氟美松对急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡及Fas/Fas配体表达的影响
作者:宋勇 毛宝龄 钱桂生 王建春
单位:宋勇 210002 南京军区南京总医院呼吸内科;毛宝龄、钱桂生、王建春 第三军医大学新桥医院解放军呼吸病研究所
关键词:
中华内科杂志990818 近来的研究表明,氟美松不仅可以抑制肿瘤坏死因子(TNF)α等前炎症细胞因子的表达,而且还可以抑制肺泡上皮细胞凋亡及Fas/Fas配体(FasL)的表达[1]。本实验通过观察氟美松对急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织细胞凋亡及Fas、FasL表达的影响,探讨其在全身炎症反应及ALI中的作用机制及意义。
一、材料与方法
1.模型复制与分组:雄性Wistar大鼠78只,体重150~250 g。大鼠经1%戊巴比妥钠麻醉后,随机分成3组:(1)ALI组:静脉注射脂多糖(LPS)5 mg/kg,注射LPS后1、2、4、6、12和24小时活杀。(2)氟美松治疗组:在注射LPS 5 mg/kg同时静脉注射氟美松10 mg/kg,于注射后1、2、4、6、12和24小时活杀。(3)对照组:静脉注射生理盐水0.1ml ,于注射后6小时活杀。每个时相点为6只大鼠。活杀后取肺组织观察细胞凋亡及Fas/FasL表达。
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2.肺组织细胞凋亡原位检测采用TUNEL法,按B.M公司试剂盒提供方法稍加改进。计算5个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数,凋亡指数以凋亡细胞/100个细胞表示。按凋亡细胞占细胞总数的百分率将其分为五级:0级<2%,1级为3%~9%,2级为10%~19%,3级为20%~39%,4级>40%。
3.半定量逆转录聚合酶链反应(SqRT-PCR)参照文献[2]进行。 PCR产物的半定量采用Tiger 920G图象分析系统,结果以Fas、FasL积分光密度/相应β-actin积分光密度的比值表示。
4.免疫组织化学染色步骤参照试剂盒推荐方法进行。采用Tiger 920细胞图象分析系统分析图象。在显微镜(×200)下以相同外部条件(亮度)摄取bmp图象,每张切片摄10幅,设定灰度值为50~250。得出统计场总面积的积分光密度值,每张切片取均值。
5.统计学方法:数据以±s表示,采用t检验。
, 百拇医药
二、结果
1.三组大鼠血清TNFα的测定结果:见表1。
表1 三组大鼠血清肿瘤坏死因子α的测定结果 组 别
鼠数
(只)
肿瘤坏死因子α(μg/L, ±s)
1小时
4小时
6小时
12小时
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急性肺损伤组
18
5.56±
0.62△
4.26±
0.32△
-
2.03±
0.24△
氟美松治疗组
18
4.49±
, 百拇医药
0.21△*
3.97±
0.15△*
-
1.66±
0.24△*
对照组
6
-
-
0.06±
0.02
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-
注:-为未做 与对照组比较,△P<0.01;与同时相点急性肺损伤组比较,*P<0.01
2.三组大鼠肺组织细胞凋亡的测定结果:见表2。与ALI组相比,氟美松治疗组大鼠肺组织细胞凋亡明显减少。
表2 三组大鼠肺组织细胞凋亡的测定结果 组 别
鼠数
(只)
肺组织细胞凋亡(级)
4小时
6小时
12小时
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24小时
急性肺损伤组
18
1(0~1)
-
2(2~3)
2(2~3)
氟美松治疗组
18
0(0~1)
-
1(0~1)
1(1~1)
, 百拇医药
对照组
6
-
0(0~0)
-
-
注:-为未做
3.三组大鼠肺组织细胞凋亡相关基因mRNA的表达:见表3。SqRT-PCR结果表明,氟美松治疗组6小时时相点的Fas、FasL mRNA表达水平明显低于ALI组6小时时相点(P<0.01),与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。
表3 三组大鼠6小时时相点Fas、FasL mRNA的表达(±s) 组 别
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鼠数(只)
Fas mRNA
FasL mRNA
急性肺损伤组
6
0.90±0.12
0.73±0.05
氟美松治疗组
6
0.15±0.01*
0.04±0.01*
对照组
, 百拇医药
6
0.14±0.01
0.04±0.01
注:与急性肺损伤组比较,*P<0.01 4.三组大鼠Fas、FasL蛋白质的表达:见表4。免疫组化结果显示,氟美松治疗组Fas、FasL蛋白质表达明显减弱,与对照组表达水平相近。
表4 三组大鼠Fas、FasL蛋白质的表达(±s) 组 别
鼠数
(只)
2小时
6小时
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12小时
24小时
Fas蛋白质
急性肺损伤组
24
2 109±
201△
4 069±
542△
4 328±
568△
4 782±
, 百拇医药
583△
氟美松治疗组
24
1 012±
111*
1 379±
202△*
2 166±
225△*
2 268±
265△*
, 百拇医药
对照组
6
-
862±112
-
-
FasL蛋白质
急性肺损伤组
24
2 231±
199△
3 981±
488△
, 百拇医药
4 205±
468△
4 677±
487△
氟美松治疗组
24
983±
122*
1 265±
147△*
1 899±
258△*
, 百拇医药
2 144±
235△*
对照组
6
-
754±105
-
-
注:-为未做 与对照组比较,△P<0.01;与同时相点急性肺损伤组比较,*P<0.01
讨论 我们采用TUNEL法对ALI大鼠肺组织细胞凋亡进行检测,结果发现大鼠注射LPS 4小时后即可见支气管上皮、肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞凋亡改变,并随时间延长凋亡率呈上升趋势,而对照组未见上述细胞凋亡改变,提示细胞凋亡存在于ALI病程中,细胞凋亡可能参与ALI早期血管内皮细胞和肺泡上皮细胞受损 。近来研究认为,Fas/FasL系统功能失调是一些疾病的重要发病机制之一。本组SqRT-PCR结果显示,对照组Fas mRNA仅见微弱表达,而FasL mRNA未见表达。注射LPS后,Fas mRNA、FasL mRNA表达明显增加,与对照组比较差异有显著性。免疫组化结果发现,Fas在ALI大鼠肺组织表达明显增加,且呈弥漫性,FasL表达也有一定程度上调。以上结果提示细胞凋亡及相关基因表达异常可能参与ALI的发病机制。
, 百拇医药
近来的研究表明,糖皮质激素对LPS诱导大鼠ALI有明显防护作用,与抑制TNFα及白细胞介素-1β等炎性细胞因子表达有关 。Wen等[1]的研究结果显示,氟美松可抑制由Fas抗体和γ干扰素诱导的肺泡上皮细胞凋亡。Hagimoto等[3]采用博来霉素复制了小鼠ALI和肺纤维化模型,结果显示甲基泼尼松龙可明显抑制肺部炎症反应以及肺组织细胞凋亡及Fas mRNA、FasL mRNA表达,证实了糖皮质激素可调控肺组织细胞凋亡。本研究结果显示,大鼠在给予LPS同时予以氟美松可明显抑制大鼠血清TNFα释放,明显抑制肺部炎症反应。氟美松在病程早期(<24小时)可明显抑制LPS 诱导的肺组织细胞凋亡,并明显下调Fas mRNA、FasL mRNA及Fas蛋白质、FasL蛋白质的表达。
氟美松抑制ALI早期肺组织细胞凋亡,保护肺组织的机制可能与以下因素有关:(1)抑制炎性介质的释放[4]。实验中我们发现,氟美松治疗组TNFα释放受到明显抑制,减轻肺组织损伤。(2)抑制Fas/FasL系统的活化。本实验结果表明,氟美松组大鼠肺组织Fas、FasL表达较ALI组显著降低,接近完全抑制,而肺组织损伤和靶细胞凋亡也明显减轻,说明氟美松可通过抑制Fas/FasL系统活化而阻断、调控肺组织靶细胞的凋亡。
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参考文献
1 Wen LP , Madani K , Fahmi JA , et al . Dexamethasone inhibits lung epithelial cell apoptosis induced by IFN-gamma and Fas . Am J Physiol ,1997,273:L921-L929.
2 卢圣栋,主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,1993.408-429.
3 Hagimoto N , Kuwano K , Nomoto Y, et al. Apoptosis and expression of Fas/Fas ligand mRNA in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:91-101.
4 Bernard GR. Acute respiratory distress syndrome: potential therapeutic interventions. Semin Respir Crit Care Med,1994,15:300-307.
(收稿:1998-08-31 修回:1999-03-01), 百拇医药
单位:宋勇 210002 南京军区南京总医院呼吸内科;毛宝龄、钱桂生、王建春 第三军医大学新桥医院解放军呼吸病研究所
关键词:
中华内科杂志990818 近来的研究表明,氟美松不仅可以抑制肿瘤坏死因子(TNF)α等前炎症细胞因子的表达,而且还可以抑制肺泡上皮细胞凋亡及Fas/Fas配体(FasL)的表达[1]。本实验通过观察氟美松对急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织细胞凋亡及Fas、FasL表达的影响,探讨其在全身炎症反应及ALI中的作用机制及意义。
一、材料与方法
1.模型复制与分组:雄性Wistar大鼠78只,体重150~250 g。大鼠经1%戊巴比妥钠麻醉后,随机分成3组:(1)ALI组:静脉注射脂多糖(LPS)5 mg/kg,注射LPS后1、2、4、6、12和24小时活杀。(2)氟美松治疗组:在注射LPS 5 mg/kg同时静脉注射氟美松10 mg/kg,于注射后1、2、4、6、12和24小时活杀。(3)对照组:静脉注射生理盐水0.1ml ,于注射后6小时活杀。每个时相点为6只大鼠。活杀后取肺组织观察细胞凋亡及Fas/FasL表达。
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2.肺组织细胞凋亡原位检测采用TUNEL法,按B.M公司试剂盒提供方法稍加改进。计算5个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数,凋亡指数以凋亡细胞/100个细胞表示。按凋亡细胞占细胞总数的百分率将其分为五级:0级<2%,1级为3%~9%,2级为10%~19%,3级为20%~39%,4级>40%。
3.半定量逆转录聚合酶链反应(SqRT-PCR)参照文献[2]进行。 PCR产物的半定量采用Tiger 920G图象分析系统,结果以Fas、FasL积分光密度/相应β-actin积分光密度的比值表示。
4.免疫组织化学染色步骤参照试剂盒推荐方法进行。采用Tiger 920细胞图象分析系统分析图象。在显微镜(×200)下以相同外部条件(亮度)摄取bmp图象,每张切片摄10幅,设定灰度值为50~250。得出统计场总面积的积分光密度值,每张切片取均值。
5.统计学方法:数据以±s表示,采用t检验。
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二、结果
1.三组大鼠血清TNFα的测定结果:见表1。
表1 三组大鼠血清肿瘤坏死因子α的测定结果 组 别
鼠数
(只)
肿瘤坏死因子α(μg/L, ±s)
1小时
4小时
6小时
12小时
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急性肺损伤组
18
5.56±
0.62△
4.26±
0.32△
-
2.03±
0.24△
氟美松治疗组
18
4.49±
, 百拇医药
0.21△*
3.97±
0.15△*
-
1.66±
0.24△*
对照组
6
-
-
0.06±
0.02
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-
注:-为未做 与对照组比较,△P<0.01;与同时相点急性肺损伤组比较,*P<0.01
2.三组大鼠肺组织细胞凋亡的测定结果:见表2。与ALI组相比,氟美松治疗组大鼠肺组织细胞凋亡明显减少。
表2 三组大鼠肺组织细胞凋亡的测定结果 组 别
鼠数
(只)
肺组织细胞凋亡(级)
4小时
6小时
12小时
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24小时
急性肺损伤组
18
1(0~1)
-
2(2~3)
2(2~3)
氟美松治疗组
18
0(0~1)
-
1(0~1)
1(1~1)
, 百拇医药
对照组
6
-
0(0~0)
-
-
注:-为未做
3.三组大鼠肺组织细胞凋亡相关基因mRNA的表达:见表3。SqRT-PCR结果表明,氟美松治疗组6小时时相点的Fas、FasL mRNA表达水平明显低于ALI组6小时时相点(P<0.01),与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。
表3 三组大鼠6小时时相点Fas、FasL mRNA的表达(±s) 组 别
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鼠数(只)
Fas mRNA
FasL mRNA
急性肺损伤组
6
0.90±0.12
0.73±0.05
氟美松治疗组
6
0.15±0.01*
0.04±0.01*
对照组
, 百拇医药
6
0.14±0.01
0.04±0.01
注:与急性肺损伤组比较,*P<0.01 4.三组大鼠Fas、FasL蛋白质的表达:见表4。免疫组化结果显示,氟美松治疗组Fas、FasL蛋白质表达明显减弱,与对照组表达水平相近。
表4 三组大鼠Fas、FasL蛋白质的表达(±s) 组 别
鼠数
(只)
2小时
6小时
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12小时
24小时
Fas蛋白质
急性肺损伤组
24
2 109±
201△
4 069±
542△
4 328±
568△
4 782±
, 百拇医药
583△
氟美松治疗组
24
1 012±
111*
1 379±
202△*
2 166±
225△*
2 268±
265△*
, 百拇医药
对照组
6
-
862±112
-
-
FasL蛋白质
急性肺损伤组
24
2 231±
199△
3 981±
488△
, 百拇医药
4 205±
468△
4 677±
487△
氟美松治疗组
24
983±
122*
1 265±
147△*
1 899±
258△*
, 百拇医药
2 144±
235△*
对照组
6
-
754±105
-
-
注:-为未做 与对照组比较,△P<0.01;与同时相点急性肺损伤组比较,*P<0.01
讨论 我们采用TUNEL法对ALI大鼠肺组织细胞凋亡进行检测,结果发现大鼠注射LPS 4小时后即可见支气管上皮、肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞凋亡改变,并随时间延长凋亡率呈上升趋势,而对照组未见上述细胞凋亡改变,提示细胞凋亡存在于ALI病程中,细胞凋亡可能参与ALI早期血管内皮细胞和肺泡上皮细胞受损 。近来研究认为,Fas/FasL系统功能失调是一些疾病的重要发病机制之一。本组SqRT-PCR结果显示,对照组Fas mRNA仅见微弱表达,而FasL mRNA未见表达。注射LPS后,Fas mRNA、FasL mRNA表达明显增加,与对照组比较差异有显著性。免疫组化结果发现,Fas在ALI大鼠肺组织表达明显增加,且呈弥漫性,FasL表达也有一定程度上调。以上结果提示细胞凋亡及相关基因表达异常可能参与ALI的发病机制。
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近来的研究表明,糖皮质激素对LPS诱导大鼠ALI有明显防护作用,与抑制TNFα及白细胞介素-1β等炎性细胞因子表达有关 。Wen等[1]的研究结果显示,氟美松可抑制由Fas抗体和γ干扰素诱导的肺泡上皮细胞凋亡。Hagimoto等[3]采用博来霉素复制了小鼠ALI和肺纤维化模型,结果显示甲基泼尼松龙可明显抑制肺部炎症反应以及肺组织细胞凋亡及Fas mRNA、FasL mRNA表达,证实了糖皮质激素可调控肺组织细胞凋亡。本研究结果显示,大鼠在给予LPS同时予以氟美松可明显抑制大鼠血清TNFα释放,明显抑制肺部炎症反应。氟美松在病程早期(<24小时)可明显抑制LPS 诱导的肺组织细胞凋亡,并明显下调Fas mRNA、FasL mRNA及Fas蛋白质、FasL蛋白质的表达。
氟美松抑制ALI早期肺组织细胞凋亡,保护肺组织的机制可能与以下因素有关:(1)抑制炎性介质的释放[4]。实验中我们发现,氟美松治疗组TNFα释放受到明显抑制,减轻肺组织损伤。(2)抑制Fas/FasL系统的活化。本实验结果表明,氟美松组大鼠肺组织Fas、FasL表达较ALI组显著降低,接近完全抑制,而肺组织损伤和靶细胞凋亡也明显减轻,说明氟美松可通过抑制Fas/FasL系统活化而阻断、调控肺组织靶细胞的凋亡。
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参考文献
1 Wen LP , Madani K , Fahmi JA , et al . Dexamethasone inhibits lung epithelial cell apoptosis induced by IFN-gamma and Fas . Am J Physiol ,1997,273:L921-L929.
2 卢圣栋,主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,1993.408-429.
3 Hagimoto N , Kuwano K , Nomoto Y, et al. Apoptosis and expression of Fas/Fas ligand mRNA in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Am J Respir Cell Mol Biol, 1997,16:91-101.
4 Bernard GR. Acute respiratory distress syndrome: potential therapeutic interventions. Semin Respir Crit Care Med,1994,15:300-307.
(收稿:1998-08-31 修回:1999-03-01), 百拇医药