0.001；n:number of cells measured
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3.3 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞与LEC的粘附力学特性
表3为肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞与LEC的粘附力。从表中可见，HCC细胞粘附力较之肝细胞粘附力明显升高(P<0.001)，HCC-Inv细胞与LEC的粘附力较之肝细胞和HCC细胞都明显升高(P<0.001)。
表3 肝细胞、HCC细胞及HCC-Inv细胞与LEC的粘附力
Table 3 Adhesion forces of hepatocytes,HCC cells and HCC-Inv cells to LEC
Hepatcytes
HCC cells
HCC-Inv cells
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Adhesion forces
20±4
27±4+++
41±7+++***
(10-10N)
(n=35)
(n=41)
(n=44)
Compared with those of hepatocytes:+++P<0.001；Compared with those of HCC cells:***P<0.001；n:number of cells measured
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3.4 免疫细胞化学染色
图1为HCC细胞及HCC-Inv细胞经ABC免疫细胞化学染色法显示的微管、微丝及中间丝的结构状态。从图中可见，HCC细胞形态呈较均匀的梭形，微丝(anti-actin)和中间丝(anti-keratin)染色均匀布满整个胞浆，可见张力纤维结构；微管(anti-β-tubulin)染色明显，均匀分布于胞浆，而以靠近核的中央区胞浆更明显。HCC-Inv细胞极度铺展，形态较不规则，部分细胞核浆比例明显增大，微丝和中间丝染色遍步于胞浆，张力纤维结构较HCC细胞增加，排列不规则较HCC细胞更明显；微管染色十分浅淡。
图1 HCC细胞(a,b,c)及HCC-Inv细胞(d,e,f)经鼠抗人anti-β-tubulin单克隆抗体(a,d)、anti-actin单克隆抗体(b,e)及anti-keratin多克隆抗体(c,f)ABC免疫细胞化学染色法显示的微管、微丝及中间丝的结构状态。×1000
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Fig 1 Demonstration of the structure of microtubule,microfilaments and intermediate filaments of HCC cells(a,b,c) and HCC-Inv cells (d,e,f)by means of avidin-biotin-peroxidase complex(ABC) technique with mouse monoclonal antibodies against human β-tubulin (a,d),human actin(b,e) and mouse polyclonal antibody against human keratin(c,f).×1000
4 讨 论
近20年有关领域的研究已使人们认识到，癌细胞侵袭是以细胞与胞外基质的粘附为始动步骤，通过胞内复杂信号通路触发细胞蛋白水解酶的分泌并进而引起癌细胞的运动和变形及其对基质的侵袭。细胞流变学是研究细胞的粘附、运动及变形的生物流变学的一个重要的分支，将细胞流变学的研究手段用于癌细胞侵袭的研究是一个初步的偿试，它对于从流变学的角度认识癌细胞侵袭的机制具有重要的意义。
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细胞的粘弹性是与其运动与变形能力有关的一个重要的细胞流变学指标，对于恶性肿瘤细胞而言，它可能影响到细胞的侵袭与转移能力。我们研究发现，HCC细胞的弹性系数较肝细胞大，而HCC-Inv细胞的弹性系数、粘性系数均较HCC细胞和肝细胞增高，这提示肝癌细胞侵袭性可能与较高的粘弹特性有关。癌细胞的粘弹特性与细胞骨架的相关关系是一个值得进一步深入研究的问题。由于免疫细胞化学及电子显微镜技术的应用，癌细胞及恶性转化细胞细胞骨架的改变早已引起研究者的重视[3]，我们以免疫细胞化学的方法也发现HCC-Inv细胞较之于普通HCC细胞的形态及细胞骨架结构发生改变。我们曾经以细胞松驰素D(CD)、秋水仙素(Col)及长春花碱(VBL)分别处理肝细胞及HCC细胞研究两种细胞粘弹性与其细胞骨架结构的相关性(文献[6]及另文发表资料)，结果发现CD作用引起微丝结构破坏后HCC细胞粘弹性系数下降幅度较肝细胞大，Col和VBL作用引起微管解聚后肝细胞粘弹性系数升高而肝癌细胞粘弹性系数下降，肝癌细胞受三种细胞骨架干扰剂作用后以CD引起粘弹性系数下降幅度最大。这说明微丝对于决定肝细胞和肝癌细胞的粘弹特性具有极其重要的作用，肝癌细胞较高的粘弹特性很可能是微丝的异常结构和排列的结果。细胞骨架与细胞粘弹特性的关系还可以从细胞骨架成分的力学特性与微管吸吮实验的加载方式得到进一步的说明。按照Ingber[9]的观点，微丝及张力纤维结构在胞内具有抗拉的力学特性，微管在胞内主要具有抗压的力学特性。微丝抗拉的力学特性对于细胞外形和体积的维持和稳定具有重要作用，细胞经低渗作用体积膨胀后再用CD处理则会明显干扰和防止体积回缩至初始水平[10]。从这一点上不难理解微管吸吮实验中吸吮负压拉伸加载所测定的粘弹特性与微丝结构的关系。与微丝的作用相反，微管的作用主要为抗压，在细胞内这两方面的作用可能相互平衡，因此以微管结构干扰剂作用于细胞后，由于微丝抗拉作用相对增强，肝细胞同中性粒细胞一样表现为粘弹性系数升高或趋于升高[6]。HCC细胞在微管结构干扰剂作用下粘弹性系数下降[6]很可能是微管微丝的相互作用发生改变并进而对微丝结构和功能产生影响的结果。上述分析表明，研究发现HCC-Inv细胞具有较高的粘弹特性除与其微丝结构的异常有关外，可能也与其微管结构的异常有关。
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细胞在胶原蛋白裱衬表面的粘附力学特性取决于胶原蛋白配体的裱衬浓度、细胞上相应的受体密度、受体—配体亲合力以及胞内与膜受体相联系的细胞骨架的结构和机能状态[11]。我们曾经研究了肝细胞和肝癌细胞在胶原蛋白Ⅳ裱衬表面的粘附力学特性(另文发表)，结果表明，两种细胞的粘附力均呈现出对胶原蛋白Ⅳ裱衬浓度较好的依赖性，当裱衬浓度从1 μg/ml增加至5 μg/ml时，肝癌细胞粘附力增加幅度(202×10-10N，26%)远远小于肝细胞粘附力增加幅度(1566×10-10N，742%)，并呈现出饱和效应，低浓度(1、2μg/ml)胶原蛋白Ⅳ裱衬时，肝癌细胞粘附力大于肝细胞，高浓度(5 μg/ml)胶原蛋白裱衬时，肝细胞粘附力大于肝癌细胞。这一结果与我们对肝细胞和HCC细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力学特性研究结果一致。Ward,Dembo和Hammer[11]曾对细胞在裱衬表面的粘附强度与配体裱衬浓度、细胞受体密度及受体—配体亲合力的关系作了深入的分析，结果表明，在高配体浓度裱衬的表面(配体过剩)，细胞粘附强度主要取决于细胞表面相关受体的密度。结合Ward等人的结果，我们推测，在较高浓度(5 μg/ml)胶原蛋白裱衬表面上肝细胞和HCC细胞粘附力的差异可能反映了两种细胞胶原蛋白相关受体含量的差异，肝癌细胞膜上胶原蛋白相关受体的含量可能不高于甚至低于肝癌细胞上相应受体的含量，低浓度(1.2 μg/ml)胶原蛋白裱衬表面上肝细胞和HCC细胞粘附力差异可能主要反映受体—配体亲合力的差异，肝癌细胞膜上受体与胶原蛋白配体的亲合力可能高于肝细胞上受体的亲合力(尽管Ward等认为受体—配体亲合力与粘附强度只有较弱的函数关系)。HCC-Inv细胞在胶原蛋白Ⅰ裱衬表面较高的粘附力除了与细胞膜上相应受体密度及受体—配体亲合力改变有关外，可能也与细胞骨架的改变有关。
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恶性肿瘤细胞侵袭与转移行为与其流变特性的相关关系是一个值得深入研究的问题。研究结果表明HCC-Inv细胞较之HCC细胞具有较高的粘弹特性，较高的与胶原蛋白Ⅰ裱衬表面的粘附力，这可能反映了HCC-Inv细胞结构与功能的变化。迄今还很难肯定本实验中HCC-Inv细胞上述变化的形成机制，Lindblad等[12]的结果表明细胞与Matrigel等液性基质相互作用引起细胞结构蛋白(如β-tubulin)及胶原的转录及合成下降。HCC-Inv细胞较之HCC细胞具有较高的与LEC的粘附力(恶性肿瘤细胞血道转移的必备条件)提示HCC-Inv细胞可能具有不同的转移潜能，有关这一问题尚须进一步的实验研究。
致谢：重庆医科大学病理生理教研室范维珂教授和李培然教授在免疫组化实验上的精心指导和大力协助，在此表示感谢!
国家自然科学基金资助项目(39500037，39370198，19732003-2)
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(收稿：1998-12-08 修回：1999-04-14), 百拇医药