TGF-β与BMP复合材料的骨修复作用
作者：孙玉鹏 张皖清 马福成 陈万禄
单位：100037 北京,解放军第三O四医院骨科中心(孙玉鹏);第四军医大学附属口腔医学院颌面外科(张皖清);第四军医大学附属西京医院病理科(马福成、陈万禄)
关键词：转化生长因子β；骨形成蛋白；骨缺损；骨修复；骨生成
中华创伤杂志/980210.htm 【摘要】 目的 探讨转化生长因子β(TGF-β)与骨形成蛋白(BMP)复合后对节段性骨缺损的修复作用,以及在骨修复过程中TGF-β和BMP之间的相互作用。方法 采用以系列化学方法处理的小牛松质骨作为载体,将一定量的TGF-β和/或BMP与之复合,形成TGF-β/载体、BMP/载体和TGF-β/BMP/载体复合物(其中含TGF-β 120μg、BMP12mg),分别修复1.5cm兔桡骨节段性骨缺损。术后4、8、12、16周取材,进行放射学和组织学观察。结果 术后4周,植入TGF-β/载体的缺损区内可见不均匀絮状放射阴影,外骨膜呈增生反应,骨折线模糊不清,缺损区尚未完全桥接;植入BMP/载体组新生骨痂明显,密度均匀,缺损区两断端骨折线隐约可见;在植入TGF-β/BMP/载体的缺损区可见均匀的高密度阴影,桥接骨缺损的两端,骨折线模糊。术后第12～16周3组缺损区完全性修复,其密度近正常骨,可见皮质骨和骨髓腔结构。16周时TGF-β和TGF-β/BMP组骨缺损区周围外骨痂少,而BMP组中仍可见较多尚未完全吸收的外骨痂。结论 TGF-β/BMP复合后早期骨修复作用优于单一的TGF-β和BMP,在骨缺损修复过程中TGF-β和BMP有良好的协同作用。
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Effect of Composite of Transforming Growth Factor β and Bone Morphogenetic Protein on Repairing Bone Defects SUN Yu-peng, ZHANG Wan-qing, MA Fu-cheng, et al. Center of Orthopaedics, 304th Hospital of PLA, Beijing 100037
【Abstract】 Aim To evaluate the effect of transforming growth factor β (TGF-β) and bone morphogenetic protein (BMP) composite on the repairing of large segmental bone defects and to discuss the interaction between TGF-β and BMP during bone repair. Methods Segmental bone defects for 1.5cm were created in the mid-upper part of the radial shafts of 48 adult rabbits. The defects were filled with implants of TGF-β/carrier, BMP/carrier, and TGF-β/BMP/carrier (TGF-β 120Ug, BMP 12mg) separately. The defects were examined radiographically and histologically at 4, 8, 12 and 16 weeks post-operation. Results In the group with TGF-β/BMP composite, the defects area was bridged with callus of uniform radiodensity at 4 weeks, and cortices of the cut ends were obscured by new bones. At 16 weeks post-operation, the defects were bridged by uniform new bones and the cut ends of cortex could not be seen in all groups. In the group with BMP/carrier, the defects were filled with more irregular woven bone callus than those in the other two groups. Defects implanted with TGF-β/BMP in animals killed at 16 weeks showed histologically new lamellar and woven bone which was formed in continuity with the cut ends of the cortex. Medullar canal was recanalized and contained marrow elements with normal appearance. Conclusion These data demonstrate not only the synergistic action between TGF-β/BMP in the process of bone healing, but also a better effect of TGF-β/BMP composite than single TGF-β or BMP on bone repair, especially in the early stage of bone repair process.
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【Key words】 Transforming growth factor β Bone morphogenetic protein Bone defect Bone repair Osteogenesis
骨修复是一个极其复杂而有序的过程。近年的研究表明,生长因子在骨愈合过程中起重要作用。骨形成蛋白(BMP)是骨生成的启动因子,能诱导间充质细胞分化成软骨细胞和骨细胞,对骨愈合有明显促进作用。转化生长因子β(TGF-β)机体内含量最为丰富,在胚胎发育、创口愈合、基质形成、骨组织形成及改建过程中都起着重要作用。笔者以前的实验显示,TGF-β刺激间充质细胞的增殖和分化,形成成骨细胞和软骨细胞,从而诱导新骨的生成,并且具有修复大块节段性骨缺损的能力[1，2]。本实验旨在探讨TGF-β/BMP复合材料对骨缺损的修复作用及TGF-β和BMP在骨修复中的相互作用。
材料与方法
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1.复合材料的制备[3]:以新鲜牛血为原料,离心,分离出血小板。采用酸醇抽提方法,提取血小板蛋白,并先后经过2次Bio-Gel P60柱层析,分离纯化出TGF-β[1]。本实验采用的BMP由已建立的方法从小牛皮质骨中提取;选择经化学处理的牛松质骨作为载体。将一定量的TGF-β和/或BMP分别溶解后与载体在真空条件下进行充分混匀,形成3种复合物,即TGF-β/载体、BMP/载体和TGF-β/BMP/载体复合物。冻干,γ射线照射消毒。
2.动物实验:健康家兔48只,体重2.5～3.0kg,雌雄不分。随机分成3组,每组18只。在3%戊巴比妥钠静脉麻醉下,手术显露右桡骨中上段,连同骨膜一起切除,造成桡骨1.5cm节段性骨缺损。以等渗盐水清洗创口后,分别植入TGFC-β/载体、BMP/载体和TGF-β/BMP/载体复合材料60mg(其中分别含TGF-β 120μg、BMP 12mg)。逐层缝合伤口。术后不给抗生素,不加外固定。动物分笼饲养,常规饮食。
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3.观察指标:(1)X线检查:分别在术后4、8、12和16周处死动物进行取材。在48kV、25mA、0.12s、75cm的投照条件下由专人作X线拍片及冲洗,观察各组动物骨缺损区的骨痂生长和桥接情况,并根据其愈合程度按Cook等6级评分标准[4]进行量化评估。(2)组织学观察:标本以10%甲醛固定后,混合脱钙液脱钙处理,石蜡包埋切片,HE染色,观察比较各组骨缺损愈合进程,依照Nilsson等骨愈合组织学评分标准[5]进行评分。
4.统计学处理:对X线及组织学评分结果作秩和检验处理(SPLM软件包,第四军医大学统计学教研室)。
结 果
1.X线检查结果:术后4周,植入TGF-β/载体骨缺损区内可见不均匀的放射阴影,外骨膜呈增生反应,骨折线模糊不清,缺损区尚未完全桥接;植入BMP/载体组新生骨痂较明显,密度均匀,缺损区骨折线隐约可见;植入TGF-β/MBP/载体的缺损区可见均匀的高密度阴影桥接骨缺损的两端,骨折线模糊(图1～3)。第8周时,TGF-β组骨缺损区阴影密度明显增高,靠近尺侧部分更为显著,两端骨折线消失,缺损完全桥接;在桡侧尚有少量未完全吸收替代的松质骨载体。BMP组和TGF-β/BMP组骨缺损区阴影密度增高,可见大量钙化的外骨痂,断端骨折线消失。术后12～16周,3组骨缺损区完全骨性修复,骨构建进一步完善,其密度接近正常骨,可见皮质骨和骨髓腔结构;TGF-β组和TGF-β/BMP组骨缺损区周围外骨痂少,而BMP组中仍可见有较多尚未完全吸收的外骨痂。
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表1为骨缺损修复术后放射学评分结果。从秩和检验两两比较来看,术后4周,植入TGF-β/BMP/载体组与TGF-β/载体、BMP/载体两组之间相差非常显著,P值分别为0.003和0.026。术后8周以后,3组之间相差不显著。结果提示,TGF-β/BMP复合物早期诱导成骨作用明显优于单一的BMP和TGF-β;同时还可看出,TGF-β在骨愈合早期(4周)内的作用不及BMP。姫2.组织学观察结果:术后4周,植入TGF-β/载体组骨缺损区可见大片软骨细胞与索条状的新生骨组织连成一体;间充质细胞大量增殖,并可见其有向软骨细胞方向分化的趋势,同时有编织骨形成;BMP组中有大量增殖的间充质细胞,骨缺损区周围软组织中尤为明显,大量新生骨痂形成;植入TGF-β/BMP复合物4周,间充质细胞增殖,形成大片软骨细胞,与新生骨痂连成一片,其中可见有新生的毛细血管。8周时,3组骨
图1 术后4周,TGF-β/载体组骨缺损中见有絮状放射阴影 图2 术后4周,BMP/载体组骨缺损区为不均匀的新生骨痂连接 图3 术后4周,TGF-β/BMP/载体组骨缺损为高密度新生骨痂桥接
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表1 放射学评分结果(
±s) 组别
术后时间(周)
4
8
12
16
TGF-β/BMP/载体
4.75±0.50
5.00±0.00
6.00±0.00
6.00±0.00
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TGF-β/载体
2.25±0.50**
5.00±0.00
5.75±0.50
6.00±0.00
BMP/载体
3.50±0.58*
5.00±0.00
5.75±0.50
6.00±0.00
与TGF-β/BMP/载体组比较 *P<0.026 **P<0.0003表2 骨缺损组织学评分结果() 组别
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术后时间(周)
评分
组织连接
骨痂生成
骨髓
TGF-β/BMP/载体
4
3.0(3)
3.0(3)
1.5(1～2)
8
3.5(3～4)
4.0(4)
, 百拇医药
2.3(2～3)
12
4.0(4)
4.0(4)
3.7(3～4)
16
4.0(4)
4.0(4)
3.7(3～4)
TGF-β/载体
4
2.0(2)**
, 百拇医药
2.2(2～3)
1.3(1～2)
8
2.5(2～)
3.8(3～4)
1.5(1～2)
12
3.3(2～4)
4.0(4)
3.3(2～4)
16
4.0(4)
, 百拇医药 4.0(4)
3.7(3～4)
BMP/载体
4
2.2(2～3)*
2.5(2～3)
1.5(1～2)
8
3.0(3)
3.8(3～4)
2.3(2～3)
12
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3.5(3～4)
4.0(4)
3.5(3～4)
16
4.0(4)
4.0(4)
3.7(3～4)
注:括号中为得分范围 与TGF-β/BMP/载体组比较 *P=0.0162 **P=0.0029
缺损区新生骨痂大量增加,连成大片状,出现大量骨髓细胞。术后12～16周,新生骨痂日趋成熟,骨构建完善,皮质形成,骨髓腔再通。BMP组骨缺损区外仍有大量的编织骨痂。各组骨缺损修复组织学评分结果见表2。
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讨 论
1.TGF-β的骨修复作用:TGF-β在骨修复过程中十分活跃。研究表明,骨折24小时血肿内可见有细胞外TGF-β存在。骨折修复过程中,TGF-β最初由血小板释放于血肿内,继而在软骨痂中由增生、分化的细胞合成[6]。多数学者认为,TGF-β通过刺激成骨细胞的活性与增殖直接促进膜内成骨,并刺激成骨细胞合成Ⅰ型胶原和骨连接素(osteonectin)。体外免疫组织化学观察证实软骨痂中TGF-β的存在,表明TGF-β同时还调节软骨细胞的增殖与分化,以及崐软骨基质的合成。笔者以前的研究证实,TGF-β刺激骨膜间充质细胞增殖与分化而导致新骨生成,并且TGF-β与载体复合后完成了大块节段性骨缺损的修复[1，2]。同样,在本实验中,植入TGF-β复合牛松质骨载体4周时,骨缺损区内大量间充质细胞增殖,并向软骨细胞分化。从间充质细胞的分布区域看,主要集中在缺损区内,靠近尺侧尤甚,从而也证实TGF-β不能诱导异位成骨;换言之,TGF-β的成骨效应来自于其对骨膜间充质细胞的刺激作用。由于TGF-β不能诱导骨缺损区周围软组织中间充质细胞向成骨细胞和软骨细胞增殖与分化,其成骨范围仅局限于骨缺损区内,因此提高了成骨效率,也有利于新生骨质的进一步构建。植入TGF-β/载体、TGF-β/BMP/载体复合物16周,缺损区骨皮质形成、骨髓腔再通而外骨痂少。与之形成对照的是,BMP组16周时缺损区周围仍存在大量的编织骨痂。这提示,TGF-β在骨构建过程中起重要作用。当然,从另一方面也证实了BMP具有强大的异位诱导成骨作用。
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2.TGF-β和BMP在骨修复中的相互作用:本实验结果表明,缺损区植入TGF-β/BMP复合物其早期(4周)的骨诱导作用明显优于单纯TGF-β组,尤其是新生骨痂的形成明显多于单纯TGF-β组和BMP组。从组织学上可以看出,4周时植入TGF-β/BMP复合物的骨缺损区外软组织中间充质细胞大量增殖,并向缺损区内移行;而植入TGF-β/载体的缺损区,由于TGF-β无异位成骨活性,间充质细胞的增殖与分化仅局限在缺损区内。BMP的异位骨诱导作用弥补了TGF-β的不足;另一方面,TGF-β可促进已分化的成骨细胞和软骨细胞的增殖及其细胞外基质的合成,这是BMP所不及的。二者互为补充,从而使骨生成作用得以加强。
BMP是一类酸性多肽,是TGF-β超家族成员,能诱导间充质细胞向骨和软骨发生不可逆转的分化。大量的研究表明,BMP是一种高效的骨诱导物质,对骨折愈合及骨缺损修复有促进作用。然而,从骨组织中提取的BMP不是单一分子的蛋白,而是多种蛋白的混合物。实验表明,将BMP粗提物进一步纯化为单一分子后,其骨诱导活性降低,甚至无骨诱导作用。因此有人认为,BMP的骨诱导作用是其与其他生长因子共同作用的结果。BMP对于已分化的骨细胞没有刺激作用。本实验结果证实了上述理论假设,即在骨缺损修复过程中TGF-β与BMP之间有良好的协同作用,尤其在骨修复早期;TGF-β/BMP复合物的骨修复作用明显优于单一的TGF-β和BMP。
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目前,TGF-β的应用研究方兴未艾,BMP在国内外均已进入临床期研究。TGF-β/BMP复合应用必将大大降低单一BMP或TGF-β的用量,并可显著增加骨修复早期的骨生成量,从而加速骨愈合进程。对于复合材料中TGF-β的最佳含量及TGF-β与BMP的最适比例还有待进一步研究。
参 考 文 献
1 孙玉鹏,陆裕朴,胡蕴玉,等.牛血小板TGF-β提取、纯化及其诱导小鼠股骨成骨作用.中华骨科杂志, 1995, 15∶610.
2 孙玉鹏,陆裕朴,胡蕴玉,等.TGF-β与骨缺损修复.中华创伤杂志, 1996, 12∶303.
3 Sun YP, Zhang WQ, Lu YP, et al. Role of transforming growth factor β(TGF-β) in repairing bone defects. Chin Med Sci J, 1996, 11∶209.
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4 Cook SD, Baffes GC, Wolfe MW, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein induces healing in a canine long-bone segmental defect model. Clin Orthop, 1994, 301∶302.
5 Nilsson OS, Urist MR, Dawson EG, et al. Bone repair induced by bone morphogenetic protein in ulnar defects in dogs. J Bone Joint Surg( Br), 1986, 68∶635.
6 Joyce ME, Jingushi S, Bolander ME. Transforming growth factor β in the regulation of fracture repair. Clin Orthop, 1990, 21∶199.姟迹冢耍姜
(收稿:1997-02-26 修回:1997-09-12), 百拇医药
单位：100037 北京,解放军第三O四医院骨科中心(孙玉鹏);第四军医大学附属口腔医学院颌面外科(张皖清);第四军医大学附属西京医院病理科(马福成、陈万禄)
关键词：转化生长因子β；骨形成蛋白；骨缺损；骨修复；骨生成
中华创伤杂志/980210.htm 【摘要】 目的 探讨转化生长因子β(TGF-β)与骨形成蛋白(BMP)复合后对节段性骨缺损的修复作用,以及在骨修复过程中TGF-β和BMP之间的相互作用。方法 采用以系列化学方法处理的小牛松质骨作为载体,将一定量的TGF-β和/或BMP与之复合,形成TGF-β/载体、BMP/载体和TGF-β/BMP/载体复合物(其中含TGF-β 120μg、BMP12mg),分别修复1.5cm兔桡骨节段性骨缺损。术后4、8、12、16周取材,进行放射学和组织学观察。结果 术后4周,植入TGF-β/载体的缺损区内可见不均匀絮状放射阴影,外骨膜呈增生反应,骨折线模糊不清,缺损区尚未完全桥接;植入BMP/载体组新生骨痂明显,密度均匀,缺损区两断端骨折线隐约可见;在植入TGF-β/BMP/载体的缺损区可见均匀的高密度阴影,桥接骨缺损的两端,骨折线模糊。术后第12～16周3组缺损区完全性修复,其密度近正常骨,可见皮质骨和骨髓腔结构。16周时TGF-β和TGF-β/BMP组骨缺损区周围外骨痂少,而BMP组中仍可见较多尚未完全吸收的外骨痂。结论 TGF-β/BMP复合后早期骨修复作用优于单一的TGF-β和BMP,在骨缺损修复过程中TGF-β和BMP有良好的协同作用。
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Effect of Composite of Transforming Growth Factor β and Bone Morphogenetic Protein on Repairing Bone Defects SUN Yu-peng, ZHANG Wan-qing, MA Fu-cheng, et al. Center of Orthopaedics, 304th Hospital of PLA, Beijing 100037
【Abstract】 Aim To evaluate the effect of transforming growth factor β (TGF-β) and bone morphogenetic protein (BMP) composite on the repairing of large segmental bone defects and to discuss the interaction between TGF-β and BMP during bone repair. Methods Segmental bone defects for 1.5cm were created in the mid-upper part of the radial shafts of 48 adult rabbits. The defects were filled with implants of TGF-β/carrier, BMP/carrier, and TGF-β/BMP/carrier (TGF-β 120Ug, BMP 12mg) separately. The defects were examined radiographically and histologically at 4, 8, 12 and 16 weeks post-operation. Results In the group with TGF-β/BMP composite, the defects area was bridged with callus of uniform radiodensity at 4 weeks, and cortices of the cut ends were obscured by new bones. At 16 weeks post-operation, the defects were bridged by uniform new bones and the cut ends of cortex could not be seen in all groups. In the group with BMP/carrier, the defects were filled with more irregular woven bone callus than those in the other two groups. Defects implanted with TGF-β/BMP in animals killed at 16 weeks showed histologically new lamellar and woven bone which was formed in continuity with the cut ends of the cortex. Medullar canal was recanalized and contained marrow elements with normal appearance. Conclusion These data demonstrate not only the synergistic action between TGF-β/BMP in the process of bone healing, but also a better effect of TGF-β/BMP composite than single TGF-β or BMP on bone repair, especially in the early stage of bone repair process.
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【Key words】 Transforming growth factor β Bone morphogenetic protein Bone defect Bone repair Osteogenesis
骨修复是一个极其复杂而有序的过程。近年的研究表明,生长因子在骨愈合过程中起重要作用。骨形成蛋白(BMP)是骨生成的启动因子,能诱导间充质细胞分化成软骨细胞和骨细胞,对骨愈合有明显促进作用。转化生长因子β(TGF-β)机体内含量最为丰富,在胚胎发育、创口愈合、基质形成、骨组织形成及改建过程中都起着重要作用。笔者以前的实验显示,TGF-β刺激间充质细胞的增殖和分化,形成成骨细胞和软骨细胞,从而诱导新骨的生成,并且具有修复大块节段性骨缺损的能力[1，2]。本实验旨在探讨TGF-β/BMP复合材料对骨缺损的修复作用及TGF-β和BMP在骨修复中的相互作用。
材料与方法
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1.复合材料的制备[3]:以新鲜牛血为原料,离心,分离出血小板。采用酸醇抽提方法,提取血小板蛋白,并先后经过2次Bio-Gel P60柱层析,分离纯化出TGF-β[1]。本实验采用的BMP由已建立的方法从小牛皮质骨中提取;选择经化学处理的牛松质骨作为载体。将一定量的TGF-β和/或BMP分别溶解后与载体在真空条件下进行充分混匀,形成3种复合物,即TGF-β/载体、BMP/载体和TGF-β/BMP/载体复合物。冻干,γ射线照射消毒。
2.动物实验:健康家兔48只,体重2.5～3.0kg,雌雄不分。随机分成3组,每组18只。在3%戊巴比妥钠静脉麻醉下,手术显露右桡骨中上段,连同骨膜一起切除,造成桡骨1.5cm节段性骨缺损。以等渗盐水清洗创口后,分别植入TGFC-β/载体、BMP/载体和TGF-β/BMP/载体复合材料60mg(其中分别含TGF-β 120μg、BMP 12mg)。逐层缝合伤口。术后不给抗生素,不加外固定。动物分笼饲养,常规饮食。
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3.观察指标:(1)X线检查:分别在术后4、8、12和16周处死动物进行取材。在48kV、25mA、0.12s、75cm的投照条件下由专人作X线拍片及冲洗,观察各组动物骨缺损区的骨痂生长和桥接情况,并根据其愈合程度按Cook等6级评分标准[4]进行量化评估。(2)组织学观察:标本以10%甲醛固定后,混合脱钙液脱钙处理,石蜡包埋切片,HE染色,观察比较各组骨缺损愈合进程,依照Nilsson等骨愈合组织学评分标准[5]进行评分。
4.统计学处理:对X线及组织学评分结果作秩和检验处理(SPLM软件包,第四军医大学统计学教研室)。
结 果
1.X线检查结果:术后4周,植入TGF-β/载体骨缺损区内可见不均匀的放射阴影,外骨膜呈增生反应,骨折线模糊不清,缺损区尚未完全桥接;植入BMP/载体组新生骨痂较明显,密度均匀,缺损区骨折线隐约可见;植入TGF-β/MBP/载体的缺损区可见均匀的高密度阴影桥接骨缺损的两端,骨折线模糊(图1～3)。第8周时,TGF-β组骨缺损区阴影密度明显增高,靠近尺侧部分更为显著,两端骨折线消失,缺损完全桥接;在桡侧尚有少量未完全吸收替代的松质骨载体。BMP组和TGF-β/BMP组骨缺损区阴影密度增高,可见大量钙化的外骨痂,断端骨折线消失。术后12～16周,3组骨缺损区完全骨性修复,骨构建进一步完善,其密度接近正常骨,可见皮质骨和骨髓腔结构;TGF-β组和TGF-β/BMP组骨缺损区周围外骨痂少,而BMP组中仍可见有较多尚未完全吸收的外骨痂。
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表1为骨缺损修复术后放射学评分结果。从秩和检验两两比较来看,术后4周,植入TGF-β/BMP/载体组与TGF-β/载体、BMP/载体两组之间相差非常显著,P值分别为0.003和0.026。术后8周以后,3组之间相差不显著。结果提示,TGF-β/BMP复合物早期诱导成骨作用明显优于单一的BMP和TGF-β;同时还可看出,TGF-β在骨愈合早期(4周)内的作用不及BMP。姫2.组织学观察结果:术后4周,植入TGF-β/载体组骨缺损区可见大片软骨细胞与索条状的新生骨组织连成一体;间充质细胞大量增殖,并可见其有向软骨细胞方向分化的趋势,同时有编织骨形成;BMP组中有大量增殖的间充质细胞,骨缺损区周围软组织中尤为明显,大量新生骨痂形成;植入TGF-β/BMP复合物4周,间充质细胞增殖,形成大片软骨细胞,与新生骨痂连成一片,其中可见有新生的毛细血管。8周时,3组骨
图1 术后4周,TGF-β/载体组骨缺损中见有絮状放射阴影 图2 术后4周,BMP/载体组骨缺损区为不均匀的新生骨痂连接 图3 术后4周,TGF-β/BMP/载体组骨缺损为高密度新生骨痂桥接
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表1 放射学评分结果(
±s) 组别术后时间(周)
4
8
12
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TGF-β/BMP/载体
4.75±0.50
5.00±0.00
6.00±0.00
6.00±0.00
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TGF-β/载体
2.25±0.50**
5.00±0.00
5.75±0.50
6.00±0.00
BMP/载体
3.50±0.58*
5.00±0.00
5.75±0.50
6.00±0.00
与TGF-β/BMP/载体组比较 *P<0.026 **P<0.0003表2 骨缺损组织学评分结果(
) 组别, http://www.100md.com
术后时间(周)
评分
组织连接
骨痂生成
骨髓
TGF-β/BMP/载体
4
3.0(3)
3.0(3)
1.5(1～2)
8
3.5(3～4)
4.0(4)
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2.3(2～3)
12
4.0(4)
4.0(4)
3.7(3～4)
16
4.0(4)
4.0(4)
3.7(3～4)
TGF-β/载体
4
2.0(2)**
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2.2(2～3)
1.3(1～2)
8
2.5(2～)
3.8(3～4)
1.5(1～2)
12
3.3(2～4)
4.0(4)
3.3(2～4)
16
4.0(4)
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3.7(3～4)
BMP/载体
4
2.2(2～3)*
2.5(2～3)
1.5(1～2)
8
3.0(3)
3.8(3～4)
2.3(2～3)
12
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3.5(3～4)
4.0(4)
3.5(3～4)
16
4.0(4)
4.0(4)
3.7(3～4)
注:括号中为得分范围 与TGF-β/BMP/载体组比较 *P=0.0162 **P=0.0029
缺损区新生骨痂大量增加,连成大片状,出现大量骨髓细胞。术后12～16周,新生骨痂日趋成熟,骨构建完善,皮质形成,骨髓腔再通。BMP组骨缺损区外仍有大量的编织骨痂。各组骨缺损修复组织学评分结果见表2。
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讨 论
1.TGF-β的骨修复作用:TGF-β在骨修复过程中十分活跃。研究表明,骨折24小时血肿内可见有细胞外TGF-β存在。骨折修复过程中,TGF-β最初由血小板释放于血肿内,继而在软骨痂中由增生、分化的细胞合成[6]。多数学者认为,TGF-β通过刺激成骨细胞的活性与增殖直接促进膜内成骨,并刺激成骨细胞合成Ⅰ型胶原和骨连接素(osteonectin)。体外免疫组织化学观察证实软骨痂中TGF-β的存在,表明TGF-β同时还调节软骨细胞的增殖与分化,以及崐软骨基质的合成。笔者以前的研究证实,TGF-β刺激骨膜间充质细胞增殖与分化而导致新骨生成,并且TGF-β与载体复合后完成了大块节段性骨缺损的修复[1，2]。同样,在本实验中,植入TGF-β复合牛松质骨载体4周时,骨缺损区内大量间充质细胞增殖,并向软骨细胞分化。从间充质细胞的分布区域看,主要集中在缺损区内,靠近尺侧尤甚,从而也证实TGF-β不能诱导异位成骨;换言之,TGF-β的成骨效应来自于其对骨膜间充质细胞的刺激作用。由于TGF-β不能诱导骨缺损区周围软组织中间充质细胞向成骨细胞和软骨细胞增殖与分化,其成骨范围仅局限于骨缺损区内,因此提高了成骨效率,也有利于新生骨质的进一步构建。植入TGF-β/载体、TGF-β/BMP/载体复合物16周,缺损区骨皮质形成、骨髓腔再通而外骨痂少。与之形成对照的是,BMP组16周时缺损区周围仍存在大量的编织骨痂。这提示,TGF-β在骨构建过程中起重要作用。当然,从另一方面也证实了BMP具有强大的异位诱导成骨作用。
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2.TGF-β和BMP在骨修复中的相互作用:本实验结果表明,缺损区植入TGF-β/BMP复合物其早期(4周)的骨诱导作用明显优于单纯TGF-β组,尤其是新生骨痂的形成明显多于单纯TGF-β组和BMP组。从组织学上可以看出,4周时植入TGF-β/BMP复合物的骨缺损区外软组织中间充质细胞大量增殖,并向缺损区内移行;而植入TGF-β/载体的缺损区,由于TGF-β无异位成骨活性,间充质细胞的增殖与分化仅局限在缺损区内。BMP的异位骨诱导作用弥补了TGF-β的不足;另一方面,TGF-β可促进已分化的成骨细胞和软骨细胞的增殖及其细胞外基质的合成,这是BMP所不及的。二者互为补充,从而使骨生成作用得以加强。
BMP是一类酸性多肽,是TGF-β超家族成员,能诱导间充质细胞向骨和软骨发生不可逆转的分化。大量的研究表明,BMP是一种高效的骨诱导物质,对骨折愈合及骨缺损修复有促进作用。然而,从骨组织中提取的BMP不是单一分子的蛋白,而是多种蛋白的混合物。实验表明,将BMP粗提物进一步纯化为单一分子后,其骨诱导活性降低,甚至无骨诱导作用。因此有人认为,BMP的骨诱导作用是其与其他生长因子共同作用的结果。BMP对于已分化的骨细胞没有刺激作用。本实验结果证实了上述理论假设,即在骨缺损修复过程中TGF-β与BMP之间有良好的协同作用,尤其在骨修复早期;TGF-β/BMP复合物的骨修复作用明显优于单一的TGF-β和BMP。
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目前,TGF-β的应用研究方兴未艾,BMP在国内外均已进入临床期研究。TGF-β/BMP复合应用必将大大降低单一BMP或TGF-β的用量,并可显著增加骨修复早期的骨生成量,从而加速骨愈合进程。对于复合材料中TGF-β的最佳含量及TGF-β与BMP的最适比例还有待进一步研究。
参 考 文 献
1 孙玉鹏,陆裕朴,胡蕴玉,等.牛血小板TGF-β提取、纯化及其诱导小鼠股骨成骨作用.中华骨科杂志, 1995, 15∶610.
2 孙玉鹏,陆裕朴,胡蕴玉,等.TGF-β与骨缺损修复.中华创伤杂志, 1996, 12∶303.
3 Sun YP, Zhang WQ, Lu YP, et al. Role of transforming growth factor β(TGF-β) in repairing bone defects. Chin Med Sci J, 1996, 11∶209.
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4 Cook SD, Baffes GC, Wolfe MW, et al. Recombinant human bone morphogenetic protein induces healing in a canine long-bone segmental defect model. Clin Orthop, 1994, 301∶302.
5 Nilsson OS, Urist MR, Dawson EG, et al. Bone repair induced by bone morphogenetic protein in ulnar defects in dogs. J Bone Joint Surg( Br), 1986, 68∶635.
6 Joyce ME, Jingushi S, Bolander ME. Transforming growth factor β in the regulation of fracture repair. Clin Orthop, 1990, 21∶199.姟迹冢耍姜
(收稿:1997-02-26 修回:1997-09-12), 百拇医药