胰淀素对优降糖刺激大鼠胰岛素分泌作用的影响及其机制
作者：朱铁虹 尹潍 张卫华 高淑伟 畅继武
单位：300052 天津医科大学总医院内分泌科、天津内分泌研究所
关键词：格列本脲；胰岛；胰岛素；胰淀素
中华内科杂志990410 【摘要】 目的 研究胰淀素对磺脲类降糖药刺激大鼠胰岛细胞分泌胰岛素作用的影响和机制。方法 用放免和荧光方法分别检测经不同浓度胰淀素温育后再行优降糖刺激试验的胰岛细胞胰岛素分泌量、细胞内Ca2+含量。结果 在胰淀素5 μmol/L、10 μmol/L组中，3 nmol/L优降糖刺激下的胰岛素分泌量分别为(3.8±1.0) μg/L、(2.1±1.0) μg/L，均比对照组(4.9±0.9) μg/L低(t=2.313，P<0.05；t=5.887，P<0.01)；细胞内Ca2+含量为(270±15) nmol/L、(130±15) nmol/L，均显著低于对照组(330±18) nmol/L，并呈剂量相关性(t=7.243，P<0.01；t=24.143，P<0.01)。结论 高浓度的胰淀素抑制优降糖刺激胰岛β细胞内Ca2+浓度增加可能是胰岛素分泌减少的机制之一。
, 百拇医药
The effect of upon the stimulating action of glyburide in the islet cell secretion of insulin and its mechanism
ZHU Tiehong, YIN Wei, ZHANG Weihua, et al. Department of Endocrinology, The General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin Institute of Endocrinology, Tianjin 300052
【Abstract】 Objective To study the effect and mechanism of amylin upon oral sulfonylurea drugs and its action to stimulate the islet cell secretion of insulin in rats. Methods Radioimmunogical and fluorescence methods were used to determine the amount of insulin secretion as well as the content of intracellular Ca2+ of the rat islets incubated with amylin in different concentrations and followed by glyburide stimulation test. Results In amylin concentrations of 5 μmol/L and 10 μmol/L, 3 nmol/L glyburide decreased insulin release volume, being (3.8±1.0) μg/L and (2.1±1.0) μg/L as compare with (4.9±0.9) μg/L of the control group (t=2.313, P<0.05; t=5.887, P<0.01). Intracellular Ca2+ content in the two concentrations was (270±15) nmol/L and (130±15) nmol/L, being markedly decreased as compared with (330±18) nmol/L of the control group. The changes were dosage related (t=7.243, P<0.01; t=24.143, P<0.01). Conclusion High concentration of amylin is resposible for the prevention of the rise of Ca2+ inside in the islet β-cell acted upon by sulfonylurea drugs, this may be one of the mechanisms that bring about the decreased release of insulin.
, 百拇医药
【Key words】 Glyburide Islets of langerhans Insulin Amylin
自50年代初磺脲类降糖药(sulfonglurea)用于临床以来，每年约有5%～10%接受其治疗的糖尿病患者产生药物失效[1]，其发生原因及机制还未明确，对此学者们从不同角度进行了研究，其中有关胰岛β细胞淀粉样蛋白沉积导致胰岛素分泌障碍，使磺脲类降糖药继发失效的学说备受关注[1，2]。本世纪初发现，Ⅱ型糖尿病患者的胰岛存在淀粉样变性，其中90%患者的病理标本中发现胰岛淀粉样蛋白沉积，且沉积量与糖代谢紊乱程度呈正相关。80年代后期从中提取分离出相对分子质量为3 850的37肽物质，被命名为胰淀素(amylin)，又称胰岛淀粉样多肽或糖尿病相关肽。正常情况下胰淀素与胰岛素共同存在于胰岛β细胞分泌囊泡中，在生理量葡萄糖刺激下两者同步分泌，胰淀素的生理功能尚不完全清楚，但已发现在高糖刺激下其分泌量远远超过胰岛素，局部胰淀素浓度增高成为胰岛内淀粉样蛋白形成的前提[3，4]，有报道高浓度胰淀素抑制大鼠胰岛细胞分泌胰岛素，使磺脲类促胰岛细胞分泌胰岛素作用减弱[5，6]，因此认为胰淀素分泌异常是导致胰岛β细胞分泌功能障碍、磺脲类药物继发失效的原因之一[1]。我们试图从细胞水平探讨胰淀素对磺脲类降糖药作用的影响及机制。
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材料与方法
一、主要试剂
胰淀素标准品、胰蛋白酶、Ⅴ型胶原酶、RPMI-1640培养液、Fura-2乙酰羟甲酯(Fura-2/Am)等均购自Sigma公司，优降糖标准品由中国医药研究院赠送。
二、胰岛细胞制备和培养
随机取3日龄的健康SD大鼠乳鼠，断颈髓后固定体位，无菌取出胰腺，清除胰外组织，置Hank液洗涤3次，剪成0.5 mm3碎片，用0.2%胰蛋白酶和2 g/L Ⅴ型胶原酶，在37℃水浴中消化分离满意后，冷Hank液终止消化，收集胰岛细胞接种在RPMI-1640培养液中，在体积分数为5%的CO2 37℃培养箱培养，15～20小时后观察细胞生长状态。确认生长良好后，转皿继续培养48～72小时后，用碘乙酸2.5 μg/L处理5～6小时，以去除纤维细胞。酌情重复处理至纤维细胞消失。胰岛细胞充分铺开形成良好的细胞单层(图1，2)。免疫组化染色可见胰岛β细胞占66%(图3)。生物学功能鉴定后表明，培养2周内的胰岛细胞对高糖及优降糖刺激具有良好的反应能力，各项参数表明胰岛细胞功能和形态良好，较成功地提供了实验用胰岛细胞。
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图1 培养第7天的贴壁胰岛细胞 ×100
图2 胰岛素颗粒电镜 ×5 000
图3 胰岛素抗体标记的胰岛β细胞涂片 ABC染色×400
三、胰岛素浓度测定
将上述方法所获胰岛细胞分成5组(表1)，每组8皿，每皿细胞数为1×106，将每组培养液离心后取上清测胰岛素作为基础值，然后用含0.1%白明胶的KRB缓冲液洗涤细胞2次，再用其孵育15分钟后弃上清。将第1、2组作为对照组，第3～5组作为实验组分别加入浓度为1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L胰淀素孵育30分钟后，再加入16.7 mmol/L葡萄糖、3 nmol/L优降糖孵育2小时后取上清液，用放免法测胰岛素含量。
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表1 胰淀素对优降糖刺激大鼠胰岛细胞
胰岛素释放量和细胞内Ca2+浓度变化的影响 组 别
份数
胰岛素释
放量(μg/L)
细胞内Ca2+
含量(nmol/L)
1组 葡萄糖16.7 mmol/L
8
1.75±0.42
135±10
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2组 葡萄糖16.7 mmol/L+
优降糖3 nmol/L
8
4.90±0.90
330±18
3组 葡萄糖16.7 mmol/L+
优降糖3 nmol/L+
胰淀素1 μmol/L
8
4.70±0.80
320±20
4组 葡萄糖16.7 mmol/L+
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优降糖3 nmol/L+
胰淀素5 μmol/L
8
3.80±1.00△
270±15*
5组 葡萄糖16.7 mmol/L+
优降糖3 nmol/L+
胰淀素10 μmol/L
8
2.10±1.00△△
130±15**
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注：与2组比较，△t=2.313，P<0.05；△△t=5.887，P<0.01；
* t=7.243，P<0.01；**t=24.143，P<0.01
四、细胞内Ca2+测定
将胰岛细胞用含0.1%白明胶，含Ca2+ 1.5 mmol/L的KRB液制成细胞悬液，细胞数为每皿1×106/ml，每皿加入Fura-2/Am，使终浓度为5 mmol/L，在37℃水浴震荡孵育40分钟，再用不含Fura-2/Am的KRB液洗涤3遍，以去除细胞外的Fura-2/Am，然后用锥虫蓝染色，确定细胞存活率>90%以上者，再在不同实验条件下测荧光值F(为细胞内Fura-2与Ca2+结合值)。随后加入Triton X-100(终浓度为0.1%)以破坏细胞膜，使胞内剩余的Fura-2完全释放到细胞外液中，与细胞外钙结合，测荧光值Fmax(为Fura-2与细胞内外Ca2+结合之最大值)，最后加入EGTA贮存液(使终浓度为3.5 nmol/L)，此时Ca2+全部与EGTA鳌合，Fura-2游离出来，再测荧光值Fmin(为Fura-2与Ca2+结合之最小值)，将以上数据代入以下公式：(F-Fmin)÷(Fmax-F)×常数2 240 nmol/L=细胞内Ca2+浓度(实验要尽快完成，以防进入细胞内的Fura-2外漏使细胞内Ca2+测值偏高)。
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五、细胞内cAMP聚积量测定
胰岛细胞内cAMP提取参照Felix等方法加以改良，将实验用胰岛细胞分别与所需要的实验材料孵育后(与以上组别相同)低温离心弃上清，立即加入6%冷三氯醋酸搅匀以沉淀细胞蛋白，4℃过夜离心取上清，用20% NaOH中和pH后，真空干燥-20℃保存备放免测cAMP。
六、统计学处理
组间比较用t检验。
结果
基础培养液中胰岛素浓度、细胞内Ca2+含量以及cAMP聚积量的测定值5个组间差异均无显著性。加入3 nmol/L优降糖，胰岛素释放量是对照1组的2.8倍，细胞内Ca2+含量是对照1组的2.4倍，cAMP含量与对照组相比差异无显著性。预先用不同浓度胰淀素孵育的胰岛细胞再行优降糖刺激试验数据显示：胰岛素释放量对照2组与胰淀素1 μmol/L组相比无统计学差异；胰淀素5 μmol/L组降低(t=2.313，P<0.05)；胰淀素10 μmol/L组明显降低(t=5.887，P<0.01)。细胞内Ca2+含量与对照2组相比，胰淀素1 μmol/L组细胞内Ca2+含量变化无统计学意义；5 μmol/L组细胞内Ca2+含量降低(t=7.243，P<0.01)；10 μmol/L组细胞内Ca2+含量降低幅度增大(t=24.143，P<0.01)，见表1。
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本实验结果显示：优降糖刺激胰岛素分泌增多与细胞内Ca2+含量增加一致，cAMP聚积量无变化，预先用胰淀素孵育过的胰岛细胞与对照组相比，胰岛素释放量与细胞内Ca2+含量均降低并呈剂量相关性。
讨论
磺脲类降糖药主要是与胰岛β细胞膜上的特异性受体结合而发挥作用的，一般认为药物与受体结合后通过影响β细胞膜电位，即首先关闭ATP敏感性钾通道，减少钾外流使细胞去极化，继而开放电压依赖性Ca2+通道，触发Ca2+内流，当细胞内Ca2+浓度上升后，通过一系列Ca2+依赖性磷酸化反应发生生理效应，触发胞吐过程[7，8]。本研究从胰淀素对优降糖刺激胰岛细胞胰岛素释放量及对细胞内Ca2+ cAMP浓度变化的影响，探讨胰淀素对磺脲类降糖药作用的影响。
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Fura-2是一种能特异结合Ca2+的荧光指示剂，在未与Ca2+结合时其激发光谱在380 nm，与Ca2+结合后激发光谱移至340 nm。Fura-2不能透过细胞膜，其乙酰羟甲酯化合物即Fura-2/Am呈脂溶性才可以透过细胞膜，进入细胞后被胞内特异性酯酶作用，脱去乙酰羟甲酯与胞内Ca2+结合，在340 nmol/L处测其荧光强度。实验中所测各数据代入公式计算出细胞内Ca2+含量，从而比较准确地、动态地观察细胞内Ca2+浓度的变化[9]。
本实验用3 nmol/L优降糖刺激胰岛细胞，胰岛素释放量和细胞内Ca2+浓度分别是对照1组的2.8和2.4倍，说明优降糖刺激胰岛β细胞释放胰岛素和增加细胞内Ca2+浓度相一致，细胞内cAMP聚积量未发生变化，虽不否认cAMP在其中的作用，但可以说明，优降糖作用胰岛细胞在不伴有cAMP水平变化的情况下，仅通过开放Ca2+通道，增加细胞内Ca2+浓度就可以刺激胰岛素释放[8]。当用不同浓度胰淀素预先孵育胰岛细胞，再用3 nmol/L优降糖刺激胰岛细胞结果显示，低浓度胰淀素(1 μmol/L)环境下，优降糖刺激所导致的胰岛细胞内Ca2+增加不受抑制，胰岛素释放量不受影响。但胰淀素浓度增加达5 μmol/L时，细胞内Ca2+浓度显著降低，胰岛素释放量也显著减少且有剂量相关性。同我们观察到的经高浓度胰淀素温育的大鼠胰岛细胞，高糖刺激的胰岛素释放量减少和细胞内Ca2+含量下降同步的现象相似。这一结果提示，高浓度的胰淀素具有抑制优降糖刺激胰岛β细胞Ca2+内流和释出胰岛素的作用，推测Ⅱ型糖尿病患者随着病程延长，出现磺脲类药物继发失效原因之一可能有胰淀素的参与：其一，是高糖血症引起的胰淀素过度分泌，使局部浓度增高阻遏了优降糖作用的胰岛β细胞Ca2+内流，胰岛素释放系统因之不能启动；其二，过多堆积的胰岛淀粉样蛋白包裹破坏了胰岛β细胞结构，影响了β细胞膜上的与磺脲类药物结合的受体，最终都使胰岛素分泌减少，磺脲类药物继发失效。胰岛β细胞功能耗竭的机制之一可能是淀粉样蛋白堆积[1，2]。
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如何进一步搞清胰淀素异常分泌而致胰岛淀粉样蛋白堆积与磺脲类降糖药作用的关系，如何防止胰淀素过量产生和沉积，改善胰岛β细胞Ca2+内流将有待进一步研究。
参考文献
1 Genuth S. Management of the adult onset diabetic with sulfonylurea drug failure. Endocrinol Metab Clin North Am, 1992,21：351-370.
2 何戎华.磺脲类降糖药治疗失效的研究进展.国外医学内分泌学分册，1995，15：81-83.
3 Lukinius A, Wilander E, Westermark GT, et al. Co-localization of islet amyloid polypeptide and insulin in the beta-cell secretory granules of the human pancretic islets. Diabetologia, 1989,32：240-244.
, 百拇医药
4 Clark A, Leiwis CE, Willis AC, et al. Islet amyloid fomed from diabetes associated peptide may be pathogenic in type Ⅱ diabetes. Lancet, 1987,2：231-234.
5 黄丹珊.胰淀素对磺脲类口服降糖药的抑制效应.全国首届内分泌专业中青年论文交流会汇编.北京，1994.194-196.
6 钱玉宁，贾培红.胰淀素对大鼠糖代谢和胰岛素分泌功能的影响.中国糖尿病杂志，1993，1：21-24.
7 Rajan AS, Aguilar-Bryan L, Nelson DA, et al. Ion channels and insulin secretion. Diabetes Care, 1990,13：340-363.
8 向红丁.磺脲类降糖药对HIT细胞胰岛素分泌刺激作用的分子机制研究.中国糖尿病杂志，1994，2：34-37.
9 Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicator with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem, 1985,260：3440-3450.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-09-10), 百拇医药
单位：300052 天津医科大学总医院内分泌科、天津内分泌研究所
关键词：格列本脲；胰岛；胰岛素；胰淀素
中华内科杂志990410 【摘要】 目的 研究胰淀素对磺脲类降糖药刺激大鼠胰岛细胞分泌胰岛素作用的影响和机制。方法 用放免和荧光方法分别检测经不同浓度胰淀素温育后再行优降糖刺激试验的胰岛细胞胰岛素分泌量、细胞内Ca2+含量。结果 在胰淀素5 μmol/L、10 μmol/L组中，3 nmol/L优降糖刺激下的胰岛素分泌量分别为(3.8±1.0) μg/L、(2.1±1.0) μg/L，均比对照组(4.9±0.9) μg/L低(t=2.313，P<0.05；t=5.887，P<0.01)；细胞内Ca2+含量为(270±15) nmol/L、(130±15) nmol/L，均显著低于对照组(330±18) nmol/L，并呈剂量相关性(t=7.243，P<0.01；t=24.143，P<0.01)。结论 高浓度的胰淀素抑制优降糖刺激胰岛β细胞内Ca2+浓度增加可能是胰岛素分泌减少的机制之一。
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The effect of upon the stimulating action of glyburide in the islet cell secretion of insulin and its mechanism
ZHU Tiehong, YIN Wei, ZHANG Weihua, et al. Department of Endocrinology, The General Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin Institute of Endocrinology, Tianjin 300052
【Abstract】 Objective To study the effect and mechanism of amylin upon oral sulfonylurea drugs and its action to stimulate the islet cell secretion of insulin in rats. Methods Radioimmunogical and fluorescence methods were used to determine the amount of insulin secretion as well as the content of intracellular Ca2+ of the rat islets incubated with amylin in different concentrations and followed by glyburide stimulation test. Results In amylin concentrations of 5 μmol/L and 10 μmol/L, 3 nmol/L glyburide decreased insulin release volume, being (3.8±1.0) μg/L and (2.1±1.0) μg/L as compare with (4.9±0.9) μg/L of the control group (t=2.313, P<0.05; t=5.887, P<0.01). Intracellular Ca2+ content in the two concentrations was (270±15) nmol/L and (130±15) nmol/L, being markedly decreased as compared with (330±18) nmol/L of the control group. The changes were dosage related (t=7.243, P<0.01; t=24.143, P<0.01). Conclusion High concentration of amylin is resposible for the prevention of the rise of Ca2+ inside in the islet β-cell acted upon by sulfonylurea drugs, this may be one of the mechanisms that bring about the decreased release of insulin.
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【Key words】 Glyburide Islets of langerhans Insulin Amylin
自50年代初磺脲类降糖药(sulfonglurea)用于临床以来，每年约有5%～10%接受其治疗的糖尿病患者产生药物失效[1]，其发生原因及机制还未明确，对此学者们从不同角度进行了研究，其中有关胰岛β细胞淀粉样蛋白沉积导致胰岛素分泌障碍，使磺脲类降糖药继发失效的学说备受关注[1，2]。本世纪初发现，Ⅱ型糖尿病患者的胰岛存在淀粉样变性，其中90%患者的病理标本中发现胰岛淀粉样蛋白沉积，且沉积量与糖代谢紊乱程度呈正相关。80年代后期从中提取分离出相对分子质量为3 850的37肽物质，被命名为胰淀素(amylin)，又称胰岛淀粉样多肽或糖尿病相关肽。正常情况下胰淀素与胰岛素共同存在于胰岛β细胞分泌囊泡中，在生理量葡萄糖刺激下两者同步分泌，胰淀素的生理功能尚不完全清楚，但已发现在高糖刺激下其分泌量远远超过胰岛素，局部胰淀素浓度增高成为胰岛内淀粉样蛋白形成的前提[3，4]，有报道高浓度胰淀素抑制大鼠胰岛细胞分泌胰岛素，使磺脲类促胰岛细胞分泌胰岛素作用减弱[5，6]，因此认为胰淀素分泌异常是导致胰岛β细胞分泌功能障碍、磺脲类药物继发失效的原因之一[1]。我们试图从细胞水平探讨胰淀素对磺脲类降糖药作用的影响及机制。
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材料与方法
一、主要试剂
胰淀素标准品、胰蛋白酶、Ⅴ型胶原酶、RPMI-1640培养液、Fura-2乙酰羟甲酯(Fura-2/Am)等均购自Sigma公司，优降糖标准品由中国医药研究院赠送。
二、胰岛细胞制备和培养
随机取3日龄的健康SD大鼠乳鼠，断颈髓后固定体位，无菌取出胰腺，清除胰外组织，置Hank液洗涤3次，剪成0.5 mm3碎片，用0.2%胰蛋白酶和2 g/L Ⅴ型胶原酶，在37℃水浴中消化分离满意后，冷Hank液终止消化，收集胰岛细胞接种在RPMI-1640培养液中，在体积分数为5%的CO2 37℃培养箱培养，15～20小时后观察细胞生长状态。确认生长良好后，转皿继续培养48～72小时后，用碘乙酸2.5 μg/L处理5～6小时，以去除纤维细胞。酌情重复处理至纤维细胞消失。胰岛细胞充分铺开形成良好的细胞单层(图1，2)。免疫组化染色可见胰岛β细胞占66%(图3)。生物学功能鉴定后表明，培养2周内的胰岛细胞对高糖及优降糖刺激具有良好的反应能力，各项参数表明胰岛细胞功能和形态良好，较成功地提供了实验用胰岛细胞。
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图1 培养第7天的贴壁胰岛细胞 ×100
图2 胰岛素颗粒电镜 ×5 000
图3 胰岛素抗体标记的胰岛β细胞涂片 ABC染色×400
三、胰岛素浓度测定
将上述方法所获胰岛细胞分成5组(表1)，每组8皿，每皿细胞数为1×106，将每组培养液离心后取上清测胰岛素作为基础值，然后用含0.1%白明胶的KRB缓冲液洗涤细胞2次，再用其孵育15分钟后弃上清。将第1、2组作为对照组，第3～5组作为实验组分别加入浓度为1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L胰淀素孵育30分钟后，再加入16.7 mmol/L葡萄糖、3 nmol/L优降糖孵育2小时后取上清液，用放免法测胰岛素含量。
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表1 胰淀素对优降糖刺激大鼠胰岛细胞
胰岛素释放量和细胞内Ca2+浓度变化的影响 组 别
份数
胰岛素释
放量(μg/L)
细胞内Ca2+
含量(nmol/L)
1组 葡萄糖16.7 mmol/L
8
1.75±0.42
135±10
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2组 葡萄糖16.7 mmol/L+
优降糖3 nmol/L
8
4.90±0.90
330±18
3组 葡萄糖16.7 mmol/L+
优降糖3 nmol/L+
胰淀素1 μmol/L
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4.70±0.80
320±20
4组 葡萄糖16.7 mmol/L+
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优降糖3 nmol/L+
胰淀素5 μmol/L
8
3.80±1.00△
270±15*
5组 葡萄糖16.7 mmol/L+
优降糖3 nmol/L+
胰淀素10 μmol/L
8
2.10±1.00△△
130±15**
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注：与2组比较，△t=2.313，P<0.05；△△t=5.887，P<0.01；
* t=7.243，P<0.01；**t=24.143，P<0.01
四、细胞内Ca2+测定
将胰岛细胞用含0.1%白明胶，含Ca2+ 1.5 mmol/L的KRB液制成细胞悬液，细胞数为每皿1×106/ml，每皿加入Fura-2/Am，使终浓度为5 mmol/L，在37℃水浴震荡孵育40分钟，再用不含Fura-2/Am的KRB液洗涤3遍，以去除细胞外的Fura-2/Am，然后用锥虫蓝染色，确定细胞存活率>90%以上者，再在不同实验条件下测荧光值F(为细胞内Fura-2与Ca2+结合值)。随后加入Triton X-100(终浓度为0.1%)以破坏细胞膜，使胞内剩余的Fura-2完全释放到细胞外液中，与细胞外钙结合，测荧光值Fmax(为Fura-2与细胞内外Ca2+结合之最大值)，最后加入EGTA贮存液(使终浓度为3.5 nmol/L)，此时Ca2+全部与EGTA鳌合，Fura-2游离出来，再测荧光值Fmin(为Fura-2与Ca2+结合之最小值)，将以上数据代入以下公式：(F-Fmin)÷(Fmax-F)×常数2 240 nmol/L=细胞内Ca2+浓度(实验要尽快完成，以防进入细胞内的Fura-2外漏使细胞内Ca2+测值偏高)。
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五、细胞内cAMP聚积量测定
胰岛细胞内cAMP提取参照Felix等方法加以改良，将实验用胰岛细胞分别与所需要的实验材料孵育后(与以上组别相同)低温离心弃上清，立即加入6%冷三氯醋酸搅匀以沉淀细胞蛋白，4℃过夜离心取上清，用20% NaOH中和pH后，真空干燥-20℃保存备放免测cAMP。
六、统计学处理
组间比较用t检验。
结果
基础培养液中胰岛素浓度、细胞内Ca2+含量以及cAMP聚积量的测定值5个组间差异均无显著性。加入3 nmol/L优降糖，胰岛素释放量是对照1组的2.8倍，细胞内Ca2+含量是对照1组的2.4倍，cAMP含量与对照组相比差异无显著性。预先用不同浓度胰淀素孵育的胰岛细胞再行优降糖刺激试验数据显示：胰岛素释放量对照2组与胰淀素1 μmol/L组相比无统计学差异；胰淀素5 μmol/L组降低(t=2.313，P<0.05)；胰淀素10 μmol/L组明显降低(t=5.887，P<0.01)。细胞内Ca2+含量与对照2组相比，胰淀素1 μmol/L组细胞内Ca2+含量变化无统计学意义；5 μmol/L组细胞内Ca2+含量降低(t=7.243，P<0.01)；10 μmol/L组细胞内Ca2+含量降低幅度增大(t=24.143，P<0.01)，见表1。
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本实验结果显示：优降糖刺激胰岛素分泌增多与细胞内Ca2+含量增加一致，cAMP聚积量无变化，预先用胰淀素孵育过的胰岛细胞与对照组相比，胰岛素释放量与细胞内Ca2+含量均降低并呈剂量相关性。
讨论
磺脲类降糖药主要是与胰岛β细胞膜上的特异性受体结合而发挥作用的，一般认为药物与受体结合后通过影响β细胞膜电位，即首先关闭ATP敏感性钾通道，减少钾外流使细胞去极化，继而开放电压依赖性Ca2+通道，触发Ca2+内流，当细胞内Ca2+浓度上升后，通过一系列Ca2+依赖性磷酸化反应发生生理效应，触发胞吐过程[7，8]。本研究从胰淀素对优降糖刺激胰岛细胞胰岛素释放量及对细胞内Ca2+ cAMP浓度变化的影响，探讨胰淀素对磺脲类降糖药作用的影响。
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Fura-2是一种能特异结合Ca2+的荧光指示剂，在未与Ca2+结合时其激发光谱在380 nm，与Ca2+结合后激发光谱移至340 nm。Fura-2不能透过细胞膜，其乙酰羟甲酯化合物即Fura-2/Am呈脂溶性才可以透过细胞膜，进入细胞后被胞内特异性酯酶作用，脱去乙酰羟甲酯与胞内Ca2+结合，在340 nmol/L处测其荧光强度。实验中所测各数据代入公式计算出细胞内Ca2+含量，从而比较准确地、动态地观察细胞内Ca2+浓度的变化[9]。
本实验用3 nmol/L优降糖刺激胰岛细胞，胰岛素释放量和细胞内Ca2+浓度分别是对照1组的2.8和2.4倍，说明优降糖刺激胰岛β细胞释放胰岛素和增加细胞内Ca2+浓度相一致，细胞内cAMP聚积量未发生变化，虽不否认cAMP在其中的作用，但可以说明，优降糖作用胰岛细胞在不伴有cAMP水平变化的情况下，仅通过开放Ca2+通道，增加细胞内Ca2+浓度就可以刺激胰岛素释放[8]。当用不同浓度胰淀素预先孵育胰岛细胞，再用3 nmol/L优降糖刺激胰岛细胞结果显示，低浓度胰淀素(1 μmol/L)环境下，优降糖刺激所导致的胰岛细胞内Ca2+增加不受抑制，胰岛素释放量不受影响。但胰淀素浓度增加达5 μmol/L时，细胞内Ca2+浓度显著降低，胰岛素释放量也显著减少且有剂量相关性。同我们观察到的经高浓度胰淀素温育的大鼠胰岛细胞，高糖刺激的胰岛素释放量减少和细胞内Ca2+含量下降同步的现象相似。这一结果提示，高浓度的胰淀素具有抑制优降糖刺激胰岛β细胞Ca2+内流和释出胰岛素的作用，推测Ⅱ型糖尿病患者随着病程延长，出现磺脲类药物继发失效原因之一可能有胰淀素的参与：其一，是高糖血症引起的胰淀素过度分泌，使局部浓度增高阻遏了优降糖作用的胰岛β细胞Ca2+内流，胰岛素释放系统因之不能启动；其二，过多堆积的胰岛淀粉样蛋白包裹破坏了胰岛β细胞结构，影响了β细胞膜上的与磺脲类药物结合的受体，最终都使胰岛素分泌减少，磺脲类药物继发失效。胰岛β细胞功能耗竭的机制之一可能是淀粉样蛋白堆积[1，2]。
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如何进一步搞清胰淀素异常分泌而致胰岛淀粉样蛋白堆积与磺脲类降糖药作用的关系，如何防止胰淀素过量产生和沉积，改善胰岛β细胞Ca2+内流将有待进一步研究。
参考文献
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9 Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicator with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem, 1985,260：3440-3450.
(收稿：1998-04-13 修回：1998-09-10), 百拇医药