聚合酶链反应法诊断中枢神经系统肠道病毒感染
作者：李爱云 陈宗波 刘庆新 孙建英
单位：李爱云、刘庆新、孙建英 256603 山东省滨州医学院附属医院神经科，陈宗波 小儿科
关键词：
中华内科杂志990819 肠道病毒(EV)是人类感染最常见的病原之一，可引起脑膜炎、脑炎和心肌炎等多种疾病。因其血清型繁多，病原诊断困难，长期以来缺乏一种快速有效的诊断方法。我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和病毒培养技术，检测无菌性脑膜炎和脑炎病人的脑脊液(CSF)中EV RNA，以探讨EV在中枢神经系统感染中的致病情况及该检测方法的有效性。
一、对象与方法
1.研究对象：为46例临床诊断为无菌性脑膜炎的住院病人，诊断标准参照参考文献[1]。年龄3～60岁，其中儿童18例。入院当天及恢复期分别收集CSF待测，所有CSF细菌培养阴性。
, 百拇医药
2.病原学检测：(1)RT-PCR检测EV RNA：采用一步法[2]提取EV RNA，逆转录合成 cDNA和PCR扩增按常规进行，扩增产物检测采用2% 琼脂糖凝胶电泳和斑点杂交(Kit由B、M公司生产)。引物和探针序列选自EV 5′高度保守区，已有实验证实所用引物和探针特异、敏感、广谱[3]。(2)EV分离及血清型鉴定：46 例急性期和21例恢复期的CSF分别接种Hela 和人胚肺细胞，分离EV后采用标准中和试验分组鉴定[4]。
二、结果
46例无菌性脑膜炎和脑炎病人急性期的CSF标本31份(67.4%)RT-PCR产物电泳和杂交 结果阳性(图1)；恢复期的CSF 只有1例阳性。急性期的CSF同时行病毒分离，14例(26.1%)阳性，共分离到6 个不同血清型， 其中埃柯病毒(Echo)2型6例，柯萨奇病毒B( CVB)2 型、 5型和Echo 6型各2例，Echo 3型和11 型各1例。恢复期的CSF病毒培养全部阴性。病毒培养阳性的14例中RT-PCR结果全部阳性(100%)，而培养阴性的32例中RT-PCR 17例阳性( 53.9%)。统计表明，RT-PCR敏感性明显高于病毒培养(χ2=12.57，P<0.01)。
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注：图中着色者为阳性
图1 46份脑脊液标本逆转录聚合酶链反应扩增产物斑点杂交结果
讨论 应用RT-PCR方法检测46 例无菌性脑膜炎 和脑炎病人CSF，发现急性期EV感染率为67.4%，恢复期仅个别阳性，与国外报道相近[5]。病毒分离共得到6个血清型，其中Echo 2型6例， 且6例中有5例分布在1997年9～10月间， 提示该地区当时有Echo 2型季节性流行。14例培养阳性者RT-PCR全部阳性，培养阴性的32 例中RT-PCR 17例阳性(53.9%)。表明RT-PCR的敏感性高于病毒培养。推测病毒培养敏感性低可能系临床标本中病毒滴度低，常规培养不能观察到病毒生长所致，但通过PCR 扩 增后则能检测到EV RNA存在。有些EV不能在单层细胞中生长亦是培养失败的原因之一[4]。
RT-PCR除敏感性高外还有以下优点：(1)快速：本实验RNA的提取到扩增产物电泳4小时内即可完成，而病毒分离需3～10天；(2)操作简便，易于临床推广应用；而病毒培养繁杂费时，得到实验结果时已无益于临床。此结果进一步表明，RT-PCR是诊断EV感染更有效的方法。
, 百拇医药
参考文献
1 赵明伦.散发性脑炎的诊断标准.见：韩仲岩，丛志强，唐盛孟,主编.神经病治疗学.上海：上海科学技术出版社，1993.83-84.
2 陈宗波， 董永绥. 一种从脑脊液中提取病毒RNA和DNA的新方法. 中华医学检验杂志，1998,21: 108-109.
3 陈宗波，董永绥，方峰，等. 应用逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒感染方法的建立. 中华儿科杂志， 1997，35：597-600.
4 Lim KA, Benyesh-Meinick M.Typing of viruses by combinations of antiserum pools: application to typing of enteroviruses (coxsackie and echo). J Immunol,1960,84:309-317.
5 Rotbart HA. Diagnosis of enteroviral meningitis with the polymerase chain reaction. J Pediatr,1990，117:85-89.
(收稿：1998-09-24 修回：1999-01-27), 百拇医药
单位：李爱云、刘庆新、孙建英 256603 山东省滨州医学院附属医院神经科，陈宗波 小儿科
关键词：
中华内科杂志990819 肠道病毒(EV)是人类感染最常见的病原之一，可引起脑膜炎、脑炎和心肌炎等多种疾病。因其血清型繁多，病原诊断困难，长期以来缺乏一种快速有效的诊断方法。我们采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和病毒培养技术，检测无菌性脑膜炎和脑炎病人的脑脊液(CSF)中EV RNA，以探讨EV在中枢神经系统感染中的致病情况及该检测方法的有效性。
一、对象与方法
1.研究对象：为46例临床诊断为无菌性脑膜炎的住院病人，诊断标准参照参考文献[1]。年龄3～60岁，其中儿童18例。入院当天及恢复期分别收集CSF待测，所有CSF细菌培养阴性。
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2.病原学检测：(1)RT-PCR检测EV RNA：采用一步法[2]提取EV RNA，逆转录合成 cDNA和PCR扩增按常规进行，扩增产物检测采用2% 琼脂糖凝胶电泳和斑点杂交(Kit由B、M公司生产)。引物和探针序列选自EV 5′高度保守区，已有实验证实所用引物和探针特异、敏感、广谱[3]。(2)EV分离及血清型鉴定：46 例急性期和21例恢复期的CSF分别接种Hela 和人胚肺细胞，分离EV后采用标准中和试验分组鉴定[4]。
二、结果
46例无菌性脑膜炎和脑炎病人急性期的CSF标本31份(67.4%)RT-PCR产物电泳和杂交 结果阳性(图1)；恢复期的CSF 只有1例阳性。急性期的CSF同时行病毒分离，14例(26.1%)阳性，共分离到6 个不同血清型， 其中埃柯病毒(Echo)2型6例，柯萨奇病毒B( CVB)2 型、 5型和Echo 6型各2例，Echo 3型和11 型各1例。恢复期的CSF病毒培养全部阴性。病毒培养阳性的14例中RT-PCR结果全部阳性(100%)，而培养阴性的32例中RT-PCR 17例阳性( 53.9%)。统计表明，RT-PCR敏感性明显高于病毒培养(χ2=12.57，P<0.01)。
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注：图中着色者为阳性
图1 46份脑脊液标本逆转录聚合酶链反应扩增产物斑点杂交结果
讨论 应用RT-PCR方法检测46 例无菌性脑膜炎 和脑炎病人CSF，发现急性期EV感染率为67.4%，恢复期仅个别阳性，与国外报道相近[5]。病毒分离共得到6个血清型，其中Echo 2型6例， 且6例中有5例分布在1997年9～10月间， 提示该地区当时有Echo 2型季节性流行。14例培养阳性者RT-PCR全部阳性，培养阴性的32 例中RT-PCR 17例阳性(53.9%)。表明RT-PCR的敏感性高于病毒培养。推测病毒培养敏感性低可能系临床标本中病毒滴度低，常规培养不能观察到病毒生长所致，但通过PCR 扩 增后则能检测到EV RNA存在。有些EV不能在单层细胞中生长亦是培养失败的原因之一[4]。
RT-PCR除敏感性高外还有以下优点：(1)快速：本实验RNA的提取到扩增产物电泳4小时内即可完成，而病毒分离需3～10天；(2)操作简便，易于临床推广应用；而病毒培养繁杂费时，得到实验结果时已无益于临床。此结果进一步表明，RT-PCR是诊断EV感染更有效的方法。
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参考文献
1 赵明伦.散发性脑炎的诊断标准.见：韩仲岩，丛志强，唐盛孟,主编.神经病治疗学.上海：上海科学技术出版社，1993.83-84.
2 陈宗波， 董永绥. 一种从脑脊液中提取病毒RNA和DNA的新方法. 中华医学检验杂志，1998,21: 108-109.
3 陈宗波，董永绥，方峰，等. 应用逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒感染方法的建立. 中华儿科杂志， 1997，35：597-600.
4 Lim KA, Benyesh-Meinick M.Typing of viruses by combinations of antiserum pools: application to typing of enteroviruses (coxsackie and echo). J Immunol,1960,84:309-317.
5 Rotbart HA. Diagnosis of enteroviral meningitis with the polymerase chain reaction. J Pediatr,1990，117:85-89.
(收稿：1998-09-24 修回：1999-01-27), 百拇医药