类肝素化抗凝血材料的研究—PVA，PET及PEU的磺化反应及血液相容性
作者：汤顺清 邹 翰
单位：暨南大学 生物医学工程研究所，广州 510632
关键词：类肝素；PEU树脂；PET纤维；磺化
生物医学工程学杂志990306 摘要 通过研究PVA，PET接枝纤维及PEU树脂磺化反应前后的物理机械性能和化学结构的变化来初步探讨生物材料的类肝素化反应，结果表明该类材料直接磺化容易，但要求有适当的磺化度才能保持材料原有物理机械性能。血小板吸附实验表明PVA，PET接枝纤维及PEU树脂磺化后对血小板的吸附明显减少，表现出类似肝素的抗凝血活性。
Study on Heparin-like Materials—Sulfonization and Blood
Compatibility of PVA, PET and PEU
, 百拇医药
Tang Shunqing Zou Han
(Biomedical Engineering Institute of Jinan University, Guangzhou 510632)
Absrtact In this paper, physical mechanical properties and changes of chemical structures of some heparin-like biomaterials were studied before and after sulfonization of PVA, PET and PEU. The resutls showed that these materials were easy to be sulfonized, but it was necessary to keep actual sulfonization degree for their mechanical properties. Platelets adhesion experiments demonstrated that the materials adsorbed very few and showed heparin-like anti-coagulant property after sulfonization.
, 百拇医药
Key words Heparin-like PEU PET Sulfonization
1 前 言
研制抗凝血性生物材料一直是生物医学工程的一个重要课题[1]。目前提高生物材料抗凝血性方法主要是通过材料表面改性(接枝偶合亲水性链，设计微相分离结构，材料复合)或引入活性药物(固定肝素，尿激酶等)来实现，其中以材料表面固定肝素最能引起生物材料工作者的兴趣，原因在于肝素作为一种天然的凝血抑制剂，如果生物材料在使用过程中不断释放这种物质便可达到抗凝血效果，遗憾的是至今还没有找到有效的方法使材料含这种物质而具有有效和长期的抗凝血活性[2]。我们课题组在研究肝素抗凝血机制的时候，发现它的抗凝血活性与肝素分子链上的带负荷电的磺酸基及羧基有关，且主要与磺酸基有关；而后在与类似肝素链结构的甲壳糖上引入一定数量的磺酸基和羧基，材料的抗凝血活性果然大大提高；后来在碳纤维上引入磺酸基和羧基也有类似的抗凝血活性[3]。因此本文拟在通用的生物材料—聚乙烯醇(PVA)，聚酯(PET)，聚醚氨酯(PEU)的表面引入磺酸基或羧基，以期获得具有类似肝素的抗凝血活性的生物材料。
, 百拇医药
聚氨酯材料在高分子链中引入含磺酸基的链节研究已有诸多报道[4，5]，磺化后材料的抗凝血性都有不同程度的提高，但磺化度不如肝素高，还没有更近似地反映肝素每个链节单元上含磺酸基的化学结构特征；PVA及其接枝纤维材料的磺化反应研究虽有报道[6]，但没有发现它与血液相容性关系的研究；PET及其接枝纤维的磺化反应及抗凝血活性还未见报道。因此本文初步探索PVA，PET及PEU的磺化反应及其对材料物理机械性能和血液相容性的影响。
2 实验方法
2.1 材料及其处理方法
PVA及PET纤维(广东新会纤维厂)经丙酮抽提24 h后干燥，部分纤维在r-Co60幅照后(辐照剂量为106 rad)接枝聚苯乙烯-二乙烯基苯(乳液聚合，乳化剂为十二烷基苯磺酸钠，浴比为5∶1)得到一定接枝率的纤维(中山大学材料研究所制)。
, http://www.100md.com
PEU树脂经二链辊混练后甲苯抽提24 h干燥备用。
2.2 磺化反应
PVA，PET及其接枝纤维在二氯乙烷中溶胀30 min后，在冰浴中30 min内加一定量的氯磺酸-二氯乙烷混合液，然后在30 ℃反应3 h，产物经醇解氯磺酸，水洗，离心(3000 rpn)沉淀得产物。
同样，PEU在二氧六环或二氯乙烷中溶解或溶胀30 min后，在冰浴中半30 min内加一定量的氯磺酸-二氧六环或二氯乙烷混合液，然后在30 ℃反应3 h，产物经醇解氯磺酸，水洗，分液漏斗或沉淀分离得产物。
2.3 红外光谱分析
磺化前后产物磨细后KBr压片，在Perkin-Elmer1700红外光谱仪上录谱。
, 百拇医药 2.4 血小板扩张试验
直接从家兔股动脉取血20 ml，加2%草酸钾1 ml，以1000 rpn离心5 min，取上清液以1∶4.5比例加稀释液(9份生理盐水加1份草酸钾)制成富含血小板血浆，用此血浆在37 ℃下恒温接触材料30 min，然后用稀释液冲洗3次，10 min/次，用50%，80%乙醇各脱水一次，10 min/次，100%乙醇脱水3次，10 min/次，醋酸异戊酯置换3次，5 min/次，干燥后在T-300扫描电子显微镜下观察血小板的形态。
2.5 溶血试验
从健康成年家兔股动脉取血20 ml放入预先加有1 ml 2%草酸钾的烧杯中，制成新鲜抗凝血，取此血8 ml加生理盐水10 ml稀释，得稀释兔血。
将待测试样品约1 g加入试管中，用蒸馏水冲洗2次，再用生理盐水冲洗2次，加入生理盐水10 ml，在水浴箱中37 ℃保温1 h。阳性对照和阴性对照分别用10 ml蒸馏水和10 ml生理盐水各加稀释兔血0.2 ml，与样品同样操作。随即以850 r/min速度离心5 min，取上清液移入比色皿中，用722型分光光度计在545 nm波长下测定吸光度。溶血率以下式计算：
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3 实验结果
3.1 磺化反应实验结果
PVA-g-PS-DVB经过量氯磺酸磺化反应后，经滴定得纤维的交换容量约7.0 mmol/g，计算得苯环的磺化率为72%(设每个苯环有一个磺酸基)。从红外光谱(图1)可看出磺化反应后纤维上有大量的磺酸基(图上出现了1220 cm-1的-SO2-伸振吸收峰[6])。
a. before reaction; b. after reaction
图1 PVA-g-PS-DVB磺化反应前后的红外光谱
Fig 1 1R sepectra of PVA-g-PS-DVB fiber before and after sulphonating reaction
, http://www.100md.com
PET纤维分别用1∶10(纤维重 g∶氯磺酸体积 ml)，1∶5，1∶1，3∶1，5∶1的氯磺酸磺化，发现1∶10时，产物完全溶于醇水体系中，1∶5或1∶1时，产物呈粘稠状，不溶于醇水体系，而在5∶1时纤维保持完好，这证明PET纤维磺化后，产物的水溶性主要取决于磺化程度，同时也要考虑到剧烈反应引起的高分子链断裂使其溶解性增强。但磺化点是在高分子链苯环上还是在氧原子邻近的碳原子上有待于进一步研究。
PET-g-PS-DVB纤维分别用1∶10(纤维重 g∶氯磺酸体积 ml)，1∶1，3∶1的氯磺酸磺化，发现1∶10时，产物呈粉碎固体状，不溶于醇水体系，而在3∶1及5∶1时纤维保持完好。这证明PET纤维接枝少量的聚苯乙烯-二乙烯基苯后，在过量氯磺酸磺化后，产物不溶于水，但纤维强度完全破坏。这证明在保持纤维状态完好的前提下，PET纤维接枝后其磺化度较PET可以适当提高(根据耗氯磺酸体积)。从红外光谱图(图2)可看出磺化反应后纤维上有大量的磺酸基存在(图上出现了1200 cm-1的-SO2-伸振吸收峰)。
, http://www.100md.com
a. PET fiber before reaction; b. PET fiber after reaction;
c. PET-g-PS-DVB fiber before reaction; d. PET-g-PS-DVB fiber after reaction
图2 PET，PET-g-PS-DVB磺化反应前后的红外光谱
Fig 2 IR spectra of PET, PET-g-PS-DVB fibers berfore and after sulphonating reaction
PEU树脂分别用1∶5(纤维重 g∶氯磺酸体积 ml)，2∶3，2∶1，5∶1的氯磺酸磺化，发现1∶5时，产物完全溶于醇水体系中，2∶3时，产物溶于二氯乙烷-醇混合溶剂中，但加入大量水可沉淀出产物，在2∶1时树脂不溶解，但破碎。而在5∶1时，树指保持原状。从红外光谱图(图3)可看出磺化反应后树脂上有一定量的磺酸基存在(图上出现了120 -1的-SO2-伸振吸收峰)。
, 百拇医药
a. before; b. after reaction
图3 PEU磺化反应前后的红外光谱
Fig 3 IR spectra of PEU resin before and after sulphonationg reaction
3.2 PVA-g-PS-DVB磺化纤维对血小板的吸附
从扫描电镜下(图4)可看出PVA-g-PS-DVB纤维磺化后对血小板的粘附比原纤维减少，这证明磺化作用后材料表现出肝素化性质，即减少了血小板粘附-变形-凝固的可能。
, http://www.100md.com a. before reaction b. after reaction
图4 PVA-g-PS-DVB磺化反应前后吸附血小板的扫描电镜照片(a,b×2K)
Fig 4 SEM graphs of paltelets adsorbed on PVA-g-PS-DVB fiber before
and after sulphonating reaction(a,b×2K)
从图5可看出PET，PET接枝PS-DVB经磺化后对血小板的粘附比原纤维明显减少，这证明磺化作用后材料表现出肝素化性质，同时PET接枝PS-DVB纤维磺化后具有更优越的抗凝血性。
, http://www.100md.com
a. PET fiber before reaction; b. PET fiber after reaction; c. PET-g-PS-DVB fiber before reaction;
d. PET-g-PS-DVB fiber after reaction
图5 PET，PET-g-PS-DVB磺化反应前后吸附血小板的扫描电镜照片(a×2k,b,c,d×3.5K)
Fig 5 SEM graphs of paltelets adsorbed on PET, PET-g-PS-DVB fibers before
and after sulphonating reaction(a×2k, b,c,d×3.5K)
从扫描电镜下(图6)可看出PEU树脂磺化后对血小板的粘附比PEU减少，这证明磺化作用后材料也表现出肝素化性质。
, 百拇医药
a. before raction b. after reaction
图6 PEU磺化反应前后吸附血小板的扫描电镜照片(a,b×3.5K)
Fig 6 SEM graphs of platelets adsorbed on PEU resin before and after sulphonation reaction (a,b×3.5k)
PVA-g-PS-DVB，PET，PET-g-PS-DVB及PEU磺化前的溶血率分别为3.8%、3.1%、2.9%、1.8%；磺化后的溶血率则分别为2.2%、2.1%、1.4%、0.9%。结果表明材料在磺化后血液相容性都有一定程度的改善。它们的溶血率都小于5%，符合生物材料的使用要求。
参考文献
1 邹 翰.抗凝血材料的研究状况.生物医学工程通报，1994；6(1)∶1
, 百拇医药
2 顾汉卿，徐国风.生物材料学.天津：天津科技翻译出版公司.1993∶145-160
3 汤顺清，黄 鹏，岳中仁等.碳基纤维的血液相容性研究.北京：1996C-MRS论文集，1996；11∶1296
4 Han DK, Lee NY, Park KD et al. Heparing-like anticoagulant activity of sulphonated poly(ethylene oxide)and sulphonated poly(ethylene oxide)-grafted polyurethane.Biomaterials, 1995; 16(6)∶467
5 Grasel TG,Cooper SL.Properties and biological interactions of polyurethane anionomers:effect of sulfonate incorporation. J Biomed Mater Res, 1989;(23)∶311
6 陈允槐编.红外光谱法及其应用.上海：上海交通大学出版社.1993∶94-98
(收稿：1998-04-14 修回：1998-07-30), http://www.100md.com
单位：暨南大学 生物医学工程研究所，广州 510632
关键词：类肝素；PEU树脂；PET纤维；磺化
生物医学工程学杂志990306 摘要 通过研究PVA，PET接枝纤维及PEU树脂磺化反应前后的物理机械性能和化学结构的变化来初步探讨生物材料的类肝素化反应，结果表明该类材料直接磺化容易，但要求有适当的磺化度才能保持材料原有物理机械性能。血小板吸附实验表明PVA，PET接枝纤维及PEU树脂磺化后对血小板的吸附明显减少，表现出类似肝素的抗凝血活性。
Study on Heparin-like Materials—Sulfonization and Blood
Compatibility of PVA, PET and PEU
, 百拇医药
Tang Shunqing Zou Han
(Biomedical Engineering Institute of Jinan University, Guangzhou 510632)
Absrtact In this paper, physical mechanical properties and changes of chemical structures of some heparin-like biomaterials were studied before and after sulfonization of PVA, PET and PEU. The resutls showed that these materials were easy to be sulfonized, but it was necessary to keep actual sulfonization degree for their mechanical properties. Platelets adhesion experiments demonstrated that the materials adsorbed very few and showed heparin-like anti-coagulant property after sulfonization.
, 百拇医药
Key words Heparin-like PEU PET Sulfonization
1 前 言
研制抗凝血性生物材料一直是生物医学工程的一个重要课题[1]。目前提高生物材料抗凝血性方法主要是通过材料表面改性(接枝偶合亲水性链，设计微相分离结构，材料复合)或引入活性药物(固定肝素，尿激酶等)来实现，其中以材料表面固定肝素最能引起生物材料工作者的兴趣，原因在于肝素作为一种天然的凝血抑制剂，如果生物材料在使用过程中不断释放这种物质便可达到抗凝血效果，遗憾的是至今还没有找到有效的方法使材料含这种物质而具有有效和长期的抗凝血活性[2]。我们课题组在研究肝素抗凝血机制的时候，发现它的抗凝血活性与肝素分子链上的带负荷电的磺酸基及羧基有关，且主要与磺酸基有关；而后在与类似肝素链结构的甲壳糖上引入一定数量的磺酸基和羧基，材料的抗凝血活性果然大大提高；后来在碳纤维上引入磺酸基和羧基也有类似的抗凝血活性[3]。因此本文拟在通用的生物材料—聚乙烯醇(PVA)，聚酯(PET)，聚醚氨酯(PEU)的表面引入磺酸基或羧基，以期获得具有类似肝素的抗凝血活性的生物材料。
, 百拇医药
聚氨酯材料在高分子链中引入含磺酸基的链节研究已有诸多报道[4，5]，磺化后材料的抗凝血性都有不同程度的提高，但磺化度不如肝素高，还没有更近似地反映肝素每个链节单元上含磺酸基的化学结构特征；PVA及其接枝纤维材料的磺化反应研究虽有报道[6]，但没有发现它与血液相容性关系的研究；PET及其接枝纤维的磺化反应及抗凝血活性还未见报道。因此本文初步探索PVA，PET及PEU的磺化反应及其对材料物理机械性能和血液相容性的影响。
2 实验方法
2.1 材料及其处理方法
PVA及PET纤维(广东新会纤维厂)经丙酮抽提24 h后干燥，部分纤维在r-Co60幅照后(辐照剂量为106 rad)接枝聚苯乙烯-二乙烯基苯(乳液聚合，乳化剂为十二烷基苯磺酸钠，浴比为5∶1)得到一定接枝率的纤维(中山大学材料研究所制)。
, http://www.100md.com
PEU树脂经二链辊混练后甲苯抽提24 h干燥备用。
2.2 磺化反应
PVA，PET及其接枝纤维在二氯乙烷中溶胀30 min后，在冰浴中30 min内加一定量的氯磺酸-二氯乙烷混合液，然后在30 ℃反应3 h，产物经醇解氯磺酸，水洗，离心(3000 rpn)沉淀得产物。
同样，PEU在二氧六环或二氯乙烷中溶解或溶胀30 min后，在冰浴中半30 min内加一定量的氯磺酸-二氧六环或二氯乙烷混合液，然后在30 ℃反应3 h，产物经醇解氯磺酸，水洗，分液漏斗或沉淀分离得产物。
2.3 红外光谱分析
磺化前后产物磨细后KBr压片，在Perkin-Elmer1700红外光谱仪上录谱。
, 百拇医药 2.4 血小板扩张试验
直接从家兔股动脉取血20 ml，加2%草酸钾1 ml，以1000 rpn离心5 min，取上清液以1∶4.5比例加稀释液(9份生理盐水加1份草酸钾)制成富含血小板血浆，用此血浆在37 ℃下恒温接触材料30 min，然后用稀释液冲洗3次，10 min/次，用50%，80%乙醇各脱水一次，10 min/次，100%乙醇脱水3次，10 min/次，醋酸异戊酯置换3次，5 min/次，干燥后在T-300扫描电子显微镜下观察血小板的形态。
2.5 溶血试验
从健康成年家兔股动脉取血20 ml放入预先加有1 ml 2%草酸钾的烧杯中，制成新鲜抗凝血，取此血8 ml加生理盐水10 ml稀释，得稀释兔血。
将待测试样品约1 g加入试管中，用蒸馏水冲洗2次，再用生理盐水冲洗2次，加入生理盐水10 ml，在水浴箱中37 ℃保温1 h。阳性对照和阴性对照分别用10 ml蒸馏水和10 ml生理盐水各加稀释兔血0.2 ml，与样品同样操作。随即以850 r/min速度离心5 min，取上清液移入比色皿中，用722型分光光度计在545 nm波长下测定吸光度。溶血率以下式计算：
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3 实验结果
3.1 磺化反应实验结果
PVA-g-PS-DVB经过量氯磺酸磺化反应后，经滴定得纤维的交换容量约7.0 mmol/g，计算得苯环的磺化率为72%(设每个苯环有一个磺酸基)。从红外光谱(图1)可看出磺化反应后纤维上有大量的磺酸基(图上出现了1220 cm-1的-SO2-伸振吸收峰[6])。
a. before reaction; b. after reaction
图1 PVA-g-PS-DVB磺化反应前后的红外光谱
Fig 1 1R sepectra of PVA-g-PS-DVB fiber before and after sulphonating reaction
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PET纤维分别用1∶10(纤维重 g∶氯磺酸体积 ml)，1∶5，1∶1，3∶1，5∶1的氯磺酸磺化，发现1∶10时，产物完全溶于醇水体系中，1∶5或1∶1时，产物呈粘稠状，不溶于醇水体系，而在5∶1时纤维保持完好，这证明PET纤维磺化后，产物的水溶性主要取决于磺化程度，同时也要考虑到剧烈反应引起的高分子链断裂使其溶解性增强。但磺化点是在高分子链苯环上还是在氧原子邻近的碳原子上有待于进一步研究。
PET-g-PS-DVB纤维分别用1∶10(纤维重 g∶氯磺酸体积 ml)，1∶1，3∶1的氯磺酸磺化，发现1∶10时，产物呈粉碎固体状，不溶于醇水体系，而在3∶1及5∶1时纤维保持完好。这证明PET纤维接枝少量的聚苯乙烯-二乙烯基苯后，在过量氯磺酸磺化后，产物不溶于水，但纤维强度完全破坏。这证明在保持纤维状态完好的前提下，PET纤维接枝后其磺化度较PET可以适当提高(根据耗氯磺酸体积)。从红外光谱图(图2)可看出磺化反应后纤维上有大量的磺酸基存在(图上出现了1200 cm-1的-SO2-伸振吸收峰)。
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a. PET fiber before reaction; b. PET fiber after reaction;
c. PET-g-PS-DVB fiber before reaction; d. PET-g-PS-DVB fiber after reaction
图2 PET，PET-g-PS-DVB磺化反应前后的红外光谱
Fig 2 IR spectra of PET, PET-g-PS-DVB fibers berfore and after sulphonating reaction
PEU树脂分别用1∶5(纤维重 g∶氯磺酸体积 ml)，2∶3，2∶1，5∶1的氯磺酸磺化，发现1∶5时，产物完全溶于醇水体系中，2∶3时，产物溶于二氯乙烷-醇混合溶剂中，但加入大量水可沉淀出产物，在2∶1时树脂不溶解，但破碎。而在5∶1时，树指保持原状。从红外光谱图(图3)可看出磺化反应后树脂上有一定量的磺酸基存在(图上出现了120 -1的-SO2-伸振吸收峰)。
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a. before; b. after reaction
图3 PEU磺化反应前后的红外光谱
Fig 3 IR spectra of PEU resin before and after sulphonationg reaction
3.2 PVA-g-PS-DVB磺化纤维对血小板的吸附
从扫描电镜下(图4)可看出PVA-g-PS-DVB纤维磺化后对血小板的粘附比原纤维减少，这证明磺化作用后材料表现出肝素化性质，即减少了血小板粘附-变形-凝固的可能。
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图4 PVA-g-PS-DVB磺化反应前后吸附血小板的扫描电镜照片(a,b×2K)
Fig 4 SEM graphs of paltelets adsorbed on PVA-g-PS-DVB fiber before
and after sulphonating reaction(a,b×2K)
从图5可看出PET，PET接枝PS-DVB经磺化后对血小板的粘附比原纤维明显减少，这证明磺化作用后材料表现出肝素化性质，同时PET接枝PS-DVB纤维磺化后具有更优越的抗凝血性。
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a. PET fiber before reaction; b. PET fiber after reaction; c. PET-g-PS-DVB fiber before reaction;
d. PET-g-PS-DVB fiber after reaction
图5 PET，PET-g-PS-DVB磺化反应前后吸附血小板的扫描电镜照片(a×2k,b,c,d×3.5K)
Fig 5 SEM graphs of paltelets adsorbed on PET, PET-g-PS-DVB fibers before
and after sulphonating reaction(a×2k, b,c,d×3.5K)
从扫描电镜下(图6)可看出PEU树脂磺化后对血小板的粘附比PEU减少，这证明磺化作用后材料也表现出肝素化性质。
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a. before raction b. after reaction
图6 PEU磺化反应前后吸附血小板的扫描电镜照片(a,b×3.5K)
Fig 6 SEM graphs of platelets adsorbed on PEU resin before and after sulphonation reaction (a,b×3.5k)
PVA-g-PS-DVB，PET，PET-g-PS-DVB及PEU磺化前的溶血率分别为3.8%、3.1%、2.9%、1.8%；磺化后的溶血率则分别为2.2%、2.1%、1.4%、0.9%。结果表明材料在磺化后血液相容性都有一定程度的改善。它们的溶血率都小于5%，符合生物材料的使用要求。
参考文献
1 邹 翰.抗凝血材料的研究状况.生物医学工程通报，1994；6(1)∶1
, 百拇医药
2 顾汉卿，徐国风.生物材料学.天津：天津科技翻译出版公司.1993∶145-160
3 汤顺清，黄 鹏，岳中仁等.碳基纤维的血液相容性研究.北京：1996C-MRS论文集，1996；11∶1296
4 Han DK, Lee NY, Park KD et al. Heparing-like anticoagulant activity of sulphonated poly(ethylene oxide)and sulphonated poly(ethylene oxide)-grafted polyurethane.Biomaterials, 1995; 16(6)∶467
5 Grasel TG,Cooper SL.Properties and biological interactions of polyurethane anionomers:effect of sulfonate incorporation. J Biomed Mater Res, 1989;(23)∶311
6 陈允槐编.红外光谱法及其应用.上海：上海交通大学出版社.1993∶94-98
(收稿：1998-04-14 修回：1998-07-30), http://www.100md.com