生物可吸收性甲壳素纤维增强聚乳酸复合材料体内体外降解性研究
作者：陈长春 程海涛 孙康 吴人洁 蒋尧
单位：陈长春 孙康 吴人洁(上海交通大学 材料学院复合材料研究所，上海 200030)；程海涛 蒋尧(上海市第六人民医院 骨科，上海 200030)
关键词：酰化改性；甲壳素；聚乳酸；复合材料；体外降解；骨折内固定
生物医学工程学杂志000201 摘要 对酰化改性甲壳素纤维增强聚乳酸复合材料板材进行了体外降解及动物体内植入实验。该复合材料板材初始弯曲强度为114.72 MPa，初始弯曲模量为3980.05 MPa。在37 ℃，乳酸钠林格组织液中浸泡16周后，其弯曲强度降至31.42 MPa。其体外耐水解特性及耐强度衰减特性均明显优于初始弯曲强度远高于它的PGA/PLA和PGA自增强复合材料。该复合材料的降解产物可通过体内代谢吸收，提示了该材料潜在的应用前景。
The Degradation Performance of Bioabsorbable Acylchitin Fiber
, http://www.100md.com
Reinforced PLA Composite Materials in vitro and in vivo
Chen Changchun Sun Kang Wu Renjie
(Institute of Composite Materials,Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030)
Cheng Haitao Jiang Rao
(Department of Orthopedics,The 6th People's Hospital of Shanghai, Shanghai 200030)
Abstract The present authors have investigated the degradation performance of acylchitin fiber reinforced polylactide composite materials plates both in vitro and in vivo.The initial flexural strength and the initial flexural modulus of this plate are 114.72MPa and 3980.05MPa,respectively.The flexural strength of this plate decreases to 31.42MPa after the plate has been submerged in injectio natrii lactatic ringeri tissue fluid for a period of 16 weeks at 37℃.Both the in vitro degradation performance and the strength retention of this plate are better than those of the self-reinforced PGA/PLA and PGA,though the initial strength of the latter two being much higher than that of the former.The degradation products of the chitin/PLA composite materials can be absorbed by metabolic pathway.
, 百拇医药
Key words Bio-absorbable Chitin Acylation Chitin/PLA composite materials Internal fracture fixation Degradation
1 引 言
目前临床可供使用的可吸收性骨折内固定装置主要是自增强聚乳酸类材料，像PGA、PLLA及PGA/PLA共聚物等。该材料已具有较高的初始强度，如SR-PGA/PLA棒状物的初始弯曲强度为265 MPa，而SR-PGA的棒状物更可达到370 MPa的初始弯曲强度[1，2]。从初始弯曲强度来看，已基本能满足临床使用要求。但在随后的体外、体内降解性实验中发现，上述两种材料均降解过快，如SR-PGA/PLA的弯曲强度，在37 ℃蒸馏水中浸泡4周后，即由265 MPa降低到10～20 MPa[2]，体内降解则更快。这样的强度衰减速度仅能满足少数非受力、且愈合较快的松质骨骨折的内固定，如颌面外科。解决这一问题的根本途径是开发一种较聚乳酸更具疏水性的材料。
, 百拇医药
甲壳素作为一种天然生物大分子，已有的研究结果证实，它具有良好的生物相容性，可体内降解吸收等优异的性能。通过适当改性和湿法纺丝工艺，可将甲壳素纺制成高强纤维。甲壳素在体内是溶菌酶催化水解，与聚乳酸的本体水解机理不同，其纤维降解速率，尤其是强度衰减方面可能慢于聚乳酸，制成复合材料用作骨折内固定装置，有望解决聚乳酸类骨折内固定装置降解过快的问题。
2 实验用材料与方法
未改性甲壳素树脂由于其结构中存在强的氢键缔合，导致其溶解性极差且不熔融，直接用湿法纺丝工艺纺制成纤维后，纤维强度较差，柔韧性不足。要提高纤维强度，必须对甲壳素树脂进行适当改性，以提高其在纺丝液中的溶解度。通过对甲壳素树脂进行甲酰/乙酰混合酰化，得到了酰化甲壳素树脂(酰化度分别为：DS乙酰=1.60,DS甲酰=0.43),将该酰化甲壳素溶于N，N-二甲基乙酰胺/氯化锂混合溶液中，采用湿法纺丝工艺纺制成纤维。纤维性能如下：线密度(dtex)3.90,断裂强力(CN/dtex)2.27，断裂伸长率(%)7.41，结晶度指数(%)61.4，取向度(%)82.7。
, 百拇医药
选用粘均分子量大于40万的PDLLA为树脂基体，将甲壳素纤维预制成树脂含量为40%的无纬预浸布。将预浸布按模具尺寸和设计的铺层方向进行适当剪裁，然后按照0°/+45°/-45°/0°的铺层顺序，将剪裁好的预浸料片加入T=170～180 ℃的模具型腔中，在P=2～3 MPa条件下，进行模压成型，压制10 min后，将模具转移至冷压机上保压冷却，当T<50 ℃后脱模。实验所用模具型腔尺寸为250 mm×150 mm，板材设计厚度为2.5 mm。为方便比较，我们将未改性甲壳素纤维也按相同的条件制备成复合材料板材。
为便于与其它相关实验报道进行性能比较，本实验主要对材料的弯曲强度和弯曲模量进行了测试。本文所制备的复合材料板材力学强度测试结果列于下表1中。
表1 甲壳素/聚乳酸复合材料弯曲强度与弯曲模量
Table l Flexural strength and flexural modulus of chitin/PLA composite materials 材料类型
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弯曲强度(MPa)
弯曲模量(MPa)
未改性甲壳素纤维/聚乳酸复合材料
78.76
5214.80
改性甲壳素纤维/聚乳酸复合材料
114.72
3980.05
强度测试是参照国标GB3356-82，在MTS NEW 810 MATERIAL TEST SYSTEM材料实验机上进行的。
复合材料的微观结构观察是在Phillips×L 30扫描电镜上进行的。
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复合材料体外降解实验设计如下：(1)将改性甲壳素纤维与未改性甲壳素纤维增强的聚乳酸复合材料板材，按照与弯曲强度测试用试样同样的标准，裁制成45 mm×8 mm×2.5 mm的长条试样，每组至少3个试样，试样经真空干燥恒重后，称重并做标记，以临床输液用的乳酸钠林格电解液，作为浸泡用溶液。将上述试样浸泡于含浸泡液的容器中，将容器封口后置于37±2 ℃的恒温水浴中，浸泡液每10天更换1次。(2)按浸泡时间分别为1、2、3、4、6、8、12、16周各取出1组试样，用滤纸除去试样表面水分后，真空干燥48 h，称重，计算试样重量损失率=[(初重-现重)/初重]×100%。(3)将称重后的试样在MTS NEW 810 MATERIAL TEST SYSTEM材料实验机上进行弯曲强度测试，并根据实验测试所得压力-应变曲线计算各组试样相应的弯曲模量值，以考察材料的强度与模量随时间衰减情况。
复合材料动物实验。选用新西兰雄性白兔25只，体重1.4～2.6 kg,随机分为5组，分别 2、4、6、8、12周组。每组动物标本行胫骨截骨后，2只以未改性纤维板材，2只以改性纤维板材，1只以普通按骨钢板固定。
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对固定部位骨及钢板、板材、螺钉行硬包埋切片，方法如下：脱水完毕的骨组织浸放于甲基丙烯酸甲酯/邻苯二甲酸二丁酯液内，置40 ℃烘箱固化成型；切片，厚度50 μm(10片/例)、80 μm(10片/例)；50 μm切片分别以Cason和甲苯胺蓝染色，80 μm切片待行荧光观察。
骨表面软组织包埋：甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，待行光镜观察。
3 实验结果与讨论
3.1 体外降解
复合材料的体外降解情况主要从试样的重量损失、强度及模量衰减情况来考察。试样的重量损失是将各组试样自浸泡液中取出，经真空干燥恒重后，计算其重量损失情况。每组取3个试样重量损失的算术平均值。各组试样的重量损失-时间关系曲线如图1所示。
试样的强度及模量衰减与浸泡时间的关系曲线如下图2所示。
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从图1的试样重量衰减及强度衰减-时间关系曲线中均可明显地看出，未改性甲壳素纤维作为增强相的复合材料板材，其重量衰减及强度衰减明显慢于改性纤维之复合材料。由于我们所考察的两种复合材料板材是在制备工艺完全一致，基体均为PDLLA树脂，且两种复合材料中纤维含量均占60%(wt%)，因而在比较其降解性时，不同板材降解特异性基本可归结于纤维性质的不同。对此现象我们认为，它的出现主要基于以下2个原因：(1)甲壳素经酰化改性后，由于-OH、-NH-基的减少，降低了甲壳素分子内、分子间的氢键缔合点的数目；同时由于分子链侧基的引入，基于位阻效应增大了分子间的间距，而主链结构没有改变，仍是易于旋转的醚键，从而提高了改性后的酰基化甲壳素分子的柔顺性，使得甲壳素分子有序度降低，结晶度明显下降，这样在发生水解过程时，酰化甲壳素纤维分子间更易于水的渗透和扩散，事实上提高了其水解速率；(2)甲壳素经酰基化改性后，原来的-OH基变成了酯键，其材料本身在有机溶剂中溶解性能得以改善的同时，由于酯链本身更易于水解，因而客观上也提高了其水解速率。当然真实的降解过程可能非常复杂，由于板材由二相体系构成，纤维除断面外，均被包裹在树脂基体中，因而水解最初主要发生在板材的表面，即以表面浸蚀为主。当表层树脂发生降解，导致最外层纤维外露时，在溶菌酶及聚乳酸降解产物乳酸的酸性催化下，甲壳素纤维开始水解，由此循序渐进地开始水解过程。由于体外降解实验所采用的乳酸钠林格注射液中，不含溶菌酶，所以在体外实验中，甲壳素纤维的降解速率可能有会慢于在体内的降解。这一点在动物体内实验中也可以得到确认。
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图1 甲壳素/聚乳酸复合材料在37 ℃乳酸钠林格浸泡液中重量衰减随浸泡时间的变化关系
Fig 1 Variation of mass weight of absorbable chitin/PLA composite materials submerged in injectio natrii lactatis ringeri at 37℃
图2 甲壳素/聚乳酸复合材料在37 ℃乳酸钠林格浸泡液中强度及模量衰减随浸泡时间的变化关系
Fig 2 Effect of time on the (a)flexural strength and (b)flexural modulus of chitin/PLA composite materials submerged in injectio natrii lactatis ringeri at 37 ℃
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从图2可以看出，改性甲壳素纤维增强复合材料的强度及模量的衰减明显快于未改性甲壳素纤维复合材料。这种现象可能与未改性甲壳素纤维较高的结晶度和分子链存在高密度分子内、分子间氢键有关，因为高结晶度和高密度氢键的存在使得水分子对其浸润和渗透更困难，从而使其能在水解作用下仍保持相当的强度。
但是应当看到，虽然改性甲壳素纤维复合材料板材强度及模量的衰减速率较未改性甲壳素纤维复合材料的衰减速率快，但在浸泡16周后其弯曲强度值仍有31.42 MPa。与此形成鲜明对照的是，文献[2]报道的PGA/PLA自增强复合材料虽具有265 MPa的初始弯曲强度，但其在37 ℃蒸馏水中浸泡4周后，其弯曲强度值即降低到松质骨水平(10～20MPa)，难以实现对骨折的有效固定。同时应当指出，本实验板材的铺层顺序是0°/45°/-45°/0°，而文献[2]报道的自增强PGA/PLA复合材料棒中的纤维方向均为0°，从复合材料力学可以推知，若本实验中板材的纤维方向也全部采用0°铺层，则其弯曲强度将会明显提高。很显然，从这一点来看甲壳素/聚乳酸复合材料在耐强度衰减方面具有明显的优势。
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3.2 动物体内降解
生物可吸收聚合物在动物体内的降解通常是通过细胞的吞噬作用。主要是通过巨噬细胞，偶通过粒细胞的吞噬作用，后期巨噬细胞等渐融合为多核巨细胞，吞噬去除降解碎片。甲壳素纤维降解碎片可于板材植入后1月出现在多核巨细胞内，此后吞噬过程渐趋明显，不仅出现在板材周围的多核巨细胞内，而且渐出现在远离板材的纤维组织中的巨细胞中。聚乳酸的降解一方面通过上述吞噬作用，另一方面本实验发现了其另外的转移途径。几乎所有的标本中都出现了一层板材与骨间的无定形物质界膜，分析认为，该界膜即为聚乳酸水解(可能也有甲壳素纤维水解)的碎片渗出变性的蛋白等组成。病理切片发现，随时间的推移，新生骨痂及板层骨腔隙内可出现同样结构的物质，而在板材中间及周围软组织中，则未发现同样的现象，提示这些水解产物可能通过骨的哈佛氏系统转运至组织液与血液中，进入正常的代谢途径。当然，并不否认其通过周围软组织进入代谢途径。可能因为界膜相对稳定，而哈佛氏系统转运能力有限，故引起降解物的沉积。因此，测定该厚度，可以粗略推测板材降解速度和局部转移能力。
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具体测量分析过程如下：将每个标本作10个切片，在光学显微镜下观察和测量每个切片中无定型物质的平均厚度，将各组标本测出的数据用SAS软件包进行方差分析，以考察其统计学规律和意义。不同标本组之间的差异由Duncan检验。若将不同时间组、不同材料的标本统计学分析结果，以均值和方差的形式表达，其降解规律可示于图3。
从标本切片的光镜观察中也可以发现，甲壳素纤维束由紧密结合逐渐变得松散，特别是纤维单丝间的空隙进行性增大，且单丝断面形态逐渐膨胀，都提示为降解过程。说明随着水分子的不断浸渗，聚乳酸本体水解的不断进行，含有溶菌酶的体液不断渗透到纤维束相邻纤维之间，并对纤维产生溶涨而逐渐水解的机制。降解最明显发生于板材植入后4～6周，4周组和6周组纤维束变化较为显著，不定形物质形成最多，临床表现板材表面渗出也最明显，且窦道形成率较高，此后进入相对稳定阶段，渗出减少，板材断面变化不大，无定形物形成减少，镜下呈现疤痕纤维增生的表现。
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图3 样本植入时间与降解物厚度的关系(X轴为样本组别：依次为2，4，6，8，12周)
Fig 3 Relation between the thickness of degradation products and the implant period(X-axis refers immersion time to 2,4,6,8,12 weeks respectively)
从骨折固定部位提取标本时，剔除板材表面外后肌组织和表面软组织，经无水乙醇浸泡，空气干燥后，进行扫描电镜观察。样本0206Ⅱ和0208Ⅰ(8周组)的SEM照片如下图4、图5所示。
从图4、图5中样本0206Ⅱ，0208Ⅰ(8周组)的SEM照片中可以看出，聚乳酸基体因出现明显水解而呈不连续状，纤维表面，尤其是相邻纤维之间的基体，因水解断链而出现分离的现象，部分纤维因在应力环境下受到水解而断裂，纤维表面也有因水解腐蚀而造成的皮层剥离的现象。这种水解现象远较体外降解实验中，同时间组试样降解严重。说明材料在体内的降解速率较体外要快。而从植入时间较短样本的SEM照片中可以看出，因植入时间短，基体虽因水解而出现龟裂现象，但基体基本上仍是连续的，仍可以起到传递应力的作用，相邻纤维间的基体并未完全脱离。
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图4 样本0206Ⅱ的SEM形貌
Fig 4 Sample 0206Ⅱ SEM morphology
图5 样本0208ⅠSEM形貌
Fig 5 Sample 0208Ⅰ SEM morphology
4 讨 论
(1)甲壳素/聚乳酸复合材料的体外降解基本上是一个水解过程，且甲壳素与聚乳酸遵循不同的水解机理。甲壳素为溶菌酶催化水解，聚乳酸为本体水解，甲壳素/聚乳酸复合材料的水解是上述二种机理综合作用的结果。由于体外降解实验所用浸泡液不含溶菌酶，所以该复合材料体外降解以聚乳酸水解为主。
, 百拇医药 (2)甲壳素/聚乳酸复合材料的重量衰减和强度衰减均表现为开始阶段衰减较快，随后趋缓的特征。改性甲壳素纤维增强聚乳酸复合材料板材的重量及强度衰减均快于未改性甲壳素纤维之复合材料。改性甲壳素纤维增强/聚乳酸复合材料板材在浸泡4个月后，弯曲强度仍有31.42 MPa。在体外降解条件下，其强度保持率和浸泡后的绝对强度值均明量优于初始弯曲强度远高于它的PGA/PLA自增强复合材料，表明其在抗水解及强度保持方面具有明显的优势和潜在的应用前景。
(3)甲壳素/聚乳酸复合材料植入物的体内降解是在水解的基础上，主要通过巨噬细胞的吞噬作用来实现代谢的；当大分子降解成小分子后，也可通过骨的哈佛氏系统转运至组织液或血液中，进入正常代谢途径。
上海市科学技术发展基金课题(98JC1405)
参考文献
1，Törmlälä P,Vainion pö S,Kilpikari J et al.The effects of fiber reinforcement and gold plating on the flexural and tensile strength of PGA/PLA copolymer materials in vitro.Biomaterials,1987;8∶42
, 百拇医药
2，Vainionpä S, Kilpikari J, Laiho J et al. Strength and strength retention in vitro,of absorbable, self-reinforced polyglycolide(PGA) rods for fracture fixation. Biomaterials, 1987;8∶46
3，Vasenius J, Vainionpä S, Vihtonen K et al.Comparison of in vitro hydrolysis,subcutaneous and intramedullary implantation to evaluate the strength retention of absorbable osteosynthesis implants.Biomaterials,1990;11∶501
4，Otto TE,Nulend JK, Patka et al,Effect of (poly)-L-lactic acid on the proliferation and differentiation of primary bone cells in vitro.J Biomed Mater Res,1996 Dec;32(4)∶513
, 百拇医药
5，Mainil-Varlet P,Rahn B,Jolewskr S et al.Long-term in vivo degradation and bone reaction to various polylactides.Biomaterials.1997;18∶257
6，Reed AM,Gilding DK.Biodegradable polymers for use in surgery-poly(glycolic)/poly(lactic acid)homo and copolymers:2.In vitro degradation.Polymer.1981;22∶494
7，陈长春.改性甲壳素纤维增强聚乳酸复合材料研究.上海交通大学博士论文，1998年8月
(收稿：1998-12-02 修回：1999-05-06), 百拇医药
单位：陈长春 孙康 吴人洁(上海交通大学 材料学院复合材料研究所，上海 200030)；程海涛 蒋尧(上海市第六人民医院 骨科，上海 200030)
关键词：酰化改性；甲壳素；聚乳酸；复合材料；体外降解；骨折内固定
生物医学工程学杂志000201 摘要 对酰化改性甲壳素纤维增强聚乳酸复合材料板材进行了体外降解及动物体内植入实验。该复合材料板材初始弯曲强度为114.72 MPa，初始弯曲模量为3980.05 MPa。在37 ℃，乳酸钠林格组织液中浸泡16周后，其弯曲强度降至31.42 MPa。其体外耐水解特性及耐强度衰减特性均明显优于初始弯曲强度远高于它的PGA/PLA和PGA自增强复合材料。该复合材料的降解产物可通过体内代谢吸收，提示了该材料潜在的应用前景。
The Degradation Performance of Bioabsorbable Acylchitin Fiber
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Reinforced PLA Composite Materials in vitro and in vivo
Chen Changchun Sun Kang Wu Renjie
(Institute of Composite Materials,Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030)
Cheng Haitao Jiang Rao
(Department of Orthopedics,The 6th People's Hospital of Shanghai, Shanghai 200030)
Abstract The present authors have investigated the degradation performance of acylchitin fiber reinforced polylactide composite materials plates both in vitro and in vivo.The initial flexural strength and the initial flexural modulus of this plate are 114.72MPa and 3980.05MPa,respectively.The flexural strength of this plate decreases to 31.42MPa after the plate has been submerged in injectio natrii lactatic ringeri tissue fluid for a period of 16 weeks at 37℃.Both the in vitro degradation performance and the strength retention of this plate are better than those of the self-reinforced PGA/PLA and PGA,though the initial strength of the latter two being much higher than that of the former.The degradation products of the chitin/PLA composite materials can be absorbed by metabolic pathway.
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Key words Bio-absorbable Chitin Acylation Chitin/PLA composite materials Internal fracture fixation Degradation
1 引 言
目前临床可供使用的可吸收性骨折内固定装置主要是自增强聚乳酸类材料，像PGA、PLLA及PGA/PLA共聚物等。该材料已具有较高的初始强度，如SR-PGA/PLA棒状物的初始弯曲强度为265 MPa，而SR-PGA的棒状物更可达到370 MPa的初始弯曲强度[1，2]。从初始弯曲强度来看，已基本能满足临床使用要求。但在随后的体外、体内降解性实验中发现，上述两种材料均降解过快，如SR-PGA/PLA的弯曲强度，在37 ℃蒸馏水中浸泡4周后，即由265 MPa降低到10～20 MPa[2]，体内降解则更快。这样的强度衰减速度仅能满足少数非受力、且愈合较快的松质骨骨折的内固定，如颌面外科。解决这一问题的根本途径是开发一种较聚乳酸更具疏水性的材料。
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甲壳素作为一种天然生物大分子，已有的研究结果证实，它具有良好的生物相容性，可体内降解吸收等优异的性能。通过适当改性和湿法纺丝工艺，可将甲壳素纺制成高强纤维。甲壳素在体内是溶菌酶催化水解，与聚乳酸的本体水解机理不同，其纤维降解速率，尤其是强度衰减方面可能慢于聚乳酸，制成复合材料用作骨折内固定装置，有望解决聚乳酸类骨折内固定装置降解过快的问题。
2 实验用材料与方法
未改性甲壳素树脂由于其结构中存在强的氢键缔合，导致其溶解性极差且不熔融，直接用湿法纺丝工艺纺制成纤维后，纤维强度较差，柔韧性不足。要提高纤维强度，必须对甲壳素树脂进行适当改性，以提高其在纺丝液中的溶解度。通过对甲壳素树脂进行甲酰/乙酰混合酰化，得到了酰化甲壳素树脂(酰化度分别为：DS乙酰=1.60,DS甲酰=0.43),将该酰化甲壳素溶于N，N-二甲基乙酰胺/氯化锂混合溶液中，采用湿法纺丝工艺纺制成纤维。纤维性能如下：线密度(dtex)3.90,断裂强力(CN/dtex)2.27，断裂伸长率(%)7.41，结晶度指数(%)61.4，取向度(%)82.7。
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选用粘均分子量大于40万的PDLLA为树脂基体，将甲壳素纤维预制成树脂含量为40%的无纬预浸布。将预浸布按模具尺寸和设计的铺层方向进行适当剪裁，然后按照0°/+45°/-45°/0°的铺层顺序，将剪裁好的预浸料片加入T=170～180 ℃的模具型腔中，在P=2～3 MPa条件下，进行模压成型，压制10 min后，将模具转移至冷压机上保压冷却，当T<50 ℃后脱模。实验所用模具型腔尺寸为250 mm×150 mm，板材设计厚度为2.5 mm。为方便比较，我们将未改性甲壳素纤维也按相同的条件制备成复合材料板材。
为便于与其它相关实验报道进行性能比较，本实验主要对材料的弯曲强度和弯曲模量进行了测试。本文所制备的复合材料板材力学强度测试结果列于下表1中。
表1 甲壳素/聚乳酸复合材料弯曲强度与弯曲模量
Table l Flexural strength and flexural modulus of chitin/PLA composite materials 材料类型
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弯曲强度(MPa)
弯曲模量(MPa)
未改性甲壳素纤维/聚乳酸复合材料
78.76
5214.80
改性甲壳素纤维/聚乳酸复合材料
114.72
3980.05
强度测试是参照国标GB3356-82，在MTS NEW 810 MATERIAL TEST SYSTEM材料实验机上进行的。
复合材料的微观结构观察是在Phillips×L 30扫描电镜上进行的。
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复合材料体外降解实验设计如下：(1)将改性甲壳素纤维与未改性甲壳素纤维增强的聚乳酸复合材料板材，按照与弯曲强度测试用试样同样的标准，裁制成45 mm×8 mm×2.5 mm的长条试样，每组至少3个试样，试样经真空干燥恒重后，称重并做标记，以临床输液用的乳酸钠林格电解液，作为浸泡用溶液。将上述试样浸泡于含浸泡液的容器中，将容器封口后置于37±2 ℃的恒温水浴中，浸泡液每10天更换1次。(2)按浸泡时间分别为1、2、3、4、6、8、12、16周各取出1组试样，用滤纸除去试样表面水分后，真空干燥48 h，称重，计算试样重量损失率=[(初重-现重)/初重]×100%。(3)将称重后的试样在MTS NEW 810 MATERIAL TEST SYSTEM材料实验机上进行弯曲强度测试，并根据实验测试所得压力-应变曲线计算各组试样相应的弯曲模量值，以考察材料的强度与模量随时间衰减情况。
复合材料动物实验。选用新西兰雄性白兔25只，体重1.4～2.6 kg,随机分为5组，分别 2、4、6、8、12周组。每组动物标本行胫骨截骨后，2只以未改性纤维板材，2只以改性纤维板材，1只以普通按骨钢板固定。
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对固定部位骨及钢板、板材、螺钉行硬包埋切片，方法如下：脱水完毕的骨组织浸放于甲基丙烯酸甲酯/邻苯二甲酸二丁酯液内，置40 ℃烘箱固化成型；切片，厚度50 μm(10片/例)、80 μm(10片/例)；50 μm切片分别以Cason和甲苯胺蓝染色，80 μm切片待行荧光观察。
骨表面软组织包埋：甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，待行光镜观察。
3 实验结果与讨论
3.1 体外降解
复合材料的体外降解情况主要从试样的重量损失、强度及模量衰减情况来考察。试样的重量损失是将各组试样自浸泡液中取出，经真空干燥恒重后，计算其重量损失情况。每组取3个试样重量损失的算术平均值。各组试样的重量损失-时间关系曲线如图1所示。
试样的强度及模量衰减与浸泡时间的关系曲线如下图2所示。
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从图1的试样重量衰减及强度衰减-时间关系曲线中均可明显地看出，未改性甲壳素纤维作为增强相的复合材料板材，其重量衰减及强度衰减明显慢于改性纤维之复合材料。由于我们所考察的两种复合材料板材是在制备工艺完全一致，基体均为PDLLA树脂，且两种复合材料中纤维含量均占60%(wt%)，因而在比较其降解性时，不同板材降解特异性基本可归结于纤维性质的不同。对此现象我们认为，它的出现主要基于以下2个原因：(1)甲壳素经酰化改性后，由于-OH、-NH-基的减少，降低了甲壳素分子内、分子间的氢键缔合点的数目；同时由于分子链侧基的引入，基于位阻效应增大了分子间的间距，而主链结构没有改变，仍是易于旋转的醚键，从而提高了改性后的酰基化甲壳素分子的柔顺性，使得甲壳素分子有序度降低，结晶度明显下降，这样在发生水解过程时，酰化甲壳素纤维分子间更易于水的渗透和扩散，事实上提高了其水解速率；(2)甲壳素经酰基化改性后，原来的-OH基变成了酯键，其材料本身在有机溶剂中溶解性能得以改善的同时，由于酯链本身更易于水解，因而客观上也提高了其水解速率。当然真实的降解过程可能非常复杂，由于板材由二相体系构成，纤维除断面外，均被包裹在树脂基体中，因而水解最初主要发生在板材的表面，即以表面浸蚀为主。当表层树脂发生降解，导致最外层纤维外露时，在溶菌酶及聚乳酸降解产物乳酸的酸性催化下，甲壳素纤维开始水解，由此循序渐进地开始水解过程。由于体外降解实验所采用的乳酸钠林格注射液中，不含溶菌酶，所以在体外实验中，甲壳素纤维的降解速率可能有会慢于在体内的降解。这一点在动物体内实验中也可以得到确认。
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图1 甲壳素/聚乳酸复合材料在37 ℃乳酸钠林格浸泡液中重量衰减随浸泡时间的变化关系
Fig 1 Variation of mass weight of absorbable chitin/PLA composite materials submerged in injectio natrii lactatis ringeri at 37℃
图2 甲壳素/聚乳酸复合材料在37 ℃乳酸钠林格浸泡液中强度及模量衰减随浸泡时间的变化关系
Fig 2 Effect of time on the (a)flexural strength and (b)flexural modulus of chitin/PLA composite materials submerged in injectio natrii lactatis ringeri at 37 ℃
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从图2可以看出，改性甲壳素纤维增强复合材料的强度及模量的衰减明显快于未改性甲壳素纤维复合材料。这种现象可能与未改性甲壳素纤维较高的结晶度和分子链存在高密度分子内、分子间氢键有关，因为高结晶度和高密度氢键的存在使得水分子对其浸润和渗透更困难，从而使其能在水解作用下仍保持相当的强度。
但是应当看到，虽然改性甲壳素纤维复合材料板材强度及模量的衰减速率较未改性甲壳素纤维复合材料的衰减速率快，但在浸泡16周后其弯曲强度值仍有31.42 MPa。与此形成鲜明对照的是，文献[2]报道的PGA/PLA自增强复合材料虽具有265 MPa的初始弯曲强度，但其在37 ℃蒸馏水中浸泡4周后，其弯曲强度值即降低到松质骨水平(10～20MPa)，难以实现对骨折的有效固定。同时应当指出，本实验板材的铺层顺序是0°/45°/-45°/0°，而文献[2]报道的自增强PGA/PLA复合材料棒中的纤维方向均为0°，从复合材料力学可以推知，若本实验中板材的纤维方向也全部采用0°铺层，则其弯曲强度将会明显提高。很显然，从这一点来看甲壳素/聚乳酸复合材料在耐强度衰减方面具有明显的优势。
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3.2 动物体内降解
生物可吸收聚合物在动物体内的降解通常是通过细胞的吞噬作用。主要是通过巨噬细胞，偶通过粒细胞的吞噬作用，后期巨噬细胞等渐融合为多核巨细胞，吞噬去除降解碎片。甲壳素纤维降解碎片可于板材植入后1月出现在多核巨细胞内，此后吞噬过程渐趋明显，不仅出现在板材周围的多核巨细胞内，而且渐出现在远离板材的纤维组织中的巨细胞中。聚乳酸的降解一方面通过上述吞噬作用，另一方面本实验发现了其另外的转移途径。几乎所有的标本中都出现了一层板材与骨间的无定形物质界膜，分析认为，该界膜即为聚乳酸水解(可能也有甲壳素纤维水解)的碎片渗出变性的蛋白等组成。病理切片发现，随时间的推移，新生骨痂及板层骨腔隙内可出现同样结构的物质，而在板材中间及周围软组织中，则未发现同样的现象，提示这些水解产物可能通过骨的哈佛氏系统转运至组织液与血液中，进入正常的代谢途径。当然，并不否认其通过周围软组织进入代谢途径。可能因为界膜相对稳定，而哈佛氏系统转运能力有限，故引起降解物的沉积。因此，测定该厚度，可以粗略推测板材降解速度和局部转移能力。
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具体测量分析过程如下：将每个标本作10个切片，在光学显微镜下观察和测量每个切片中无定型物质的平均厚度，将各组标本测出的数据用SAS软件包进行方差分析，以考察其统计学规律和意义。不同标本组之间的差异由Duncan检验。若将不同时间组、不同材料的标本统计学分析结果，以均值和方差的形式表达，其降解规律可示于图3。
从标本切片的光镜观察中也可以发现，甲壳素纤维束由紧密结合逐渐变得松散，特别是纤维单丝间的空隙进行性增大，且单丝断面形态逐渐膨胀，都提示为降解过程。说明随着水分子的不断浸渗，聚乳酸本体水解的不断进行，含有溶菌酶的体液不断渗透到纤维束相邻纤维之间，并对纤维产生溶涨而逐渐水解的机制。降解最明显发生于板材植入后4～6周，4周组和6周组纤维束变化较为显著，不定形物质形成最多，临床表现板材表面渗出也最明显，且窦道形成率较高，此后进入相对稳定阶段，渗出减少，板材断面变化不大，无定形物形成减少，镜下呈现疤痕纤维增生的表现。
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图3 样本植入时间与降解物厚度的关系(X轴为样本组别：依次为2，4，6，8，12周)
Fig 3 Relation between the thickness of degradation products and the implant period(X-axis refers immersion time to 2,4,6,8,12 weeks respectively)
从骨折固定部位提取标本时，剔除板材表面外后肌组织和表面软组织，经无水乙醇浸泡，空气干燥后，进行扫描电镜观察。样本0206Ⅱ和0208Ⅰ(8周组)的SEM照片如下图4、图5所示。
从图4、图5中样本0206Ⅱ，0208Ⅰ(8周组)的SEM照片中可以看出，聚乳酸基体因出现明显水解而呈不连续状，纤维表面，尤其是相邻纤维之间的基体，因水解断链而出现分离的现象，部分纤维因在应力环境下受到水解而断裂，纤维表面也有因水解腐蚀而造成的皮层剥离的现象。这种水解现象远较体外降解实验中，同时间组试样降解严重。说明材料在体内的降解速率较体外要快。而从植入时间较短样本的SEM照片中可以看出，因植入时间短，基体虽因水解而出现龟裂现象，但基体基本上仍是连续的，仍可以起到传递应力的作用，相邻纤维间的基体并未完全脱离。
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图4 样本0206Ⅱ的SEM形貌
Fig 4 Sample 0206Ⅱ SEM morphology
图5 样本0208ⅠSEM形貌
Fig 5 Sample 0208Ⅰ SEM morphology
4 讨 论
(1)甲壳素/聚乳酸复合材料的体外降解基本上是一个水解过程，且甲壳素与聚乳酸遵循不同的水解机理。甲壳素为溶菌酶催化水解，聚乳酸为本体水解，甲壳素/聚乳酸复合材料的水解是上述二种机理综合作用的结果。由于体外降解实验所用浸泡液不含溶菌酶，所以该复合材料体外降解以聚乳酸水解为主。
, 百拇医药 (2)甲壳素/聚乳酸复合材料的重量衰减和强度衰减均表现为开始阶段衰减较快，随后趋缓的特征。改性甲壳素纤维增强聚乳酸复合材料板材的重量及强度衰减均快于未改性甲壳素纤维之复合材料。改性甲壳素纤维增强/聚乳酸复合材料板材在浸泡4个月后，弯曲强度仍有31.42 MPa。在体外降解条件下，其强度保持率和浸泡后的绝对强度值均明量优于初始弯曲强度远高于它的PGA/PLA自增强复合材料，表明其在抗水解及强度保持方面具有明显的优势和潜在的应用前景。
(3)甲壳素/聚乳酸复合材料植入物的体内降解是在水解的基础上，主要通过巨噬细胞的吞噬作用来实现代谢的；当大分子降解成小分子后，也可通过骨的哈佛氏系统转运至组织液或血液中，进入正常代谢途径。
上海市科学技术发展基金课题(98JC1405)
参考文献
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(收稿：1998-12-02 修回：1999-05-06), 百拇医药