支气管哮喘病人单核和(或)巨噬细胞的功能状态
作者：黄瑾 吕冬梅 林树青
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床医学院
关键词：
中华内科杂志/980224 伴随着对支气管哮喘发病机制研究的不断深入，已经认识到该病是以病变局部众多免疫炎症细胞渗出为主要病理改变的变态反应性炎性疾病。但是导致哮喘发生的确切机制尚未明了。本研究探讨哮喘病人单核和(或)巨噬细胞白细胞介素(IL)-15分泌水平及其抗体依赖的单核和(或)巨噬细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒反应(ADCC)，同时还观察了非特异性吞噬功能，旨在从不同角度了解单核和(或)巨噬细胞在哮喘发病中的作用。
一、材料与方法
1.研究对象：哮喘组：根据1992年全国哮喘会议修订的哮喘诊断标准[1]而确诊的哮喘病人41例，男22例，女19例，平均年龄37.8±12.4岁，均为哮喘急性发作期，未曾用激素治疗者。对照组40例，男31例，女9例，平均年龄27.8±7.9岁，为健康自愿者。
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2.单核和(或)巨噬细胞的制备：肝素抗凝静脉血，用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，在24孔培养板中孵育2小时，吸去非贴壁细胞，并用Hank液轻轻吹打洗涤，孔内贴壁细胞即为单核和(或)巨噬细胞。
3.IL-15的分泌及测定[2]：单核和(或)巨噬细胞在全培基中孵育，并在刺激孔内加入大肠杆菌内毒素(LPS)8 μg/ml，在37℃，5% CO2条件下培养5天，收集上清，-30℃冻存。用改良的噻唑蓝(MTT)实验测定依赖性很强的细胞株CTLL2细胞增殖程度而确定IL-15的水平。
4.ADCC：单核和(或)巨噬细胞为效应细胞，本实验室传代培养的CTLL2细胞为靶细胞，自制的兔抗CTLL2细胞抗血清为特异性抗体；分别设置CTLL2细胞增殖标准对照组、抗血清非特异杀伤对照组，单核和(或)巨噬细胞非特异吞噬对照组及单核和(或)巨噬细胞ADCC实验组；抗血清效价为1∶5 000，效∶靶为2∶1，分组加样后，CTLL2细胞培养48小时，用改良的MTT比色法测定吸光度(A)(570 nm)值。刺激组用LPS 8 μg/ml与单核和(或)巨噬细胞共育24小时后，再分组加样培养。
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5.统计学方法：显著性检验用t检验及t'检验。
二、结果
1.哮喘组病人外周血单核和(或)巨噬细胞体外培养后上清液中IL-15为11.07±5.15 U/L，对照组为6.95±4.27 U/L，P<0.002。LPS刺激后哮喘组患者IL-15为20.60±2.70 U/L，对照组为8.60±4.22 U/L，P<0.05。
2.急性发作期哮喘病人自然状态外周血单核和(或)巨噬细胞ADCC时，杀伤细胞数哮喘组为(1.0650±0.3162)×104，对照组为(1.0046±0.3916)×104；非特异吞噬杀伤细胞数哮喘组为(0.0203±0.0749)×104，对照组为(0.0510±0.0982)×104，P>0.05。LPS刺激后，哮喘组为(0.8023±0.3577)×104，对照组为(0.5586±0.1561)×104；非特异吞噬杀伤细胞数哮喘组为(0.1748±0.0905)×104，对照组为(0.3522±0.0802)×104，P<0.05。
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讨论 IL-15是新近发现的由单核和(或)巨噬细胞分泌的一种重要淋巴因子，它参与单核和(或)巨噬细胞与其他免疫细胞之间的调控，并可维持CTLL2细胞增殖。Grabstein等[2]研究证实，重组猴IL-15可刺激PHA活化的外周血T细胞的增殖(包括CD+4和CD+8细胞亚群)。Armitage等[3]发现，IL-15同IL-2、IL-4及IL-10一样，可与CD40L协同诱导由抗IgM或佛波酯活化的B细胞发生增殖和分泌IgM、IgG1、IgA，以及低水平的IgG2。本实验发现，无论体外刺激与否，哮喘组单核和(或)巨噬细胞分泌IL-15水平均明显高于对照组。因此，我们认为，哮喘病人T、B淋巴细胞活化并产生特异性抗体，形成变态反应，与单核和(或)巨噬细胞分泌IL-15增高有关。
本实验在体外检测单核和(或)巨噬细胞的ADCC及其非特异性吞噬功能，结果提示，哮喘病人单核和(或)巨噬细胞活化后可表现出与健康人不同的功能效应。本实验是用LPS体外活化，而在体内自然环境中可以通过各种过敏原活化或神经内分泌调节活化的多种途径。活化后的单核和(或)巨噬细胞非特异吞噬作用减弱，提示病人病变局部的损伤，至少没有单核和(或)巨噬细胞活化后非特异吞噬细胞的参与。同时，活化后单核和(或)巨噬细胞ADCC增强，说明特异性的单核和(或)巨噬细胞杀伤功能增强是哮喘病人单核和(或)巨噬细胞功能状态的一个特征，可能参与了该病变态反应炎性病灶的形成。
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参考文献
1 支气管哮喘的定义、诊断、严重度分级及疗效判断标准(修正方案).中华结核和呼吸杂志，1993，16(哮喘增刊)：5.
2 Grabstein KH, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994,264：965-968.
3 Armitage RJ, Macduff BM, Eisenman J, et al. IL-15 has stimulatory activity for the induction of B cell proliferation and differentiation. J Immunol, 1995,154：483-490.
(收稿：1997-02-03 修回：1997-05-30), http://www.100md.com
单位：130041 长春，白求恩医科大学第二临床医学院
关键词：
中华内科杂志/980224 伴随着对支气管哮喘发病机制研究的不断深入，已经认识到该病是以病变局部众多免疫炎症细胞渗出为主要病理改变的变态反应性炎性疾病。但是导致哮喘发生的确切机制尚未明了。本研究探讨哮喘病人单核和(或)巨噬细胞白细胞介素(IL)-15分泌水平及其抗体依赖的单核和(或)巨噬细胞抗体依赖性细胞介导的细胞毒反应(ADCC)，同时还观察了非特异性吞噬功能，旨在从不同角度了解单核和(或)巨噬细胞在哮喘发病中的作用。
一、材料与方法
1.研究对象：哮喘组：根据1992年全国哮喘会议修订的哮喘诊断标准[1]而确诊的哮喘病人41例，男22例，女19例，平均年龄37.8±12.4岁，均为哮喘急性发作期，未曾用激素治疗者。对照组40例，男31例，女9例，平均年龄27.8±7.9岁，为健康自愿者。
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2.单核和(或)巨噬细胞的制备：肝素抗凝静脉血，用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，在24孔培养板中孵育2小时，吸去非贴壁细胞，并用Hank液轻轻吹打洗涤，孔内贴壁细胞即为单核和(或)巨噬细胞。
3.IL-15的分泌及测定[2]：单核和(或)巨噬细胞在全培基中孵育，并在刺激孔内加入大肠杆菌内毒素(LPS)8 μg/ml，在37℃，5% CO2条件下培养5天，收集上清，-30℃冻存。用改良的噻唑蓝(MTT)实验测定依赖性很强的细胞株CTLL2细胞增殖程度而确定IL-15的水平。
4.ADCC：单核和(或)巨噬细胞为效应细胞，本实验室传代培养的CTLL2细胞为靶细胞，自制的兔抗CTLL2细胞抗血清为特异性抗体；分别设置CTLL2细胞增殖标准对照组、抗血清非特异杀伤对照组，单核和(或)巨噬细胞非特异吞噬对照组及单核和(或)巨噬细胞ADCC实验组；抗血清效价为1∶5 000，效∶靶为2∶1，分组加样后，CTLL2细胞培养48小时，用改良的MTT比色法测定吸光度(A)(570 nm)值。刺激组用LPS 8 μg/ml与单核和(或)巨噬细胞共育24小时后，再分组加样培养。
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5.统计学方法：显著性检验用t检验及t'检验。
二、结果
1.哮喘组病人外周血单核和(或)巨噬细胞体外培养后上清液中IL-15为11.07±5.15 U/L，对照组为6.95±4.27 U/L，P<0.002。LPS刺激后哮喘组患者IL-15为20.60±2.70 U/L，对照组为8.60±4.22 U/L，P<0.05。
2.急性发作期哮喘病人自然状态外周血单核和(或)巨噬细胞ADCC时，杀伤细胞数哮喘组为(1.0650±0.3162)×104，对照组为(1.0046±0.3916)×104；非特异吞噬杀伤细胞数哮喘组为(0.0203±0.0749)×104，对照组为(0.0510±0.0982)×104，P>0.05。LPS刺激后，哮喘组为(0.8023±0.3577)×104，对照组为(0.5586±0.1561)×104；非特异吞噬杀伤细胞数哮喘组为(0.1748±0.0905)×104，对照组为(0.3522±0.0802)×104，P<0.05。
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讨论 IL-15是新近发现的由单核和(或)巨噬细胞分泌的一种重要淋巴因子，它参与单核和(或)巨噬细胞与其他免疫细胞之间的调控，并可维持CTLL2细胞增殖。Grabstein等[2]研究证实，重组猴IL-15可刺激PHA活化的外周血T细胞的增殖(包括CD+4和CD+8细胞亚群)。Armitage等[3]发现，IL-15同IL-2、IL-4及IL-10一样，可与CD40L协同诱导由抗IgM或佛波酯活化的B细胞发生增殖和分泌IgM、IgG1、IgA，以及低水平的IgG2。本实验发现，无论体外刺激与否，哮喘组单核和(或)巨噬细胞分泌IL-15水平均明显高于对照组。因此，我们认为，哮喘病人T、B淋巴细胞活化并产生特异性抗体，形成变态反应，与单核和(或)巨噬细胞分泌IL-15增高有关。
本实验在体外检测单核和(或)巨噬细胞的ADCC及其非特异性吞噬功能，结果提示，哮喘病人单核和(或)巨噬细胞活化后可表现出与健康人不同的功能效应。本实验是用LPS体外活化，而在体内自然环境中可以通过各种过敏原活化或神经内分泌调节活化的多种途径。活化后的单核和(或)巨噬细胞非特异吞噬作用减弱，提示病人病变局部的损伤，至少没有单核和(或)巨噬细胞活化后非特异吞噬细胞的参与。同时，活化后单核和(或)巨噬细胞ADCC增强，说明特异性的单核和(或)巨噬细胞杀伤功能增强是哮喘病人单核和(或)巨噬细胞功能状态的一个特征，可能参与了该病变态反应炎性病灶的形成。
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参考文献
1 支气管哮喘的定义、诊断、严重度分级及疗效判断标准(修正方案).中华结核和呼吸杂志，1993，16(哮喘增刊)：5.
2 Grabstein KH, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994,264：965-968.
3 Armitage RJ, Macduff BM, Eisenman J, et al. IL-15 has stimulatory activity for the induction of B cell proliferation and differentiation. J Immunol, 1995,154：483-490.
(收稿：1997-02-03 修回：1997-05-30), http://www.100md.com