胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性的研究
作者：冀明 王爱民 于中麟
单位：100050 首都医科大学附属北京友谊医院消化科(冀明、于中麟)；解放军第252医院试验中心(王爱民)
关键词：
中华内科杂志990316 近来的研究表明恶性肿瘤在其向外浸润、转移的过程中需溶解细胞外基质，其中基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase,MMPS)发挥了重要作用。基底膜Ⅳ型胶原是细胞外基质的重要成份，MMPS对Ⅳ型胶原的降解在肿瘤进展中至关重要。为此，我们研究了胃癌患者血清IV型胶原降解酶活性，并对其与转移的关系进行了研究，现将结果报道如下。
一、对象与方法
1.研究对象：胃癌患者113例，男84例，女29例，年龄(58.0±11.9)岁；诊断均经病理证实。胃溃疡患者58例，男43例，女15例，年龄(51.7±9.8)岁；为胃镜下诊断，病理检查除外癌变。正常对照40例，男28例，女12例，年龄(62.3±8.0)岁，为健康体检者。所有受试者晨起抽静脉血，离心后取血清-30℃保存待检。
, 百拇医药
2.主要试剂：3H乙酰化标记的Ⅳ型胶原：Ⅳ型胶原购自Sigma公司；参照Cawston 和Barrett[1]的方法标记；胶原中放射活性为0.83 Bq/mg。乙酰氨基苯汞为Sigma公司产品。
3.血清Ⅳ型胶原降解酶活性的测定方法：参照Liotta等[2]的方法，有所改进，简述如下：(1) 血清标本的处理：血清中的抑制剂通过3 mol/L的硫氰酸钾透析去除。(2) 酶活性的激活：将透析过的血清60 μl加入100 μl测定缓冲液中，与40 μl 5 mmol/L的乙酰氨基苯汞混合，35℃孵育2小时。(3) 降解胶原底物：将200 μl 3H标记的Ⅳ型胶原(含16.67 Bq的放射活性)与上述酶溶液混合，35℃孵育18小时。(4)活性测定：上述反应液加入三氯乙酸和鞣酸(终浓度分别为2.0%和0.1%)，4℃置30分钟；室温下15 000 g离心5分钟；取上清放入闪烁杯中，加入闪烁液5 ml，置于液体闪烁计数仪中计数。样品均重复2份。(5)对照管的设置：每份样品设一对照管，即在测定用的缓冲液中用0.05 mol/L的EDTA代替CaCl2。(6) 血清Ⅳ型胶原降解酶活性的表示方法：1单位(U)为每分钟35℃下降解胶原1 mg/L。
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4.统计处理方法：检测结果以
±s表示；组间比较用单因素方差分析；血清Ⅳ型胶原降解酶活性与肿瘤大小、癌胚抗原(CEA)、CA199、CA125间行相关分析。
二、结果
1.胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性：从表1可见胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性显著高于胃溃疡组和正常对照组(P值均<0.001)。胃癌患者男性与女性间无明显差异(P值>0.05)。各年龄段者间差异亦无显著性(P值均>0.05)。
表1 各组患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性 组别
例数
Ⅳ型胶原降解酶活性(mU)
正常对照组
, 百拇医药
40
279.5±36.0
胃溃疡组
58
283.1±26.3
胃癌无转移者
29
571.3±64.3*
胃癌局部浸润、转移者
59
963.1±163.5△
胃癌远处转移者
, 百拇医药
25
1 876.5±263.1△△
与正常对照及胃溃疡组相比*P<0.001；与无转移者相比△P<0.001；与局部浸润、转移者相比△△P<0.001 2.胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性与肿瘤浸润、转移的关系：113例胃癌患者中无转移者29例；局部浸润转移者59例(包括局部淋巴结转移和侵入局部脏器者)；远处转移者25例(包括肝、肺、脑、盆腔、腹腔广泛转移者)；所有远处转移者均有局部浸润、转移。从表1中可见，局部浸润、转移者酶活性明显高于无转移者(P<0.001)；远处转移者较局部浸润、转移者酶活性又有显著升高(P<0.001)。
3.胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性与肿瘤大小、CEA、CA199、CA125的关系：相关分析表明，胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性与肿瘤大小(r=0.171,n=78,P>0.05)、CEA(r=-0.080,n=87,P>0.05)、CA199(r=0.103,n=91,P>0.05)、CA125(r=-0.134,n=95,P>0.05)间均无相关性。
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讨论 近来的研究表明肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用在肿瘤浸润、转移中至关重要。肿瘤细胞通过已存在的或新形成的结合位点与细胞外基质结合，进而溶解细胞外基质，最后经细胞外基质的缺损处向外扩散。在上述过程中MMPS发挥了重要作用[3]。 MMPS是一组能降解细胞外基质成份的重要的蛋白分解酶，迄今已发现有十余种MMPS。其中一类为Ⅳ型胶原酶/明胶酶类，包括分子量72 000和92 000的Ⅳ型胶原酶/明胶酶。它们可降解基底膜(Ⅳ型)胶原和变性的间质胶原(明胶)。基底膜的主要成份是Ⅳ型胶原，对基底膜的溶解是肿瘤浸润、转移的起始。因此，Ⅳ型胶原酶在肿瘤浸润、转移中发挥着重要作用。既往的研究已证实了Ⅳ型胶原酶与肿瘤的关系[4]。 在胃癌的研究方面，Otani[5]的研究表明胃癌组织的Ⅳ型胶原酶活性升高，且与肿瘤的浸润、转移有关。对胃癌患者血清Ⅳ型胶原酶活性的研究尚甚少。我们以3H标记的Ⅳ型胶原为底物，研究了胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性(包括分子量72 000和92 000的2种Ⅳ型胶原酶/明胶酶活性)。结果表明：胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性显著高于胃溃疡患者及正常对照者；发生局部淋巴结转移或累及邻近脏器者酶活性高于无转移者；出现远处转移者酶活性显著高于局部浸润、转移者。这表明Ⅳ型胶原降解酶参与了胃癌的浸润、转移。胃癌进展中Ⅳ型胶原降解酶活性升高的机制目前尚不清楚，但血清Ⅳ型胶原降解酶活性测定作为一项无创性指标预示预后可能有一定的临床意义。
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参考文献
1 Cawston TE, Barrett AJ. A rapid and reproducible assay for collagenase using [1-14c] acetylated collagen. Anal Biochem, 1979,99：340-345.
2 Liotta LA, Tryggvason K, Garbisa S, et al. Metastatic potential correlate with enzymatic degradation of basement membrane collagen. Nature, 1980,284：67-68.
3 Ray JM, Stetler E, Stevenson WG. The role of matrix metalloproteases and their inhibitors in turnour invasion, metastasis and angiogenesis. Eur Respir J, 1994,7：2062-2072.
, 百拇医药
4 Canete Solar R, Litzky L, Lubensky I, et al. Localization of the 92 kd gelatinase mRNA in squamous cell and adenocarcinomas of the lung using in situ hybridization. Am J Pathol, 1994,144：518-527.
5 Otani Y. The collagenase activities, interstitial collagenase and type Ⅳ collagenase in human stomach cancer: with special reference to local spreading and lymph node metastasis. Keio J Med, 1990,39：159-167.
(收稿：1998-10-19 修回：1998-12-23), http://www.100md.com
单位：100050 首都医科大学附属北京友谊医院消化科(冀明、于中麟)；解放军第252医院试验中心(王爱民)
关键词：
中华内科杂志990316 近来的研究表明恶性肿瘤在其向外浸润、转移的过程中需溶解细胞外基质，其中基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinase,MMPS)发挥了重要作用。基底膜Ⅳ型胶原是细胞外基质的重要成份，MMPS对Ⅳ型胶原的降解在肿瘤进展中至关重要。为此，我们研究了胃癌患者血清IV型胶原降解酶活性，并对其与转移的关系进行了研究，现将结果报道如下。
一、对象与方法
1.研究对象：胃癌患者113例，男84例，女29例，年龄(58.0±11.9)岁；诊断均经病理证实。胃溃疡患者58例，男43例，女15例，年龄(51.7±9.8)岁；为胃镜下诊断，病理检查除外癌变。正常对照40例，男28例，女12例，年龄(62.3±8.0)岁，为健康体检者。所有受试者晨起抽静脉血，离心后取血清-30℃保存待检。
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2.主要试剂：3H乙酰化标记的Ⅳ型胶原：Ⅳ型胶原购自Sigma公司；参照Cawston 和Barrett[1]的方法标记；胶原中放射活性为0.83 Bq/mg。乙酰氨基苯汞为Sigma公司产品。
3.血清Ⅳ型胶原降解酶活性的测定方法：参照Liotta等[2]的方法，有所改进，简述如下：(1) 血清标本的处理：血清中的抑制剂通过3 mol/L的硫氰酸钾透析去除。(2) 酶活性的激活：将透析过的血清60 μl加入100 μl测定缓冲液中，与40 μl 5 mmol/L的乙酰氨基苯汞混合，35℃孵育2小时。(3) 降解胶原底物：将200 μl 3H标记的Ⅳ型胶原(含16.67 Bq的放射活性)与上述酶溶液混合，35℃孵育18小时。(4)活性测定：上述反应液加入三氯乙酸和鞣酸(终浓度分别为2.0%和0.1%)，4℃置30分钟；室温下15 000 g离心5分钟；取上清放入闪烁杯中，加入闪烁液5 ml，置于液体闪烁计数仪中计数。样品均重复2份。(5)对照管的设置：每份样品设一对照管，即在测定用的缓冲液中用0.05 mol/L的EDTA代替CaCl2。(6) 血清Ⅳ型胶原降解酶活性的表示方法：1单位(U)为每分钟35℃下降解胶原1 mg/L。
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4.统计处理方法：检测结果以
±s表示；组间比较用单因素方差分析；血清Ⅳ型胶原降解酶活性与肿瘤大小、癌胚抗原(CEA)、CA199、CA125间行相关分析。二、结果
1.胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性：从表1可见胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性显著高于胃溃疡组和正常对照组(P值均<0.001)。胃癌患者男性与女性间无明显差异(P值>0.05)。各年龄段者间差异亦无显著性(P值均>0.05)。
表1 各组患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性 组别
例数
Ⅳ型胶原降解酶活性(mU)
正常对照组
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40
279.5±36.0
胃溃疡组
58
283.1±26.3
胃癌无转移者
29
571.3±64.3*
胃癌局部浸润、转移者
59
963.1±163.5△
胃癌远处转移者
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25
1 876.5±263.1△△
与正常对照及胃溃疡组相比*P<0.001；与无转移者相比△P<0.001；与局部浸润、转移者相比△△P<0.001 2.胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性与肿瘤浸润、转移的关系：113例胃癌患者中无转移者29例；局部浸润转移者59例(包括局部淋巴结转移和侵入局部脏器者)；远处转移者25例(包括肝、肺、脑、盆腔、腹腔广泛转移者)；所有远处转移者均有局部浸润、转移。从表1中可见，局部浸润、转移者酶活性明显高于无转移者(P<0.001)；远处转移者较局部浸润、转移者酶活性又有显著升高(P<0.001)。
3.胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性与肿瘤大小、CEA、CA199、CA125的关系：相关分析表明，胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性与肿瘤大小(r=0.171,n=78,P>0.05)、CEA(r=-0.080,n=87,P>0.05)、CA199(r=0.103,n=91,P>0.05)、CA125(r=-0.134,n=95,P>0.05)间均无相关性。
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讨论 近来的研究表明肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用在肿瘤浸润、转移中至关重要。肿瘤细胞通过已存在的或新形成的结合位点与细胞外基质结合，进而溶解细胞外基质，最后经细胞外基质的缺损处向外扩散。在上述过程中MMPS发挥了重要作用[3]。 MMPS是一组能降解细胞外基质成份的重要的蛋白分解酶，迄今已发现有十余种MMPS。其中一类为Ⅳ型胶原酶/明胶酶类，包括分子量72 000和92 000的Ⅳ型胶原酶/明胶酶。它们可降解基底膜(Ⅳ型)胶原和变性的间质胶原(明胶)。基底膜的主要成份是Ⅳ型胶原，对基底膜的溶解是肿瘤浸润、转移的起始。因此，Ⅳ型胶原酶在肿瘤浸润、转移中发挥着重要作用。既往的研究已证实了Ⅳ型胶原酶与肿瘤的关系[4]。 在胃癌的研究方面，Otani[5]的研究表明胃癌组织的Ⅳ型胶原酶活性升高，且与肿瘤的浸润、转移有关。对胃癌患者血清Ⅳ型胶原酶活性的研究尚甚少。我们以3H标记的Ⅳ型胶原为底物，研究了胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性(包括分子量72 000和92 000的2种Ⅳ型胶原酶/明胶酶活性)。结果表明：胃癌患者血清Ⅳ型胶原降解酶活性显著高于胃溃疡患者及正常对照者；发生局部淋巴结转移或累及邻近脏器者酶活性高于无转移者；出现远处转移者酶活性显著高于局部浸润、转移者。这表明Ⅳ型胶原降解酶参与了胃癌的浸润、转移。胃癌进展中Ⅳ型胶原降解酶活性升高的机制目前尚不清楚，但血清Ⅳ型胶原降解酶活性测定作为一项无创性指标预示预后可能有一定的临床意义。
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参考文献
1 Cawston TE, Barrett AJ. A rapid and reproducible assay for collagenase using [1-14c] acetylated collagen. Anal Biochem, 1979,99：340-345.
2 Liotta LA, Tryggvason K, Garbisa S, et al. Metastatic potential correlate with enzymatic degradation of basement membrane collagen. Nature, 1980,284：67-68.
3 Ray JM, Stetler E, Stevenson WG. The role of matrix metalloproteases and their inhibitors in turnour invasion, metastasis and angiogenesis. Eur Respir J, 1994,7：2062-2072.
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4 Canete Solar R, Litzky L, Lubensky I, et al. Localization of the 92 kd gelatinase mRNA in squamous cell and adenocarcinomas of the lung using in situ hybridization. Am J Pathol, 1994,144：518-527.
5 Otani Y. The collagenase activities, interstitial collagenase and type Ⅳ collagenase in human stomach cancer: with special reference to local spreading and lymph node metastasis. Keio J Med, 1990,39：159-167.
(收稿：1998-10-19 修回：1998-12-23), http://www.100md.com