HERG基因在低氧性肺动脉高压大鼠肺小动脉平滑肌中的表达
作者：陈文彬 杜国清 程德云
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院内科
关键词：
中华内科杂志990319 用地高辛标记延迟整流性钾通道基因HERG的cDNA为探针，通过原位杂交法检测正常和低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠肺小动脉平滑肌HERG的表达。目的在于探讨慢性低氧导致肺动脉平滑肌细胞膜去极化，引起肺动脉高压是否与HERG基因表达改变有关，及其在HPH发病机制中发挥的作用。
一、材料与方法
雄性Wistar大鼠20只，体重220～250 g，按体重配对分为正常对照组与低氧组。低氧组大鼠采用常压低氧3周复制成HPH模型。低氧结束后，以导管法测定肺动脉压，以确定HPH模型已建立。取两组大鼠肺组织，以福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。HERG基因由威斯康辛大学Ganetzky教授惠赠，cDNA全长1.6 kbp。质粒DNA转化JM109，小量提取，经电泳酶切鉴定后，大量制备质粒DNA备用。HERG质粒DNA经EcoRI酶切呈线状，用Promega公司DNA Clean Up试剂盒回收，采用BM公司非同位素标记试剂盒，按说明加Sp6 RNA聚合酶进行标记，反应完毕后取少量标记cRNA产物进行鉴定，制备HERG cRNA探针。按照BM公司提供的方法略加改进进行原位杂交，cRNA探针使用前采用超声波处理，使其片段大约为500～700 bp，杂交后染色封片。于倒置显微镜下观察结果，蓝色者为阳性。
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二、结果
HPH大鼠肺小动脉平滑肌细胞上HERG基因表达明显低于正常大鼠，见图1，2。
图1 正常大鼠肺小动脉平滑肌HERG基因表达明显 原位杂交×400
图2 低氧性肺动脉高压大鼠肺小动脉平滑肌增生肥厚，HERG基因表达明显减少 原位杂交×400
讨论 Albarwani等[1]曾对大鼠肺动脉各段平滑肌细胞的钾离子通道进行了较系统的研究，发现在主肺动脉平滑肌细胞膜上K+Ca-ATP通道占主要地位，而在肺小动脉除存在这些通道外，延迟整流性钾通道亦起着十分重要的作用。研究表明，钾通道活性可调节动脉舒张或收缩功能，主要是通过对动脉平滑肌细胞膜钾通道的开放或抑制进行的。当钾通道开放，细胞钾离子外流增加，细胞膜超极化，一方面通过关闭电压门控钙通道，使细胞外钙内流减少；另一方面通过钠和钙交换及三磷酸肌醇途径使细胞内钙释放减少，导致细胞内游离钙与钙调素结合下降，肌球蛋白轻链激酶活性降低，肌动与肌球蛋白相互作用产生的收缩力也减弱，从而导致血管舒张。相反，钾通道活性受抑制时，则引起血管平滑肌细胞膜去极化，从而导致血管收缩[2]。我们曾用小片膜单通道技术对慢性低氧3周大鼠肺动脉平滑肌细胞延迟整流性钾通道活性进行了检测，结果表明其活性明显降低，证明了低氧可显著地抑制延迟整流性钾通道的活性，从而使肺小动脉收缩，阻力增加并发生肺动脉高压[3]。
, 百拇医药
血管平滑肌延迟整流性钾通道的活性受该通道的基因表达多寡予以调控，当延迟整流性钾通道基因表达增多时，该通道数量增多，其活性增强，反之则数量减少，活性减弱。HERG基因是Genetzky等于1994年由人大脑海马组织中克隆并鉴定的一种延迟整流性钾通道基因，属电压门控性钾通道家族[4]。本研究发现，HERG基因在低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞中表达降低，提示其表达减少是低氧导致肺动脉平滑肌细胞延迟整流性钾通道活性下降，引起肺小动脉收缩、阻力增高和形成肺动脉高压的主要机制之一。
最近有人发现，当把促有丝分裂因子、细胞周期素B和P34cdc2的复合物注入爪蟾卵母细胞中，可阻止其延迟整流性钾通道REAG基因(与HERG基因同源)的表达，表明细胞分裂增殖过程中钾离子通道基因可能发挥着重要的调控作用[5]。本研究发现，HERG基因在HPH大鼠肺动脉平滑肌中表达减少，除其影响钾通道活性外，是否亦与肺动脉高压时肺血管重建的发生有关值得进一步探讨。
, 百拇医药
本课题受国家“九五”科技攻关专题基金资助(基金编号：96-906-02-17)
参考文献
1 Albarwani S, Heinert G, Turner JL, et al. K+ channel diversity in smooth muscle cells isolated from the pulmonary artery tree of the rat. J Physiol, 1995, 483:110.
2 Nelson MT, Quayle JM. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscles. Am J Physiol, 1995, 268(4 Pt 1):C799-822.
, 百拇医药
3 肖欣荣，陈文彬，程德云.慢性缺氧抑制肺动脉平滑肌细胞钾通道活性.中华结核和呼吸杂志，1998，21：681-685.
4 Trudeau MC, Warmke JW, Genetzky B, et al. HERG, a human inward rectifier in the voltage-gated potassium channel family. Science, 1995, 269:92-95.
5 Brueggemann A, Stuehmer W, Pardo L. Mitosis-promoting factor-mediated suppression of a cloned delayed rectifier potassium channel expressed in Xenopus Oocytes. PNAS, 1997, 94:537-542.
(收稿：1998-03-24 修回：1998-12-03), http://www.100md.com
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院内科
关键词：
中华内科杂志990319 用地高辛标记延迟整流性钾通道基因HERG的cDNA为探针，通过原位杂交法检测正常和低氧性肺动脉高压(HPH)大鼠肺小动脉平滑肌HERG的表达。目的在于探讨慢性低氧导致肺动脉平滑肌细胞膜去极化，引起肺动脉高压是否与HERG基因表达改变有关，及其在HPH发病机制中发挥的作用。
一、材料与方法
雄性Wistar大鼠20只，体重220～250 g，按体重配对分为正常对照组与低氧组。低氧组大鼠采用常压低氧3周复制成HPH模型。低氧结束后，以导管法测定肺动脉压，以确定HPH模型已建立。取两组大鼠肺组织，以福尔马林固定，常规石蜡包埋切片。HERG基因由威斯康辛大学Ganetzky教授惠赠，cDNA全长1.6 kbp。质粒DNA转化JM109，小量提取，经电泳酶切鉴定后，大量制备质粒DNA备用。HERG质粒DNA经EcoRI酶切呈线状，用Promega公司DNA Clean Up试剂盒回收，采用BM公司非同位素标记试剂盒，按说明加Sp6 RNA聚合酶进行标记，反应完毕后取少量标记cRNA产物进行鉴定，制备HERG cRNA探针。按照BM公司提供的方法略加改进进行原位杂交，cRNA探针使用前采用超声波处理，使其片段大约为500～700 bp，杂交后染色封片。于倒置显微镜下观察结果，蓝色者为阳性。
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二、结果
HPH大鼠肺小动脉平滑肌细胞上HERG基因表达明显低于正常大鼠，见图1，2。
图1 正常大鼠肺小动脉平滑肌HERG基因表达明显 原位杂交×400
图2 低氧性肺动脉高压大鼠肺小动脉平滑肌增生肥厚，HERG基因表达明显减少 原位杂交×400
讨论 Albarwani等[1]曾对大鼠肺动脉各段平滑肌细胞的钾离子通道进行了较系统的研究，发现在主肺动脉平滑肌细胞膜上K+Ca-ATP通道占主要地位，而在肺小动脉除存在这些通道外，延迟整流性钾通道亦起着十分重要的作用。研究表明，钾通道活性可调节动脉舒张或收缩功能，主要是通过对动脉平滑肌细胞膜钾通道的开放或抑制进行的。当钾通道开放，细胞钾离子外流增加，细胞膜超极化，一方面通过关闭电压门控钙通道，使细胞外钙内流减少；另一方面通过钠和钙交换及三磷酸肌醇途径使细胞内钙释放减少，导致细胞内游离钙与钙调素结合下降，肌球蛋白轻链激酶活性降低，肌动与肌球蛋白相互作用产生的收缩力也减弱，从而导致血管舒张。相反，钾通道活性受抑制时，则引起血管平滑肌细胞膜去极化，从而导致血管收缩[2]。我们曾用小片膜单通道技术对慢性低氧3周大鼠肺动脉平滑肌细胞延迟整流性钾通道活性进行了检测，结果表明其活性明显降低，证明了低氧可显著地抑制延迟整流性钾通道的活性，从而使肺小动脉收缩，阻力增加并发生肺动脉高压[3]。
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血管平滑肌延迟整流性钾通道的活性受该通道的基因表达多寡予以调控，当延迟整流性钾通道基因表达增多时，该通道数量增多，其活性增强，反之则数量减少，活性减弱。HERG基因是Genetzky等于1994年由人大脑海马组织中克隆并鉴定的一种延迟整流性钾通道基因，属电压门控性钾通道家族[4]。本研究发现，HERG基因在低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞中表达降低，提示其表达减少是低氧导致肺动脉平滑肌细胞延迟整流性钾通道活性下降，引起肺小动脉收缩、阻力增高和形成肺动脉高压的主要机制之一。
最近有人发现，当把促有丝分裂因子、细胞周期素B和P34cdc2的复合物注入爪蟾卵母细胞中，可阻止其延迟整流性钾通道REAG基因(与HERG基因同源)的表达，表明细胞分裂增殖过程中钾离子通道基因可能发挥着重要的调控作用[5]。本研究发现，HERG基因在HPH大鼠肺动脉平滑肌中表达减少，除其影响钾通道活性外，是否亦与肺动脉高压时肺血管重建的发生有关值得进一步探讨。
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本课题受国家“九五”科技攻关专题基金资助(基金编号：96-906-02-17)
参考文献
1 Albarwani S, Heinert G, Turner JL, et al. K+ channel diversity in smooth muscle cells isolated from the pulmonary artery tree of the rat. J Physiol, 1995, 483:110.
2 Nelson MT, Quayle JM. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscles. Am J Physiol, 1995, 268(4 Pt 1):C799-822.
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3 肖欣荣，陈文彬，程德云.慢性缺氧抑制肺动脉平滑肌细胞钾通道活性.中华结核和呼吸杂志，1998，21：681-685.
4 Trudeau MC, Warmke JW, Genetzky B, et al. HERG, a human inward rectifier in the voltage-gated potassium channel family. Science, 1995, 269:92-95.
5 Brueggemann A, Stuehmer W, Pardo L. Mitosis-promoting factor-mediated suppression of a cloned delayed rectifier potassium channel expressed in Xenopus Oocytes. PNAS, 1997, 94:537-542.
(收稿：1998-03-24 修回：1998-12-03), http://www.100md.com