细胞凋亡的研究
作者：贾克明
单位：100700 北京军区总医院、解放军肝病研究所
关键词：
中华内科杂志990329 近年来细胞凋亡现象不仅为生物学研究者，同样也受到了临床医生的重视。肝细胞的凋亡与多种肝病有关，据目前所知在以下肝病中肝细胞凋亡现象增加：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性毛细胆管性肝硬化、Wilson病、缺血后再灌注的肝损伤等；而在肝细胞肝癌和胆管性肝癌时肝细胞凋亡现象减少[1]。
有关病毒性肝炎的细胞凋亡现象知之最早，Kerr等[2]在1972年就提出了细胞凋亡(apoptosis)的名称，7年以后Kerr等[3]又明确指出，慢性活动性肝炎时门脉周围所见的所谓碎屑样坏死(piecemeal necrosis)主要是肝细胞凋亡，但肝细胞凋亡残骸被周围细胞(包括周围肝细胞及吞噬细胞)迅速清除，而仅留的坏死及炎性改变却被认为是肝炎的特征之一，Kerr的报告被忽视达20余年之久。近年由于对人体细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的研究和对线虫细胞凋亡的研究进展，肝病时的细胞凋亡再次受到人们的注意。众所周知，病毒性肝炎时，肝内常同时出现肝细胞坏死和肝细胞凋亡两种现象：即通过CTL产生的穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)所引起的以肝细胞膜破损为特征的坏死，及以CTL表达的Fas配体(FasL)和肝细胞表达的Fas结合所引起以DNA断裂为特征的凋亡。二者都和CTL有直接关系，二者的出现互有联系，但肝细胞受感染后表现为坏死或凋亡，其转换关键是什么却一直不大了解，近年在细胞水平的实验中初步证明，出现坏死或凋亡取决于细胞能量的供应如何。Leist等[4]证明，肝细胞坏死过程中不论从糖酵解或从线粒体得到充分的ATP供应时，可以转为凋亡，而对正在凋亡的细胞断绝ATP补充时就转换为坏死[5]。虽然这是体外细胞水平的实验，体内如何尚待研究，特别是什么机制使不同细胞的能量供应发生差异还远未明了，但这一发现十分值得重视，因为它初步提示外部因素可能影响坏死和凋亡的进程，远期可能具有实用价值。
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肝细胞凋亡在开始时必须有肝细胞表达的死亡基因受体(death domain receptor)和淋巴细胞表达的相应配体结合才能开始。这包括(1)FasL及其受体Fas；(2)转化生长因子β(TGFβ)及其受体TGFβ R；(3)肿瘤坏死因子(TNF)及其受体TNF R；(4)TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)和其受体CD4及CD5等，以下仅就目前研究较多的FasL和Fas作一初步介绍。
一、近两年对细胞凋亡的研究
近两年的实验研究显示，细胞凋亡发生机制涉及面很广，虽然这些研究仍未能对肝炎出现的细胞凋亡现象加以说明，但对今后理解会有所帮助。近年的实验研究概括起来有一点，即由Fas和FasL所导致的细胞凋亡是一系列胱氨酸酰门冬氨酸特异性蛋白酶(caspase酶)的激活所引起的，但是最初激活caspase的因子是什么，以后一系列caspase是如何层层激活的，最后caspase作用于细胞内什么靶蛋白，这种靶蛋白的裂解物最终怎样导致凋亡，这都是目前正在积极研究的问题[6]。
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二、什么是caspase
人们在研究线虫(nematode)的细胞凋亡现象时得知，导致线虫细胞凋亡的过程中至少有14种基因起作用，这些基因被统称为细胞死亡基因，略作ced基因。ced基因中了解较多的有ced-3和ced-4，二者都是促凋亡基因(pro-apoptotic)，还有ced-9是抗凋亡基因(anti-apoptotic)。这些基因经cDNA克隆后，经过在人体内大力寻找发现了和线虫相类似的基因，当时暂被命名为CED-3和CED-9，而此CED-9即近似已熟知的人体中抑制细胞凋亡的Bcl-2,CED-3近似白细胞介素-1β转换酶，此酶原命名为ICE，现被命名为caspase-1。过去并不知人的ICE和细胞凋亡有关，由于当线虫的ced-3发生变异时可使发育中线虫的131种细胞凋亡现象消失，提示ced-3对凋亡至关重要。经过在人体细胞的研究发现，ICE(即caspase-1)可能是参与人体中细胞凋亡的酶，而以后的研究证实了这一推断。一系列caspase酶后面的序号并不提示它在凋亡中发挥作用的先后，只提示人们对它分离成功及序列分析的先后，但caspase(cysteinylasp artate specific proteinase)这一词能指出这一族蛋白裂解酶的特定意义，即它是胱氨酸蛋白裂解酶，且它的特定裂解部位是在门冬氨酸之后。目前已经证实，人体中caspase至少有13种。caspase这一族蛋白裂解酶从功能上大概有两方面，caspase-2、-3、-8、-10主要起凋亡作用,而caspase-1、-4、-5偏重于起炎症反应作用。caspase在未被激活前都称为procaspase,在胞浆内procaspase-8(此外可能还有procaspase-2、-10)位于接近细胞膜处,由于Fas是穿膜蛋白(type 1 integral membrane protein)，故考虑凋亡开始时最早和Fas接触的是procaspase-8,以后体外试验也证明caspase-8可以裂解caspase-3、-4、-7、-9,而caspase-10也可以裂解caspase-3、-7、-8,故目前认为参与凋亡最早的caspase是caspase-8,至于体内生理情况下是否有其他caspase参与启动尚待进一步确定[7]。
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对凋亡研究的现状有两点应加以说明，首先，caspase是由于对线虫凋亡的研究而在人体中发现的。目前已知ced至少有14种，人体的caspase已确定13种，还在继续寻找。但至今还不能确切指出哪一种ced相当于哪一种caspase，所以说某一ced和某一caspase“同源”是不恰当的。例如，从caspase-1到caspase-10的10种caspases都和ced-3有一定的相同序列，但这种相同序列仅占25%～35%，因之两者不能勉强一一对应。其次，为什么凋亡要有如此多的ced,人体凋亡要有如此多的caspase现在也还不清楚。如果说caspase也像凝血因子一样是“瀑布式”(cascade)的层层激活，现有资料还不能证明。是否为不同组织、不同基质需要不同caspase或细胞内不同部分(如核、胞浆、线粒体)需要不同caspase参加。更为复杂的是，凋亡细胞中存在caspase裂解为大小不同的片断，这些片断是否有不同作用都待今后的研究。
三、什么因子开始激活procaspase
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当人的细胞开始凋亡时，可见到细胞色素C从线粒体迅速释放于胞浆内，在胞浆中激活一系列蛋白裂解酶，这个现象为研究凋亡开始提供了重要线索。
前面已经提到caspase可以裂解一系列基质(包括caspase族本身)最后导致凋亡，但caspase本身是如何被启动激活的呢?这也需要借助于线虫凋亡的实验结果。线虫细胞凋亡的开始途径已比较明确，是由线虫的pro-ced-3和ced-4相互“作用”而引起的，如果ced-4发生变异就不可能出现凋亡，提示ced-4是惟一可以激活ced-3的物质。但在正常无凋亡的细胞中ced-4是与ced-9结合的，这种结合的结构使ced-4处于不活化状态，不能激活ced-3，故不能发生凋亡。所以线虫细胞凋亡的启动顺序可以简单地归结为ced-9、ced-4、ced-3[8]。Wang等的实验证明，人体细胞凋亡的启动和线虫类似，并成功地从人的细胞提取物中分离出3种蛋白，命名为“凋亡蛋白酶激活因子”(apoptotic protease activating factors，APAFs)也称为“凋亡启动因子”(apoptosis initiating factors，AIFs)，最近证明这3种APAFs中的APAFs-1即相当于线虫的ced-4,APAFs-3相当于ced-3，而长久不明的APAFs-2是位于线粒体的内膜外面的细胞色素C，这样就可以理解凋亡启动时大量细胞色素C释放于胞浆的原因了。这样人体细胞凋亡的激活开始顺序成为APAFs-2、APAFs-1、APAFs-3与在线虫中所见顺序ced-9、ced-4、ced-3十分相似[9]。
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细胞色素C(即APAFs-2)为什么会在凋亡出现前迅速从线粒体内膜释放于胞浆激活APAFs-3，从而引起以后一系列裂解呢?Polyak等的实验提示，线粒体迅速释放细胞色素C(甚至还有其他未明的启动因子AIFs)是受核内p53所诱导的新基因(p53 induced gene，PIG-3)所促成的，这还仍在进一步研究中[10]。
对凋亡的启动原因，目前认为虽然线粒体更为直接明显，但实际上核内p53所诱导的新基因、膜上的Fas-FasL和线粒体内膜三者都是必不可缺的[11]。
四、caspase怎样向下传达凋亡信号
如上所述，当Fas和FasL结合时最早和膜下Fas部分接触的为procaspase-8。从结构上看，procaspase-8的N端是具有两个60aa(氨基酸残基)，是极易和其他蛋白连接的部分，这部分具有蛋白和蛋白连接功能的序列，被称为死亡效应区(death effector domain，DED)，然而此时procaspase-8还必需另一种称为“适应”蛋白(adapter)的参与才可被激活。此“适应”蛋白名为“Fas伴随性死亡基因区蛋白”(Fas associated death domain protein，FADD)，值得注意的是，Nagata于1993年发现的Fas中曾包括了FADD序列中的80aa，以后Goeddel等称此区为死亡基因区(death domain，DD)。前述procaspase-8的蛋白与蛋白的连接部位即指procaspase-8的DED、FADD和DD的连接部位，既往认为Fas具有死亡基因区实际上是FADD的DD及procaspase-8的DED二者的连接部位，正如Dixit指出，所谓死亡基因区不是别的，只不过是蛋白和蛋白的相互作用区而已，死亡的原因还待继续寻找。caspase-8和FADD作用后如何形成所谓死亡诱导信号复合物(death-inducing signaling complex)，此复合物又如何层层作用于其他一系列caspase,是瀑布式的或其他方式的激活，以及最终细胞内的靶蛋白是什么，仍然尚不明确。
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五、caspase的最终靶蛋白是什么
细胞内被称为最终靶蛋白究竟指什么一直没有定论，最近Nagata等证明，细胞内所谓最终靶蛋白实际上就是生物分子结构最复杂的染色质(chromatin)，而作用于染色质的蛋白裂解酶是caspase-3，并证明caspase-3不能直接作用于染色质而是先作用于另一具有343aa的碱性核酶，由于此核酶能被caspase-3所“活化”，故名为“caspase活化性核酶”(caspase-activated DNase，CAD)。此酶能在DNA上识别一定的序列并在该处使其断裂而成“梯形染色质”(chromatin ladder)，一般认为这是细胞凋亡的典型表现[12]。Nagata等还报道，在未发生凋亡的细胞内只能检出CAD的抑制物(ICAD)而检不出CAD，这是由于ICAD平时和CAD结合并抑制着CAD的作用，当ICAD被caspase-3裂解时即释出CAD，说明ICAD具有被caspase裂解的部位，而CAD无此部位，ICAD为一种酸性蛋白，以两种形式存在，性质相同，分别为265aa及331aa。以上所述似乎初步可以说明细胞凋亡时“梯形染色质”出现的原因了，但人们不禁要问和凋亡细胞相邻的、生长中的正常细胞同样有染色质，同样有ICAD和caspase-3，为什么不发生凋亡呢?不仅不发生凋亡反而主动地把邻近凋亡细胞的遗迹(凋亡小体)很快不留痕迹地处理掉呢?这显然提示细胞凋亡不是单个细胞垂直一线的裂解过程，而是和周围有尚未明了的横向网络联系，例如各种细胞因子等，然而目前对此知之甚少。我们目前了解到，使染色质断裂的是CAD而非caspase-3，这是对凋亡的认识深入了一步，然而染色质梯形断裂是凋亡的最终结果，还仅是凋亡正在进行的过程，尚待对ICAD/CAD途径的进一步研究[13，14]。
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六、促进或抑制凋亡的因素
前述的p53、导致细胞坏死的颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素都兼有凋亡促进作用。人体本身就有一系列抑制凋亡的基因蛋白(IAP)，例如Pitti等发现，人体除Fas可以和FasL结合外，还有类似Fas的分子，称为伪装受体(DcR3)，它也和FasL结合而不传达凋亡信息，平时对凋亡可以起调节作用，但肿瘤可以大量产生DcR3使肿瘤不能凋亡。牛痘病毒的CrmA(cytokine response modifier-A)可以抑制caspase-1、-8、-3、-6，而杆状病毒(baculovirus)产生的p35蛋白可抑制caspase-1、-2、-3、-4。它们的生物学意义还不清楚，可能病毒防止细胞凋亡有利于病毒的传播，这些都有待今后研究，至于病毒性肝炎有无CrmA类似物尚未见报道。
以上简要介绍了细胞凋亡研究进展的近况，而且是只限于Fas和FasL,可以看出我们尚远未能判明凋亡的发生机制及过程，对凋亡和坏死的分歧点何在也知之甚少。深入研究凋亡可能对疾病的发病机制会有更深的理解，而研究caspases的启动、信号传达以及CAD等都是刻不容缓的课题。
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参考文献
1 Patel T, Robert LR, Jones BA, et al. Dysregulation of apoptosis as a mechanism of liver disease: an overview. Semin Liver Dis, 1998,18：105-114.
2 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972,26：239-257.
3 Kerr JF, Looksley WG, Searle J, et al. The nature of piecemeal necrosis in chronic active hepatitis. Lancet, 1979,2：827.
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4 Leist M, Single B, Castoldi AF, et al. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med, 1997,185：1481-1486.
5 Pitot HC. Heatocyte death in hepatocarcinogenesis. Hepatoloy, 1998,28：1-5.
6 Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci, 1997,22：299-306.
7 Villa P, Kaufmann SH, Earnshaw WC. Caspases and caspase inhibitors. Trends Biochem Sci, 1997,22：388-393.
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8 Rosse T, Olivier R, Monney L, et al. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome C. Nature, 1998,391：496-499.
9 Zhivotovsky B, Orrenius S, Brustung OT, et al. Injected cytochrome C induces apoptosis. Nature, 1998,391：449-450.
10 Hengartner MO. Death cycle and Swiss army knives. Nature, 1998,391：441-442.
11 Wyllie A. Apoptosis. Clues in the p53 murder mystery. Nature, 1997,389：237-238.
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12 Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apopotosis, and its inhibitor ICAD. Nature, 1998,391：43-50.
13 Sakahira H, Enari M, Nagata S. Cleavge of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature, 1998,391：96-99.
14 Wyllie A. An endonuclease at last. Nature, 1998,391：20-21.
(收稿：1998-03-10 修回：1998-10-08), 百拇医药
单位：100700 北京军区总医院、解放军肝病研究所
关键词：
中华内科杂志990329 近年来细胞凋亡现象不仅为生物学研究者，同样也受到了临床医生的重视。肝细胞的凋亡与多种肝病有关，据目前所知在以下肝病中肝细胞凋亡现象增加：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、原发性毛细胆管性肝硬化、Wilson病、缺血后再灌注的肝损伤等；而在肝细胞肝癌和胆管性肝癌时肝细胞凋亡现象减少[1]。
有关病毒性肝炎的细胞凋亡现象知之最早，Kerr等[2]在1972年就提出了细胞凋亡(apoptosis)的名称，7年以后Kerr等[3]又明确指出，慢性活动性肝炎时门脉周围所见的所谓碎屑样坏死(piecemeal necrosis)主要是肝细胞凋亡，但肝细胞凋亡残骸被周围细胞(包括周围肝细胞及吞噬细胞)迅速清除，而仅留的坏死及炎性改变却被认为是肝炎的特征之一，Kerr的报告被忽视达20余年之久。近年由于对人体细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的研究和对线虫细胞凋亡的研究进展，肝病时的细胞凋亡再次受到人们的注意。众所周知，病毒性肝炎时，肝内常同时出现肝细胞坏死和肝细胞凋亡两种现象：即通过CTL产生的穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)所引起的以肝细胞膜破损为特征的坏死，及以CTL表达的Fas配体(FasL)和肝细胞表达的Fas结合所引起以DNA断裂为特征的凋亡。二者都和CTL有直接关系，二者的出现互有联系，但肝细胞受感染后表现为坏死或凋亡，其转换关键是什么却一直不大了解，近年在细胞水平的实验中初步证明，出现坏死或凋亡取决于细胞能量的供应如何。Leist等[4]证明，肝细胞坏死过程中不论从糖酵解或从线粒体得到充分的ATP供应时，可以转为凋亡，而对正在凋亡的细胞断绝ATP补充时就转换为坏死[5]。虽然这是体外细胞水平的实验，体内如何尚待研究，特别是什么机制使不同细胞的能量供应发生差异还远未明了，但这一发现十分值得重视，因为它初步提示外部因素可能影响坏死和凋亡的进程，远期可能具有实用价值。
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肝细胞凋亡在开始时必须有肝细胞表达的死亡基因受体(death domain receptor)和淋巴细胞表达的相应配体结合才能开始。这包括(1)FasL及其受体Fas；(2)转化生长因子β(TGFβ)及其受体TGFβ R；(3)肿瘤坏死因子(TNF)及其受体TNF R；(4)TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand)和其受体CD4及CD5等，以下仅就目前研究较多的FasL和Fas作一初步介绍。
一、近两年对细胞凋亡的研究
近两年的实验研究显示，细胞凋亡发生机制涉及面很广，虽然这些研究仍未能对肝炎出现的细胞凋亡现象加以说明，但对今后理解会有所帮助。近年的实验研究概括起来有一点，即由Fas和FasL所导致的细胞凋亡是一系列胱氨酸酰门冬氨酸特异性蛋白酶(caspase酶)的激活所引起的，但是最初激活caspase的因子是什么，以后一系列caspase是如何层层激活的，最后caspase作用于细胞内什么靶蛋白，这种靶蛋白的裂解物最终怎样导致凋亡，这都是目前正在积极研究的问题[6]。
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二、什么是caspase
人们在研究线虫(nematode)的细胞凋亡现象时得知，导致线虫细胞凋亡的过程中至少有14种基因起作用，这些基因被统称为细胞死亡基因，略作ced基因。ced基因中了解较多的有ced-3和ced-4，二者都是促凋亡基因(pro-apoptotic)，还有ced-9是抗凋亡基因(anti-apoptotic)。这些基因经cDNA克隆后，经过在人体内大力寻找发现了和线虫相类似的基因，当时暂被命名为CED-3和CED-9，而此CED-9即近似已熟知的人体中抑制细胞凋亡的Bcl-2,CED-3近似白细胞介素-1β转换酶，此酶原命名为ICE，现被命名为caspase-1。过去并不知人的ICE和细胞凋亡有关，由于当线虫的ced-3发生变异时可使发育中线虫的131种细胞凋亡现象消失，提示ced-3对凋亡至关重要。经过在人体细胞的研究发现，ICE(即caspase-1)可能是参与人体中细胞凋亡的酶，而以后的研究证实了这一推断。一系列caspase酶后面的序号并不提示它在凋亡中发挥作用的先后，只提示人们对它分离成功及序列分析的先后，但caspase(cysteinylasp artate specific proteinase)这一词能指出这一族蛋白裂解酶的特定意义，即它是胱氨酸蛋白裂解酶，且它的特定裂解部位是在门冬氨酸之后。目前已经证实，人体中caspase至少有13种。caspase这一族蛋白裂解酶从功能上大概有两方面，caspase-2、-3、-8、-10主要起凋亡作用,而caspase-1、-4、-5偏重于起炎症反应作用。caspase在未被激活前都称为procaspase,在胞浆内procaspase-8(此外可能还有procaspase-2、-10)位于接近细胞膜处,由于Fas是穿膜蛋白(type 1 integral membrane protein)，故考虑凋亡开始时最早和Fas接触的是procaspase-8,以后体外试验也证明caspase-8可以裂解caspase-3、-4、-7、-9,而caspase-10也可以裂解caspase-3、-7、-8,故目前认为参与凋亡最早的caspase是caspase-8,至于体内生理情况下是否有其他caspase参与启动尚待进一步确定[7]。
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对凋亡研究的现状有两点应加以说明，首先，caspase是由于对线虫凋亡的研究而在人体中发现的。目前已知ced至少有14种，人体的caspase已确定13种，还在继续寻找。但至今还不能确切指出哪一种ced相当于哪一种caspase，所以说某一ced和某一caspase“同源”是不恰当的。例如，从caspase-1到caspase-10的10种caspases都和ced-3有一定的相同序列，但这种相同序列仅占25%～35%，因之两者不能勉强一一对应。其次，为什么凋亡要有如此多的ced,人体凋亡要有如此多的caspase现在也还不清楚。如果说caspase也像凝血因子一样是“瀑布式”(cascade)的层层激活，现有资料还不能证明。是否为不同组织、不同基质需要不同caspase或细胞内不同部分(如核、胞浆、线粒体)需要不同caspase参加。更为复杂的是，凋亡细胞中存在caspase裂解为大小不同的片断，这些片断是否有不同作用都待今后的研究。
三、什么因子开始激活procaspase
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当人的细胞开始凋亡时，可见到细胞色素C从线粒体迅速释放于胞浆内，在胞浆中激活一系列蛋白裂解酶，这个现象为研究凋亡开始提供了重要线索。
前面已经提到caspase可以裂解一系列基质(包括caspase族本身)最后导致凋亡，但caspase本身是如何被启动激活的呢?这也需要借助于线虫凋亡的实验结果。线虫细胞凋亡的开始途径已比较明确，是由线虫的pro-ced-3和ced-4相互“作用”而引起的，如果ced-4发生变异就不可能出现凋亡，提示ced-4是惟一可以激活ced-3的物质。但在正常无凋亡的细胞中ced-4是与ced-9结合的，这种结合的结构使ced-4处于不活化状态，不能激活ced-3，故不能发生凋亡。所以线虫细胞凋亡的启动顺序可以简单地归结为ced-9、ced-4、ced-3[8]。Wang等的实验证明，人体细胞凋亡的启动和线虫类似，并成功地从人的细胞提取物中分离出3种蛋白，命名为“凋亡蛋白酶激活因子”(apoptotic protease activating factors，APAFs)也称为“凋亡启动因子”(apoptosis initiating factors，AIFs)，最近证明这3种APAFs中的APAFs-1即相当于线虫的ced-4,APAFs-3相当于ced-3，而长久不明的APAFs-2是位于线粒体的内膜外面的细胞色素C，这样就可以理解凋亡启动时大量细胞色素C释放于胞浆的原因了。这样人体细胞凋亡的激活开始顺序成为APAFs-2、APAFs-1、APAFs-3与在线虫中所见顺序ced-9、ced-4、ced-3十分相似[9]。
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细胞色素C(即APAFs-2)为什么会在凋亡出现前迅速从线粒体内膜释放于胞浆激活APAFs-3，从而引起以后一系列裂解呢?Polyak等的实验提示，线粒体迅速释放细胞色素C(甚至还有其他未明的启动因子AIFs)是受核内p53所诱导的新基因(p53 induced gene，PIG-3)所促成的，这还仍在进一步研究中[10]。
对凋亡的启动原因，目前认为虽然线粒体更为直接明显，但实际上核内p53所诱导的新基因、膜上的Fas-FasL和线粒体内膜三者都是必不可缺的[11]。
四、caspase怎样向下传达凋亡信号
如上所述，当Fas和FasL结合时最早和膜下Fas部分接触的为procaspase-8。从结构上看，procaspase-8的N端是具有两个60aa(氨基酸残基)，是极易和其他蛋白连接的部分，这部分具有蛋白和蛋白连接功能的序列，被称为死亡效应区(death effector domain，DED)，然而此时procaspase-8还必需另一种称为“适应”蛋白(adapter)的参与才可被激活。此“适应”蛋白名为“Fas伴随性死亡基因区蛋白”(Fas associated death domain protein，FADD)，值得注意的是，Nagata于1993年发现的Fas中曾包括了FADD序列中的80aa，以后Goeddel等称此区为死亡基因区(death domain，DD)。前述procaspase-8的蛋白与蛋白的连接部位即指procaspase-8的DED、FADD和DD的连接部位，既往认为Fas具有死亡基因区实际上是FADD的DD及procaspase-8的DED二者的连接部位，正如Dixit指出，所谓死亡基因区不是别的，只不过是蛋白和蛋白的相互作用区而已，死亡的原因还待继续寻找。caspase-8和FADD作用后如何形成所谓死亡诱导信号复合物(death-inducing signaling complex)，此复合物又如何层层作用于其他一系列caspase,是瀑布式的或其他方式的激活，以及最终细胞内的靶蛋白是什么，仍然尚不明确。
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五、caspase的最终靶蛋白是什么
细胞内被称为最终靶蛋白究竟指什么一直没有定论，最近Nagata等证明，细胞内所谓最终靶蛋白实际上就是生物分子结构最复杂的染色质(chromatin)，而作用于染色质的蛋白裂解酶是caspase-3，并证明caspase-3不能直接作用于染色质而是先作用于另一具有343aa的碱性核酶，由于此核酶能被caspase-3所“活化”，故名为“caspase活化性核酶”(caspase-activated DNase，CAD)。此酶能在DNA上识别一定的序列并在该处使其断裂而成“梯形染色质”(chromatin ladder)，一般认为这是细胞凋亡的典型表现[12]。Nagata等还报道，在未发生凋亡的细胞内只能检出CAD的抑制物(ICAD)而检不出CAD，这是由于ICAD平时和CAD结合并抑制着CAD的作用，当ICAD被caspase-3裂解时即释出CAD，说明ICAD具有被caspase裂解的部位，而CAD无此部位，ICAD为一种酸性蛋白，以两种形式存在，性质相同，分别为265aa及331aa。以上所述似乎初步可以说明细胞凋亡时“梯形染色质”出现的原因了，但人们不禁要问和凋亡细胞相邻的、生长中的正常细胞同样有染色质，同样有ICAD和caspase-3，为什么不发生凋亡呢?不仅不发生凋亡反而主动地把邻近凋亡细胞的遗迹(凋亡小体)很快不留痕迹地处理掉呢?这显然提示细胞凋亡不是单个细胞垂直一线的裂解过程，而是和周围有尚未明了的横向网络联系，例如各种细胞因子等，然而目前对此知之甚少。我们目前了解到，使染色质断裂的是CAD而非caspase-3，这是对凋亡的认识深入了一步，然而染色质梯形断裂是凋亡的最终结果，还仅是凋亡正在进行的过程，尚待对ICAD/CAD途径的进一步研究[13，14]。
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六、促进或抑制凋亡的因素
前述的p53、导致细胞坏死的颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素都兼有凋亡促进作用。人体本身就有一系列抑制凋亡的基因蛋白(IAP)，例如Pitti等发现，人体除Fas可以和FasL结合外，还有类似Fas的分子，称为伪装受体(DcR3)，它也和FasL结合而不传达凋亡信息，平时对凋亡可以起调节作用，但肿瘤可以大量产生DcR3使肿瘤不能凋亡。牛痘病毒的CrmA(cytokine response modifier-A)可以抑制caspase-1、-8、-3、-6，而杆状病毒(baculovirus)产生的p35蛋白可抑制caspase-1、-2、-3、-4。它们的生物学意义还不清楚，可能病毒防止细胞凋亡有利于病毒的传播，这些都有待今后研究，至于病毒性肝炎有无CrmA类似物尚未见报道。
以上简要介绍了细胞凋亡研究进展的近况，而且是只限于Fas和FasL,可以看出我们尚远未能判明凋亡的发生机制及过程，对凋亡和坏死的分歧点何在也知之甚少。深入研究凋亡可能对疾病的发病机制会有更深的理解，而研究caspases的启动、信号传达以及CAD等都是刻不容缓的课题。
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参考文献
1 Patel T, Robert LR, Jones BA, et al. Dysregulation of apoptosis as a mechanism of liver disease: an overview. Semin Liver Dis, 1998,18：105-114.
2 Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972,26：239-257.
3 Kerr JF, Looksley WG, Searle J, et al. The nature of piecemeal necrosis in chronic active hepatitis. Lancet, 1979,2：827.
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4 Leist M, Single B, Castoldi AF, et al. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med, 1997,185：1481-1486.
5 Pitot HC. Heatocyte death in hepatocarcinogenesis. Hepatoloy, 1998,28：1-5.
6 Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci, 1997,22：299-306.
7 Villa P, Kaufmann SH, Earnshaw WC. Caspases and caspase inhibitors. Trends Biochem Sci, 1997,22：388-393.
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(收稿：1998-03-10 修回：1998-10-08), 百拇医药