肝炎患者庚型肝炎病毒的检测和序列分析
作者：周小辉 刘卫东 王伟 邱杰文 吴胤荣 波田寿一 东野一弥
单位：515031 广东省汕头大学医学院第二附属医院内三科(周小辉、刘卫东、邱杰文、吴胤荣)，第一附属医院内二科(王伟)；日本兵库医科大学内三科(波田寿一、东野一弥)
关键词：
中华内科杂志/980220
为研究庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)在我国的感染情况，本研究采用半巢式聚合酶链反应(semi-nest PCR)对一组急性和慢性肝炎患者进行HGV/GBV-C RNA的检测，并对其PCR产物直接测定序列。
一、材料与方法
全部病例选自汕头大学医学院第二附属医院1994年6月～1996年8月的住院患者，共103例，其中男性66例，女性37例，年龄31.2±8.7岁。根据1996年病毒性肝炎学术会议修订的标准，将全部病例分为四组：急性散发性非甲～戊型肝炎28例，急性乙型肝炎21例，慢性非乙、丙型肝炎18例，慢性丙型肝炎36例。
, 百拇医药
采用半巢式PCR方法进行HGV/GBV-C RNA的检测。首先从30 μl血清中提取总的核苷酸，采用引物HG-2(5′GAGCCACGTTGAAGACACTTTCCT-C3′)逆转录后进行两轮PCR扩增。第一轮引物HG-2和77F(5′CTCTTTGTGGTAGTAGCCGAGAGAT3′)共30个循环：94℃75秒，55℃75秒，72℃60秒，最后72℃3分钟。第二轮扩增引物77F和211R(5′CGAATGAGTCAGAGGACGGGG-TAT3′)共30个循环：94℃60秒，55℃60秒，72℃90秒。引物为HGV/GBV-C NS5A区核苷酸序列(基因文库编号U44402)。经上述方法获得156 bp的产物。最后，采用双脱氧链末端终止法直接序列测定。
附表 急慢性肝炎患者中庚型肝炎病毒阳性分布状况
例数
单独HGV
, 百拇医药
(+)例数
HGV、HBV
均(+)例数
HGV、HCV
均(+)例数
HGV、HBV、HCV均(+)
例数
HGV(+)
例数
急性非甲～戊型肝炎
28
4
, http://www.100md.com 0
0
0
4
急性乙型肝炎
21
0
4
0
0
4
慢性非乙、丙型肝炎
18
3
, 百拇医药
0
0
0
3
慢性丙型肝炎
36
0
0
9
3
12
注：HGV：庚型肝炎病毒；HBV：乙型肝炎病毒；HCV：丙型肝炎病毒
二、结果
, 百拇医药
从103例患者的血清中检出23例HGV/GBV-C RNA阳性，总阳性率22.3%。其中男性16例，女性7例。男女两组检出率差异无显著性(P>0.05)。各组检出例数见附表。HGV/GBV-C检出率依次为丙型肝炎组>乙型肝炎组>非乙、丙型肝炎组>非甲～戊肝炎组。HGV/GBV-C与丙型肝炎病毒(HCV)共同阳性者12例，占52.2%(12/23)。HGV/GBV-C与乙型肝炎病毒(HBV)共同阳性者7例，占30.4%(7/23)。在慢性丙型肝炎组和乙型肝炎组HGV/GBV-C的检出率分别是33.3%和19.04%，均高于非甲～戊型肝炎组和非乙、丙型肝炎组。丙型肝炎组中5例及乙型肝炎组中1例有输血和血制品史，分别有3例及1例HGV/GBV-C为阳性。其余均无输血及血制品史。
5例HGV/GBV-C RNA阳性标本其扩增产物直接序列测定。除引物序列77F和211R外，107 bp核苷酸序列显示见附图。
讨论 在急慢性肝炎和暴发性肝炎中，约有10%～20%的病人用现在的甲、乙、丙、丁和戊型肝炎实验室诊断方法尚不能确定病因[1]。而目前研究认为：HGV/GBV-C与人类肝炎关系密切，可能是非甲～戊各型肝炎的病因之一[1～3]。我们从103例急性和慢性肝炎患者的血清中检出了23例HGV/GBV-C RNA，证实了我国存在着HGV/GBV-C的感染。
, http://www.100md.com
我们从急性非甲～戊型肝炎患者中检出HGV/GBV-C RNA，提示其感染有导致急性肝炎的可能。HGV/GBV-C与HCV均属于黄病毒科，而HCV感染者多发展为慢性肝炎。HGV/GBV-C感染是否也同样进展到慢性化?结果从慢性非乙、丙型肝炎也检出HGV/GBV-C。提示HGV/GBV-C可能为慢性肝炎的另一病原。
本结果显示，HGV/GBV-C可以和HCV或HBV重叠或同时感染，而其高混合感染状况说明它们之间有着共同的传播途径。本组病例6例有受血及血制品史，其中4例检出HGV/GBV-C，提示血液暴露是传播庚性肝炎的重要途径。而多数HGV/GBV-C阳性者却无受血及血制品史，说明非肠道途径也是不可忽略的传播途径。
5例患者的PCR产物直接进行序列测定，结果证实是来自HGV/GBV-C核苷酸序列。序列分析发现，在NS5A区患者相互之间的偏差是0～5%，而Masuko等[4]报道在日本GBV-C NS3区的偏差是0～21%。我们也发现NS5A区患者的核苷酸序列与HGV比较偏差是3%～9%，与GBV-C比较是2%～7%。而Masuko等[4]报道在NS3区病人与HGV/GBV-C之间的偏差是11%～23%。因此，HGV/GBV-C的NS5A区比NS3区具有更高的保守性。
, http://www.100md.com
此外，据报道HCV NS5A区的变异与对干扰素的敏感性有关。特别是在氨基酸残基2209到2248[5]。那么HGV/GBV-C NS5A区是否也与干扰素的敏感性相关有待于研究。我们的研究为肝炎病例的回顾性调查，因病例数较少，其结果有待于进一步证实。
前3行为HGV-1、HGV-2和GBV-C的序列。基因文库编号：HGV-1为U44402；HGV-2为U45966；GBV-C为U36380。在HGV-2同样的序列位于6857～6963；GBV-C则位于6910～7016
附图 5例肝炎患者HGV/GBV-C cDNA的核苷酸序列(107 bp)
参考文献
1 Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nature Med, 1995,1：564-569.
, http://www.100md.com
2 Leary TP, Muerhoff AS, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of Flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis. J Med Virol, 1996,48：60-67.
3 Linnen J, Wages J Jr, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996,271：505-508.
4 Masuko K, Mitsui T, Iwano K, et al. Infection with hepatitis GB virus C in patients on maintenance hemodialysis. N Engl J Med, 1996,334：1485-1490.
5 Enomoto N, Sakuma I, Asahina Y, et al. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic C virus 1b infection. N Engl J Med, 1996,334：77-81.
(收稿：1996-12-04 修回：1997-07-17), http://www.100md.com
单位：515031 广东省汕头大学医学院第二附属医院内三科(周小辉、刘卫东、邱杰文、吴胤荣)，第一附属医院内二科(王伟)；日本兵库医科大学内三科(波田寿一、东野一弥)
关键词：
中华内科杂志/980220
为研究庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)在我国的感染情况，本研究采用半巢式聚合酶链反应(semi-nest PCR)对一组急性和慢性肝炎患者进行HGV/GBV-C RNA的检测，并对其PCR产物直接测定序列。
一、材料与方法
全部病例选自汕头大学医学院第二附属医院1994年6月～1996年8月的住院患者，共103例，其中男性66例，女性37例，年龄31.2±8.7岁。根据1996年病毒性肝炎学术会议修订的标准，将全部病例分为四组：急性散发性非甲～戊型肝炎28例，急性乙型肝炎21例，慢性非乙、丙型肝炎18例，慢性丙型肝炎36例。
, 百拇医药
采用半巢式PCR方法进行HGV/GBV-C RNA的检测。首先从30 μl血清中提取总的核苷酸，采用引物HG-2(5′GAGCCACGTTGAAGACACTTTCCT-C3′)逆转录后进行两轮PCR扩增。第一轮引物HG-2和77F(5′CTCTTTGTGGTAGTAGCCGAGAGAT3′)共30个循环：94℃75秒，55℃75秒，72℃60秒，最后72℃3分钟。第二轮扩增引物77F和211R(5′CGAATGAGTCAGAGGACGGGG-TAT3′)共30个循环：94℃60秒，55℃60秒，72℃90秒。引物为HGV/GBV-C NS5A区核苷酸序列(基因文库编号U44402)。经上述方法获得156 bp的产物。最后，采用双脱氧链末端终止法直接序列测定。
附表 急慢性肝炎患者中庚型肝炎病毒阳性分布状况
例数
单独HGV
, 百拇医药
(+)例数
HGV、HBV
均(+)例数
HGV、HCV
均(+)例数
HGV、HBV、HCV均(+)
例数
HGV(+)
例数
急性非甲～戊型肝炎
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急性乙型肝炎
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慢性非乙、丙型肝炎
18
3
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3
慢性丙型肝炎
36
0
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9
3
12
注：HGV：庚型肝炎病毒；HBV：乙型肝炎病毒；HCV：丙型肝炎病毒
二、结果
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从103例患者的血清中检出23例HGV/GBV-C RNA阳性，总阳性率22.3%。其中男性16例，女性7例。男女两组检出率差异无显著性(P>0.05)。各组检出例数见附表。HGV/GBV-C检出率依次为丙型肝炎组>乙型肝炎组>非乙、丙型肝炎组>非甲～戊肝炎组。HGV/GBV-C与丙型肝炎病毒(HCV)共同阳性者12例，占52.2%(12/23)。HGV/GBV-C与乙型肝炎病毒(HBV)共同阳性者7例，占30.4%(7/23)。在慢性丙型肝炎组和乙型肝炎组HGV/GBV-C的检出率分别是33.3%和19.04%，均高于非甲～戊型肝炎组和非乙、丙型肝炎组。丙型肝炎组中5例及乙型肝炎组中1例有输血和血制品史，分别有3例及1例HGV/GBV-C为阳性。其余均无输血及血制品史。
5例HGV/GBV-C RNA阳性标本其扩增产物直接序列测定。除引物序列77F和211R外，107 bp核苷酸序列显示见附图。
讨论 在急慢性肝炎和暴发性肝炎中，约有10%～20%的病人用现在的甲、乙、丙、丁和戊型肝炎实验室诊断方法尚不能确定病因[1]。而目前研究认为：HGV/GBV-C与人类肝炎关系密切，可能是非甲～戊各型肝炎的病因之一[1～3]。我们从103例急性和慢性肝炎患者的血清中检出了23例HGV/GBV-C RNA，证实了我国存在着HGV/GBV-C的感染。
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我们从急性非甲～戊型肝炎患者中检出HGV/GBV-C RNA，提示其感染有导致急性肝炎的可能。HGV/GBV-C与HCV均属于黄病毒科，而HCV感染者多发展为慢性肝炎。HGV/GBV-C感染是否也同样进展到慢性化?结果从慢性非乙、丙型肝炎也检出HGV/GBV-C。提示HGV/GBV-C可能为慢性肝炎的另一病原。
本结果显示，HGV/GBV-C可以和HCV或HBV重叠或同时感染，而其高混合感染状况说明它们之间有着共同的传播途径。本组病例6例有受血及血制品史，其中4例检出HGV/GBV-C，提示血液暴露是传播庚性肝炎的重要途径。而多数HGV/GBV-C阳性者却无受血及血制品史，说明非肠道途径也是不可忽略的传播途径。
5例患者的PCR产物直接进行序列测定，结果证实是来自HGV/GBV-C核苷酸序列。序列分析发现，在NS5A区患者相互之间的偏差是0～5%，而Masuko等[4]报道在日本GBV-C NS3区的偏差是0～21%。我们也发现NS5A区患者的核苷酸序列与HGV比较偏差是3%～9%，与GBV-C比较是2%～7%。而Masuko等[4]报道在NS3区病人与HGV/GBV-C之间的偏差是11%～23%。因此，HGV/GBV-C的NS5A区比NS3区具有更高的保守性。
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此外，据报道HCV NS5A区的变异与对干扰素的敏感性有关。特别是在氨基酸残基2209到2248[5]。那么HGV/GBV-C NS5A区是否也与干扰素的敏感性相关有待于研究。我们的研究为肝炎病例的回顾性调查，因病例数较少，其结果有待于进一步证实。
前3行为HGV-1、HGV-2和GBV-C的序列。基因文库编号：HGV-1为U44402；HGV-2为U45966；GBV-C为U36380。在HGV-2同样的序列位于6857～6963；GBV-C则位于6910～7016
附图 5例肝炎患者HGV/GBV-C cDNA的核苷酸序列(107 bp)
参考文献
1 Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nature Med, 1995,1：564-569.
, http://www.100md.com
2 Leary TP, Muerhoff AS, Simons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of Flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis. J Med Virol, 1996,48：60-67.
3 Linnen J, Wages J Jr, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion-transmissible agent. Science, 1996,271：505-508.
4 Masuko K, Mitsui T, Iwano K, et al. Infection with hepatitis GB virus C in patients on maintenance hemodialysis. N Engl J Med, 1996,334：1485-1490.
5 Enomoto N, Sakuma I, Asahina Y, et al. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic C virus 1b infection. N Engl J Med, 1996,334：77-81.
(收稿：1996-12-04 修回：1997-07-17), http://www.100md.com