异搏定治疗家兔膜性肾小球肾炎的实验研究
作者：刘振珍 许文忠 魏民 黄启福 贾旭
单位：100007 北京市第六医院内科(刘振珍)；北京中医药大学基础医学院(许文忠、魏民、黄启福、贾旭)
关键词：
中华内科杂志990218 异搏定作为一个保护性药物在各种肾功能衰竭中均被认为是有效的[1-3]。本研究旨在探讨异搏定是否对膜性肾小球肾炎也有一定的保护和治疗作用。
一、材料和方法
1.动物模型的复制：用化学方法改变天然牛血清白蛋白(中国科学院生化研究所生产，电泳纯)的等电点(PI)，使其PI在9.0以上，制成阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)。然后按Border方法在家兔复制膜性肾小球肾炎。
2.实验分组：健康雄性日本大耳白家兔26只(中国科学院遗传研究所动物中心提供)，体重2.0～2.5 kg，随机分为三组：(1)病理组12只，以C-BSA 1 mg和大肠杆菌内毒素1 mg，预先免疫1周后，每日耳静脉注入C-BSA 25 mg，实验4周后，C-BSA剂量加倍至实验结束；(2)异搏定治疗组：9只，进行预免和注射C-BSA抗原，剂量同病理组。同时，自正式注射C-BSA始，每日每只家兔灌服异搏定40mg/kg体重。(异搏定为天津市中央制药厂生产)。(3)正常对照组5只，不进行预先免疫，从耳静脉注射生理盐水每日5 ml。
, http://www.100md.com
3.观察项目：(1)肾功能测定：24小时尿蛋白定量及血肌酐测定(Hitachi 7170全自动生化仪)。(2)肾组织光镜和电镜观察(Hitachi H-000透射电镜)。(3)电镜图像立体定量分析：将电镜样本按立体学测量原理用图像分析仪(Cambridge Instruments QVANTIMET 970)进行定量分析。(4)肾小球钙离子含量的测定：使用Varian Specter 40P双光束原子吸收分光光度机，各组家兔8周末杀，检测肾小球钙离子含量。
二、结果
1.肾功能变化：病理组家兔尿蛋白定量于注射C-BSA后第4周达较高水平，第5周达最高峰，而自第6周起则有明显的逐渐下降趋势。异搏定组尿蛋白也呈此变化趋势，但明显轻于病理组，见表1。血肌酐含量的变化见表2。
表1 两组家兔注射C-BSA后尿蛋白定量的动态变化 注射
, 百拇医药
C-BSA
病理组
异搏定组
两组比较
u
只数
±s(mg)
只数±s(mg)
3周
12
100.7±46.6
, http://www.100md.com 8
92.6±3.5
0.600
4周
10
223.3±61.1
8
150.4±6.6
3.746**
5周
9
397.4±20.3
7
, 百拇医药
298.9±6.4
13.707*
6周
8
245.8±44.2
7
196.1±7.1
3.134*
7周
7
129.1±14.6
7
, http://www.100md.com
111.6±2.2
3.136*
8周
5
80.8±14.8
6
74.3±2.8
0.968
注：t′检验，*P<0.05，**P<0.01；C-BSA：牛血清白蛋白
表2 病理组和异搏定组家兔血清肌酐值的动态变化 组别
血清肌酐值μmol/L
, http://www.100md.com
4周
6周
8周
正常组
81.86±20.60(5)
83.80±17.77(5)
80.44±10.61(5)
病理组
107.23±20.16(5)
235.32±42.61(5)
426.97±50.34(5)
异搏定组
, 百拇医药
105.20±30.94(5)
149.40±43.32(5)
175.92±95.47(5)
注：表内括号中为动物数；异搏定与病理组比较，*P<0.05
2.光镜观察：病理组在4周时，肾小球毛细血管壁呈均匀一致性增厚，肾小球基底膜(GBM)外侧出现典型的“钉状突起”，8周末的GBM显著增厚，肾小球硬化，球囊腔内渗出。异搏定组病变较轻，未见明显渗出。
3.透射电镜观察：病理组在4周时，肾小球上皮下有大量电子致密物沉积，GBM增厚，内皮细胞肿胀，上皮细胞有数量不等的微绒毛出现，足突变平或消失，上皮细胞胞浆广泛变薄延伸覆盖大段的GBM。异搏定组家兔注射C-BSA 后28天时肾小球上皮下可见散在的少量电子致密物沉积，足突融合较轻，8周后肾小球上皮下有多量电子致密物沉积，但基底膜增厚不明显。
, 百拇医药
4.上皮下沉积物电镜图像的定量分析：见表3。
表3 两组注射C-BSA后上皮下电子致密沉积物立体定量动态变化 组 别
注射C-BSA(±s)
组 别
注射C-BSA(±s)
4周
6周
8周
4周
, 百拇医药
6周
8周
平均直径D(μm)
平均截面积A(μm2)
病理组
0.593±
0.063
0.826±
0.103
1.146±0.099
病理组
0.293±0.060
, 百拇医药
0.561±
0.145
1.092±0.204
异搏定组
0.490±
0.019
0.541±
0.013*
0.560±0.031*
异搏定组
0.238±0.125
0.396±
, 百拇医药
0.270*
0.725±0.341*
平均周长B(μm)
体密度VV(%)
病理组
2.38±
0.23
3.28±
, 百拇医药
0.35
4.50±0.30
病理组
0.036±0.013
0.052±
0.017
0.089±0.025
异搏定组
2.13±
0.12
2.89±
0.37*
, http://www.100md.com
2.91±0.83
异搏定组
0.033±0.031
0.048±
0.017
0.059±0.021*
平均表面积S(μm2)
数密度NV(μm3)
病理组
, 百拇医药
1.15±
0.24
2.24±
0.58
4.29±0.80
病理组
0.295±0.086
0.162±
0.050
0.103±0.023
异搏定组
0.93±
, 百拇医药 0.21
1.37±
0.83*
1.83±0.23*
异搏定组
0.4±0.21*
0.206±
0.015*
0.281±0.027*
平均体积V(μm3)
, 百拇医药
面数密度SV(μm3)
病理组
0.125±
0.043
0.335±
0.137
0.845±0.180
病理组
, http://www.100md.com 0.173±0.040
0.130±
0.034
0.117±0.021
异搏定组
0.107±
0.083
0.143±
0.097*
0.257±0.113*
异搏定组
0.198±0.070
, 百拇医药
0.190±
0.030*
0.142±0.076*
比表面SS(μm2/μm3)
病理组
10.48±
, 百拇医药
1.03
7.65±
0.90
5.46±0.44
异搏定组
11.76±
0.77
10.03±
0.36*
8.37±0.25*
, 百拇医药
注：两组t检验*P<0.05；C-BSA：牛血清白蛋白
5.GBM厚度变化：见表4。
表4 病理组和异搏定组家兔肾小球基底膜厚度的动态变化(±s) 组别
4周
6周
8周
正常组
0.152±0.011
, http://www.100md.com
0.154±0.015
0.153±0.017
(5)
(5)
(5)
病理组
1.332±0.047
0.522±0.040
0.785±0.010
(8)
(8)
(8)
, http://www.100md.com
异搏定组
0.271±0.036
0.034±0.010*
0.407±0.014*
(8)
(7)
(6)
注：括号内为动物数 异搏定组与病理组比较，*P<0.05
6.肾小球钙离子含量的变化：注射C-BSA后第8周，病理组肾小球钙离子含量(772.21±41.30)%为正常组(100±17.34)% 7倍以上，P<0.05；异搏定治疗组(298.06±14.96)%钙超载情况低于病理组，P<0.05。
, 百拇医药
讨论 用阳离子化牛血清白蛋白作为抗原，在Border方法的基础上加以改进，延长注射时间至8周，制作出原位免疫复合物型膜性肾小球肾炎及慢性肾功能衰竭的动物模型，其病变典型且稳定，免疫发病机制和病理变化与临床膜性肾小球肾炎很相似，其实验后期所出现的慢性肾功能衰竭的症状、体征、形态学变化均与临床十分吻合。1985年Goligorsky等[4]通过异搏定治疗慢性肾功能衰竭的实验研究，发现经异搏定治疗的动物肾皮质钙离子含量明显低于未治疗者，并观察到未经异搏定治疗的动物肾皮质有明显的线粒体肿胀破裂，认为异搏定对慢性肾功能衰竭有一定的治疗作用。在此基础上Harris等[5]进行了异搏定慢性给药治疗大鼠15周慢性肾功能衰竭模型的实验研究，研究结果证明慢性异搏定用药具有保护性对抗肾皮质钙质沉着和纠正异常的肾小管细胞钙离子超负荷运动的功效。
我们检测了家兔膜性肾小球肾炎实验终末期(肾功能衰竭期)肾皮质肾小球的Ca2+含量以及异搏定慢性给药对此的防治作用的机制。结果表明，在注射C-BSA后第8周，病理组家兔肾小球钙离子含量显著高于正常对照组，异搏定组肾小球钙离子含量则低于病理组。通过对肾小球钙含量和血清肌酐值、上皮下电子致密沉积物立体定量分析值、肾小球基底膜厚度的定量分析值的相关回归处理，发现这些参数之间存在明显的相关性。提示膜性肾小球肾炎的发展和向慢性肾功能衰竭的过渡过程中，肾小球钙离子超负荷起着相当重要的作用。异搏定能够抑制肾小球钙超载，从而对慢性肾功能衰竭的到来起到了一定的阻止作用。
, http://www.100md.com
本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助
参考文献
1 Burke TJ，Arnold PE，Gordon JA，et al. Protective effect of intrarenal calcium membrane blockers before or after renal ischemia. Functional, morphological, and mitochondrial studies. J Clin Invest，1984，74：1830-1841.
2 Shapiro JI，Cheung C，Itabshi A，et al.The effect of verapamil on renal function after warm and cold ischemia in the isolated perfused rat kedney.Transplantation，1985，40：596-600.
, 百拇医药
3 Bakris GL，Copley JB，Vicknair N，et al.Calcium channel blockers versus other antihypertensive therapies on progression of NIDDM associated nephuopathy.Kidney Int，1996，50：1641-1650.
4 Goligorsky MS，Chaimovitz C，Rapoport A，et al.Calcium metabolism in uremic nephrocalcinosis：preventive effect of verapamil. Kidney Int，1985，27：774-779.
5 Harris DCH，Hammond WS，Burke TJ，et al.Verapamil protects against progression of experimental chronic renal failure. Kidney Int，1987，31：41-46.
(收稿：1998-03-11 修回：1998-08-10), 百拇医药
单位：100007 北京市第六医院内科(刘振珍)；北京中医药大学基础医学院(许文忠、魏民、黄启福、贾旭)
关键词：
中华内科杂志990218 异搏定作为一个保护性药物在各种肾功能衰竭中均被认为是有效的[1-3]。本研究旨在探讨异搏定是否对膜性肾小球肾炎也有一定的保护和治疗作用。
一、材料和方法
1.动物模型的复制：用化学方法改变天然牛血清白蛋白(中国科学院生化研究所生产，电泳纯)的等电点(PI)，使其PI在9.0以上，制成阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)。然后按Border方法在家兔复制膜性肾小球肾炎。
2.实验分组：健康雄性日本大耳白家兔26只(中国科学院遗传研究所动物中心提供)，体重2.0～2.5 kg，随机分为三组：(1)病理组12只，以C-BSA 1 mg和大肠杆菌内毒素1 mg，预先免疫1周后，每日耳静脉注入C-BSA 25 mg，实验4周后，C-BSA剂量加倍至实验结束；(2)异搏定治疗组：9只，进行预免和注射C-BSA抗原，剂量同病理组。同时，自正式注射C-BSA始，每日每只家兔灌服异搏定40mg/kg体重。(异搏定为天津市中央制药厂生产)。(3)正常对照组5只，不进行预先免疫，从耳静脉注射生理盐水每日5 ml。
, http://www.100md.com
3.观察项目：(1)肾功能测定：24小时尿蛋白定量及血肌酐测定(Hitachi 7170全自动生化仪)。(2)肾组织光镜和电镜观察(Hitachi H-000透射电镜)。(3)电镜图像立体定量分析：将电镜样本按立体学测量原理用图像分析仪(Cambridge Instruments QVANTIMET 970)进行定量分析。(4)肾小球钙离子含量的测定：使用Varian Specter 40P双光束原子吸收分光光度机，各组家兔8周末杀，检测肾小球钙离子含量。
二、结果
1.肾功能变化：病理组家兔尿蛋白定量于注射C-BSA后第4周达较高水平，第5周达最高峰，而自第6周起则有明显的逐渐下降趋势。异搏定组尿蛋白也呈此变化趋势，但明显轻于病理组，见表1。血肌酐含量的变化见表2。
表1 两组家兔注射C-BSA后尿蛋白定量的动态变化 注射
, 百拇医药
C-BSA
病理组
异搏定组
两组比较
u
只数
±s(mg)只数
±s(mg)3周
12
100.7±46.6
, http://www.100md.com 8
92.6±3.5
0.600
4周
10
223.3±61.1
8
150.4±6.6
3.746**
5周
9
397.4±20.3
7
, 百拇医药
298.9±6.4
13.707*
6周
8
245.8±44.2
7
196.1±7.1
3.134*
7周
7
129.1±14.6
7
, http://www.100md.com
111.6±2.2
3.136*
8周
5
80.8±14.8
6
74.3±2.8
0.968
注：t′检验，*P<0.05，**P<0.01；C-BSA：牛血清白蛋白
表2 病理组和异搏定组家兔血清肌酐值的动态变化 组别
血清肌酐值μmol/L
, http://www.100md.com
4周
6周
8周
正常组
81.86±20.60(5)
83.80±17.77(5)
80.44±10.61(5)
病理组
107.23±20.16(5)
235.32±42.61(5)
426.97±50.34(5)
异搏定组
, 百拇医药
105.20±30.94(5)
149.40±43.32(5)
175.92±95.47(5)
注：表内括号中为动物数；异搏定与病理组比较，*P<0.05
2.光镜观察：病理组在4周时，肾小球毛细血管壁呈均匀一致性增厚，肾小球基底膜(GBM)外侧出现典型的“钉状突起”，8周末的GBM显著增厚，肾小球硬化，球囊腔内渗出。异搏定组病变较轻，未见明显渗出。
3.透射电镜观察：病理组在4周时，肾小球上皮下有大量电子致密物沉积，GBM增厚，内皮细胞肿胀，上皮细胞有数量不等的微绒毛出现，足突变平或消失，上皮细胞胞浆广泛变薄延伸覆盖大段的GBM。异搏定组家兔注射C-BSA 后28天时肾小球上皮下可见散在的少量电子致密物沉积，足突融合较轻，8周后肾小球上皮下有多量电子致密物沉积，但基底膜增厚不明显。
, 百拇医药
4.上皮下沉积物电镜图像的定量分析：见表3。
表3 两组注射C-BSA后上皮下电子致密沉积物立体定量动态变化 组 别
注射C-BSA(
±s)组 别
注射C-BSA(
±s)4周
6周
8周
4周
, 百拇医药
6周
8周
平均直径D(μm)
平均截面积A(μm2)
病理组
0.593±
0.063
0.826±
0.103
1.146±0.099
病理组
0.293±0.060
, 百拇医药
0.561±
0.145
1.092±0.204
异搏定组
0.490±
0.019
0.541±
0.013*
0.560±0.031*
异搏定组
0.238±0.125
0.396±
, 百拇医药
0.270*
0.725±0.341*
平均周长B(μm)
体密度VV(%)
病理组
2.38±
0.23
3.28±
, 百拇医药
0.35
4.50±0.30
病理组
0.036±0.013
0.052±
0.017
0.089±0.025
异搏定组
2.13±
0.12
2.89±
0.37*
, http://www.100md.com
2.91±0.83
异搏定组
0.033±0.031
0.048±
0.017
0.059±0.021*
平均表面积S(μm2)
数密度NV(μm3)
病理组
, 百拇医药
1.15±
0.24
2.24±
0.58
4.29±0.80
病理组
0.295±0.086
0.162±
0.050
0.103±0.023
异搏定组
0.93±
, 百拇医药 0.21
1.37±
0.83*
1.83±0.23*
异搏定组
0.4±0.21*
0.206±
0.015*
0.281±0.027*
平均体积V(μm3)
, 百拇医药
面数密度SV(μm3)
病理组
0.125±
0.043
0.335±
0.137
0.845±0.180
病理组
, http://www.100md.com 0.173±0.040
0.130±
0.034
0.117±0.021
异搏定组
0.107±
0.083
0.143±
0.097*
0.257±0.113*
异搏定组
0.198±0.070
, 百拇医药
0.190±
0.030*
0.142±0.076*
比表面SS(μm2/μm3)
病理组
10.48±
, 百拇医药
1.03
7.65±
0.90
5.46±0.44
异搏定组
11.76±
0.77
10.03±
0.36*
8.37±0.25*
, 百拇医药
注：两组t检验*P<0.05；C-BSA：牛血清白蛋白
5.GBM厚度变化：见表4。
表4 病理组和异搏定组家兔肾小球基底膜厚度的动态变化(
±s) 组别4周
6周
8周
正常组
0.152±0.011
, http://www.100md.com
0.154±0.015
0.153±0.017
(5)
(5)
(5)
病理组
1.332±0.047
0.522±0.040
0.785±0.010
(8)
(8)
(8)
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异搏定组
0.271±0.036
0.034±0.010*
0.407±0.014*
(8)
(7)
(6)
注：括号内为动物数 异搏定组与病理组比较，*P<0.05
6.肾小球钙离子含量的变化：注射C-BSA后第8周，病理组肾小球钙离子含量(772.21±41.30)%为正常组(100±17.34)% 7倍以上，P<0.05；异搏定治疗组(298.06±14.96)%钙超载情况低于病理组，P<0.05。
, 百拇医药
讨论 用阳离子化牛血清白蛋白作为抗原，在Border方法的基础上加以改进，延长注射时间至8周，制作出原位免疫复合物型膜性肾小球肾炎及慢性肾功能衰竭的动物模型，其病变典型且稳定，免疫发病机制和病理变化与临床膜性肾小球肾炎很相似，其实验后期所出现的慢性肾功能衰竭的症状、体征、形态学变化均与临床十分吻合。1985年Goligorsky等[4]通过异搏定治疗慢性肾功能衰竭的实验研究，发现经异搏定治疗的动物肾皮质钙离子含量明显低于未治疗者，并观察到未经异搏定治疗的动物肾皮质有明显的线粒体肿胀破裂，认为异搏定对慢性肾功能衰竭有一定的治疗作用。在此基础上Harris等[5]进行了异搏定慢性给药治疗大鼠15周慢性肾功能衰竭模型的实验研究，研究结果证明慢性异搏定用药具有保护性对抗肾皮质钙质沉着和纠正异常的肾小管细胞钙离子超负荷运动的功效。
我们检测了家兔膜性肾小球肾炎实验终末期(肾功能衰竭期)肾皮质肾小球的Ca2+含量以及异搏定慢性给药对此的防治作用的机制。结果表明，在注射C-BSA后第8周，病理组家兔肾小球钙离子含量显著高于正常对照组，异搏定组肾小球钙离子含量则低于病理组。通过对肾小球钙含量和血清肌酐值、上皮下电子致密沉积物立体定量分析值、肾小球基底膜厚度的定量分析值的相关回归处理，发现这些参数之间存在明显的相关性。提示膜性肾小球肾炎的发展和向慢性肾功能衰竭的过渡过程中，肾小球钙离子超负荷起着相当重要的作用。异搏定能够抑制肾小球钙超载，从而对慢性肾功能衰竭的到来起到了一定的阻止作用。
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本课题为高等学校博士学科点专项科研基金资助
参考文献
1 Burke TJ，Arnold PE，Gordon JA，et al. Protective effect of intrarenal calcium membrane blockers before or after renal ischemia. Functional, morphological, and mitochondrial studies. J Clin Invest，1984，74：1830-1841.
2 Shapiro JI，Cheung C，Itabshi A，et al.The effect of verapamil on renal function after warm and cold ischemia in the isolated perfused rat kedney.Transplantation，1985，40：596-600.
, 百拇医药
3 Bakris GL，Copley JB，Vicknair N，et al.Calcium channel blockers versus other antihypertensive therapies on progression of NIDDM associated nephuopathy.Kidney Int，1996，50：1641-1650.
4 Goligorsky MS，Chaimovitz C，Rapoport A，et al.Calcium metabolism in uremic nephrocalcinosis：preventive effect of verapamil. Kidney Int，1985，27：774-779.
5 Harris DCH，Hammond WS，Burke TJ，et al.Verapamil protects against progression of experimental chronic renal failure. Kidney Int，1987，31：41-46.
(收稿：1998-03-11 修回：1998-08-10), 百拇医药