志贺菌属对氟喹诺酮类药物耐药机制的研究
作者:丁建强 马亦林 龚正 陈亚岗
单位:马亦林 龚正 陈亚岗 310003 杭州,浙江医科大学附属第一医院传染科;丁建强 浙江医科大学附属邵逸夫医院,310016
关键词:氟喹诺酮类;抗药性;志贺氏菌属;gyrA基因
中华内科杂志990813 【摘 要】 目的 研究志贺菌属对氟喹诺酮类药物的耐药机制。方法 从临床上收集志贺菌157株,进行药敏试验、利血平逆转试验、R质粒接合试验和细菌内诺氟沙星聚积的测定。对其中8株耐药菌、1株敏感菌和1株福氏标准菌的gyrA基因5′-末端编码区进行聚合酶链反应扩增并克隆和序列分析。结果 诺氟沙星耐药菌的R质粒接合试验阳性率为51.2%,R质粒不能传递对氟喹诺酮类药物的耐药性,利血平不能降低氟喹诺酮类药物对志贺菌的最低抑菌浓度值,耐药菌的诺氟沙星聚积浓度与敏感菌相同。对gyrA基因的序列分析发现了5个导致氨基酸改变的基因点突变:甘氨酸-81→丝氨酸,丝氨酸-83→亮氨酸,天冬氨酸-87→天冬酰氨,天冬氨酸-87→甘氨酸,甲硫氨酸-92→赖氨酸。结论 志贺菌属对氟喹诺酮类药物产生耐药性与gyrA基因的点突变有关。
, http://www.100md.com
A study on the mechanism of the resistance of Shigellae to fluoroquinolones
DING Jianqiang*, MA Yilin, GONG Zheng, et al.
Department of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003 (*now address: Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310016)
【Abstract】 Objective To study the mechanism of the resistance of Shigellae to fluoroquinolones. Methods A total of 157 clinical isolates were collected. Antibiotic susceptibility testing , reserpine reverse reaction and plasmid conjugation experiment were performed. Accumulation of norfloxacin by shigellae was determined. The N-terminal coding region of gyrA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR), cloned and sequenced in eight fluoroquinolone-resistant isolates and one fluoroquinolone-sensitive isolate as well as in Shigella 51573 (the standard strain). Results The positive rate of norfloxacin-resistant isolates was 51.2% in the R plasmid conjugation experiment. R plasmid could not mediate resistance to fluoroquinolones. Reserpine could not decrease the minimun inhibition concentration of fluoroquinolones to Shigellae. Norfloxacin uptake by fluoroquinolone-resistant isolates was the same as that by the sensitive one. DNA sequence analysis of gyrA gene from fluoroquinolone-resistant isolates revealed five point mutations that resulted in amino acid change:Gly-81→Ser, Ser-83→Leu, Asp-87→Asn, Asp-87→Gly, Met-92→Lys. Conclusion The mutations of gyrA gene were implicated in the resistance of Shigellae to fluoroquinolones.
, 百拇医药
【Key words】 Fluoroquinolones Drug resistance Shigella gyrA gene
从80年代开始,氟喹诺酮类药物用于治疗志贺菌感染引起的细菌性痢疾表现出强大的杀菌活力,但近年来志贺菌的敏感性已有下降的趋势。国外对大肠埃希菌等细菌的研究中已明确,细菌对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制是由于细菌DNA旋转酶(gyrase)基因发生点突变或膜耐药[1]。为研究志贺菌属对氟喹诺酮类药物的耐药机制,我们从临床上收集志贺菌进行药敏试验、利血平逆转试验、R质粒接合试验和细菌内诺氟沙星聚积的测定,并对耐药菌和敏感菌的gyrA基因进行了克隆和序列分析。
资料和方法
一、菌株来源
于1995年8~10月在浙江省4个地区(杭州、湖州、金华、嘉兴)收集腹泻患者粪便培养细菌标本,在当地经初步鉴定后,送本院重新进行生化和血清学鉴定。
, http://www.100md.com
二、抗菌药敏纸片
共14种,除奈替米星药敏纸片采用温州制药厂提供的标准品自行制作,氨曲南药敏纸片为上海施贵宝制药公司惠赠外,其余均购自浙江省军区卫生防疫检验所。诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星标准品分别由浙江新昌制药厂和温州制药厂提供。
三、试剂
志贺菌属诊断血清购自卫生部兰州生物制品研究所。利血平为广州侨光制药厂产品,氯霉素和利福霉素SV钠购自中国药品生物制品检定所,受体菌为大肠埃希菌K12W1485Rifr,聚合酶链反应(PCR)所用的引物及试剂均购自美国Promega公司,使用Promega公司的pGEM-T Easy Vector SystemsⅠ进行 PCR产物的克隆,测序试剂盒为Promega公司的TaqTrack Sequencing Core System,测序引物委托美国GiBcoBRL公司合成,放射性核素采用α-32PdATP,购自北京亚辉生物医学工程公司。
, 百拇医药
四、仪器
日立-4000荧光分光光度计、PE480热循环仪、GiBcoBRL sequencing Model S2 DNA测序仪。
五、抗菌药物敏感试验
采用改良Kirby-Bauer法,诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星3种药物采用平皿双倍稀释法进行最低抑菌浓度(MIC)的测定,结果按照美国NCCLS的标准进行判断[2],质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。
六、利血平逆转试验
按照Ng等[3]介绍的方法进行。
七、R质粒接合试验
157株志贺菌均进行R质粒接合试验,按文献[4]的方法进行。
, http://www.100md.com
八、细菌内诺氟沙星聚积的测定
按照文献[5]的方法进行。
九、耐药菌gyrA基因点突变的检测
1.细菌染色体DNA的提取:按照文献[6]的方法进行。
2.PCR扩增gyrA基因5′末端区: 由于志贺菌与大肠埃希菌同属肠道杆菌埃希菌族,在遗传学上两者相近。因此我们参照文献及大肠埃希菌gyrase基因序列设计PCR引物和测序引物[7,8],PCR扩增片段位于gyrA基因24~671位点,引物Ⅰ:5′-TACACCGGTCAACATTGAGG-3′, 引物Ⅱ:5′-TTAATGATTGCCGCCGTCGG-3′。100 μl PCR反应混合液包括:10×PCR缓冲液10 μl, 25 mmol/L MgCl2 7 μl, 20 mmol/L dNTP 0.5 μl, 引物Ⅰ和引物Ⅱ各100 ng, Taq酶2.5 U,模板DNA 50 ng,去离子水75 μl。反应条件:94℃1分钟,56℃45秒,72℃30秒,共35个循环, PCR反应重复2次,反应结束后取10 μl进行0.7%琼脂糖电泳,EB染色。
, 百拇医药
3.PCR产物克隆和gyr A基因序列测定:按照文献[9]介绍的方法进行。测序反应为Sanger双脱氧链末端终止法,测序引物序列为5′-CGTACTAGGCAATGACTGGA,始于gyr A基因的第159核苷酸,测序反应和电泳重复2次。
结果
一、药物敏感试验结果
收集到的志贺菌中有156株福氏志贺菌,均为福氏ⅡA,宋内志贺菌1株。156株福氏志贺菌的纸片法药敏结果见表1,1株宋内志贺菌对诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星呈低水平耐药。3种氟喹诺酮类药物对志贺菌的MIC见表2。10株用于诺氟沙星聚积测定和分子生物学实验的志贺菌的MIC详见表3。
表1 156株福氏志贺菌的纸片法药敏结果(株数) 抗菌药物
耐药
, http://www.100md.com
中度敏感
敏感
耐药率(%)
四环素
153
0
3
98.1
氨苄西林
148
6
2
94.9
, http://www.100md.com
复方新诺明
137
0
19
87.8
氯霉素
32
54
70
20.5
呋喃唑酮
1
13
, 百拇医药 142
0.6
诺氟沙星
43
11
102
27.6
氧氟沙星
18
24
114
11.5
环丙沙星
, http://www.100md.com 24
26
106
15.4
头孢唑啉
5
0
151
3.2
头孢曲松
4
1
151
2.6
, 百拇医药
氨曲南
2
2
152
1.3
庆大霉素
2
0
154
1.3
阿米卡星
1
0
155
, 百拇医药
0.6
奈替米星
1
0
155
0.6
表2 3种氟喹诺酮类药物对志贺菌的最低抑菌浓度(MIC,mg/L) 菌种
株数
MIC范围
MIC50
MIC90
诺氟沙星
, 百拇医药
氧氟沙星
环丙沙星
诺氟沙星
氧氟沙星
环丙沙星
诺氟沙星
氧氟沙星
环丙沙星
福氏
156
0.25~128
0.25~32
0.25~64
, 百拇医药
4
1
1
32
8
8
宋内
1
16
8
4
表3 3种氟喹诺酮类药物对10株志贺菌的最低抑菌浓度(mg/L) 菌株编号
诺氟沙星
, 百拇医药
氧氟沙星
环丙沙星
1
32
4
8
2
32
8
8
3
32
8
8
, http://www.100md.com
4
128
8
8
5
32
8
8
6
≥128
16
32
7
32
, http://www.100md.com
8
8
8
16
8
4
9
0.5
<0.25
0.5
10
≤0.125
≤0.125
, 百拇医药 ≤0.125
注:1~8号菌株为耐药株,9号菌株为敏感株,10号菌株为志贺菌标准菌株51573,其中8号菌株为宋内志贺菌
表4 gyrA基因序列和相关氨基酸的结果 菌株编号
gyrA基因
大肠埃希菌
CAT
GGT
GAC
TCG
GCG
GTC
, 百拇医药 TAT
GAC
ACG
ATT
GTC
CGC
ATG
GCG
Val
ILe
Arg
85
89
, 百拇医药 91
9(10)
CAT
GGT
GAC
TCG
GCG
GTT
TAT
GAC
ACG
ATC
GTC
, 百拇医药 CGT
ATG
GCG
His
Gly
Asp
Ser
Ala
Val
Tyr
Asp
Thr
ILe
, 百拇医药 Val
Arg
Met
Ala
81
83
87
92
1
TTG
GGC
Leu
Gly
2
, 百拇医药
TTG
AAC
Asn
3
TTG
AAC
4
TTG
GGC
AAG
Lys
5
TTG
, 百拇医药 GGC
6
TTG
AAC
7
AGT
Ser
8
TTG
GGC
注:1~8号菌株为耐药株,9号菌株为敏感株,10号菌株为志贺菌标准菌株51573,其中8号菌株为宋内志贺菌
二、利血平逆转试验结果
, 百拇医药
利血平不能降低诺氟沙星对耐药志贺菌的MIC值。
三、R质粒接合试验结果
接合体呈不透明蓝绿色,光滑湿润,边缘整齐,未经接合的供、受体菌不能在含有抗生素的中国蓝培养基上生长,接合体也不能在含诺氟沙星的培养基上生长,诺氟沙星耐药菌的R质粒接合试验阳性率达51.2%。
四、菌体内诺氟沙星聚积浓度的测定结果
诺氟沙星的激发波长为280 nm,放射波长为448 nm,图1显示2株细菌诺氟沙星的聚积在5分钟内达到平衡状态,耐药菌与敏感菌体内的诺氟沙星聚积浓度未见明显差异。
注:每点为2次测量的平均值
, http://www.100md.com
图1 细菌内诺氟沙星的聚积
五、耐药志贺菌gyrA基因点突变的检测结果
PCR反应产物的电泳结果见图2, PCR扩增产物为648 bp。聚丙烯酰胺凝胶电泳核素放射自显影结果见图3。gyrA基因序列及相关氨基酸的结果见表4。敏感菌和标准菌的gyrA基因序列与国外报道的序列相同[7],与大肠埃希菌gyrA基因序列在85、89、91位点上存在遗传变异[8],但编码相同的氨基酸。
M:1 kb分子量标准,C:空白对照
图2 聚合酶链反应产物的0.7%琼脂糖电泳结果
, 百拇医药
图3 1~10号菌株的gyr A基因序列的核素放射自显影结果
讨论
细菌性痢疾是我国最为常见的感染性腹泻,本研究结果显示,156株福氏志贺菌对多种抗菌药物耐药,尤其是对四环素、氨苄西林和复方新诺明的耐药率相当高,同时对氟喹诺酮类药物也有了一定程度的耐药性,对诺氟沙星的耐药率已达到了27.6%, 而对氧氟沙星和环丙沙星的耐药率相对较低,同时还发现了1株对氟喹诺酮类药物呈低水平耐药的宋内志贺菌。本研究证实,R质粒能介导志贺菌对多种抗菌药物的耐药性,但不介导对氟喹诺酮类药物的耐药性,这与国内外研究结果相符合。存在于细菌内膜上的药物主动流出系统是造成金黄色葡萄球菌等细菌对氟喹诺酮类药物耐药的一个重要原因[10],可以被利血平所逆转,但在本研究中未发现耐药志贺菌中存在着主动流出系统介导的耐药性。通过药物浓度的测定也未发现耐药志贺菌膜的通透性发生改变,这些情况尚待今后进一步的研究。
, 百拇医药
Rahman等[7]对喹诺酮类耐药痢疾志贺菌的研究中检测到,耐药菌gyrA基因上83位丝氨酸突变为亮氨酸,并用限制片段长度多态性(RFLP)方法得到了同样的结果,证明gyrA基因的点突变造成痢疾志贺菌产生了耐药性。Horiuchi[11]对氟喹诺酮类药物敏感性下降的宋内志贺菌进行了研究,用体外测定DNA旋转酶活性的方法发现,敏感性下降菌株的DNA旋转酶活性并没有被氧氟沙星有效地抑制,用核素14C标记的氧氟沙星测定了细菌对药物的聚积,没有发现敏感性下降菌株与敏感菌株之间有任何差异,推测宋内志贺菌对氟喹诺酮类药物敏感性下降可能是由于DNA旋转酶gyrA基因产生了突变。
我们对耐药福氏和宋内志贺菌gyr A基因序列的研究中发现了5个导致氨基酸改变 的基因点突变:甘氨酸-81→丝氨酸,丝氨酸-83→亮氨酸,天冬氨酸-87→天冬酰氨,天冬氨酸-87→甘氨酸,甲硫氨酸-92→赖氨酸,其中92位氨基酸的编码基因由ATG突变为AAG,相应氨基酸由甲硫氨酸突变为赖氨酸,是研究中新发现的一个基因突变位点,在其他耐药细菌gyrA基因突变的研究中未见报道过,这个新的基因突变位点与福氏志贺菌耐药性的关系有待于进一步的阐明。
, 百拇医药
综上所述,我们认为目前志贺菌属对氟喹诺酮类药物产生耐药性与gyrA基因的点突变有关。
参考文献
1 Cambau E, Gutmann L. Mechanisms of resistance to quinolones.Drugs,1993,45 Suppl 3:15-23.
2 娄永新,王金良,主编.实用临床细菌学检验与进展.天津:天津科技翻译出版公司, 1994.252-256.
3 Ng EY, Trucksis M, Hooper DC. Quinolone resistance mediated by norA: physiologic characterization and relationship to flqB,a quinolone resistance locus on the Staphylococcus aureus chromosome. Antimicrob Agents Chemother,1994,38: 1345-1355.
, http://www.100md.com
4 张子康,何光泽,主编.医学微生物与免疫学实验教程.成都:四川科学技术出版社, 1989.39-40.
5 Chapman JS, Georgopapadakou NH. Fluorometric assay for fleroxacin uptake by bacterial cells.Antimicrob Agents Chemother,1989,33:27-29.
6 卢圣栋,主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,1993.415-417.
7 Rahman M, Mauff G, Levy J, et al. Detection of 4-quinolone resistance mutation in gyrA gene of Shigella dysenteria type 1 by PCR. Antimicrob Agents Chemother, 1994,38:2488-2491.
, 百拇医药
8 Swanberg SL,Wang JC. Cloning and sequencing of the Escherichia coli gyrA gene coding for the A subunit of DNA gyrase. J Mol Biol,1987,197:729-736.
9 金冬雁,黎孟枫,译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1995.602-640.
10 Kaatz GW, Seo SM, Ruble CA. Efflux-mediated fluoroquinolone resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother,1993,37:1086-1094.
11 Horiuchi S. Reduced susceptibilities of Shigella sonnei strains isolated from patients with dysentery to fluoroquinolones. Antimicrob Agents Chemother, 1993,37:2486-2489.
(收稿:1998-10-20 修回:1999-04-30), 百拇医药
单位:马亦林 龚正 陈亚岗 310003 杭州,浙江医科大学附属第一医院传染科;丁建强 浙江医科大学附属邵逸夫医院,310016
关键词:氟喹诺酮类;抗药性;志贺氏菌属;gyrA基因
中华内科杂志990813 【摘 要】 目的 研究志贺菌属对氟喹诺酮类药物的耐药机制。方法 从临床上收集志贺菌157株,进行药敏试验、利血平逆转试验、R质粒接合试验和细菌内诺氟沙星聚积的测定。对其中8株耐药菌、1株敏感菌和1株福氏标准菌的gyrA基因5′-末端编码区进行聚合酶链反应扩增并克隆和序列分析。结果 诺氟沙星耐药菌的R质粒接合试验阳性率为51.2%,R质粒不能传递对氟喹诺酮类药物的耐药性,利血平不能降低氟喹诺酮类药物对志贺菌的最低抑菌浓度值,耐药菌的诺氟沙星聚积浓度与敏感菌相同。对gyrA基因的序列分析发现了5个导致氨基酸改变的基因点突变:甘氨酸-81→丝氨酸,丝氨酸-83→亮氨酸,天冬氨酸-87→天冬酰氨,天冬氨酸-87→甘氨酸,甲硫氨酸-92→赖氨酸。结论 志贺菌属对氟喹诺酮类药物产生耐药性与gyrA基因的点突变有关。
, http://www.100md.com
A study on the mechanism of the resistance of Shigellae to fluoroquinolones
DING Jianqiang*, MA Yilin, GONG Zheng, et al.
Department of Infectious Diseases, The First Affiliated Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003 (*now address: Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310016)
【Abstract】 Objective To study the mechanism of the resistance of Shigellae to fluoroquinolones. Methods A total of 157 clinical isolates were collected. Antibiotic susceptibility testing , reserpine reverse reaction and plasmid conjugation experiment were performed. Accumulation of norfloxacin by shigellae was determined. The N-terminal coding region of gyrA gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR), cloned and sequenced in eight fluoroquinolone-resistant isolates and one fluoroquinolone-sensitive isolate as well as in Shigella 51573 (the standard strain). Results The positive rate of norfloxacin-resistant isolates was 51.2% in the R plasmid conjugation experiment. R plasmid could not mediate resistance to fluoroquinolones. Reserpine could not decrease the minimun inhibition concentration of fluoroquinolones to Shigellae. Norfloxacin uptake by fluoroquinolone-resistant isolates was the same as that by the sensitive one. DNA sequence analysis of gyrA gene from fluoroquinolone-resistant isolates revealed five point mutations that resulted in amino acid change:Gly-81→Ser, Ser-83→Leu, Asp-87→Asn, Asp-87→Gly, Met-92→Lys. Conclusion The mutations of gyrA gene were implicated in the resistance of Shigellae to fluoroquinolones.
, 百拇医药
【Key words】 Fluoroquinolones Drug resistance Shigella gyrA gene
从80年代开始,氟喹诺酮类药物用于治疗志贺菌感染引起的细菌性痢疾表现出强大的杀菌活力,但近年来志贺菌的敏感性已有下降的趋势。国外对大肠埃希菌等细菌的研究中已明确,细菌对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制是由于细菌DNA旋转酶(gyrase)基因发生点突变或膜耐药[1]。为研究志贺菌属对氟喹诺酮类药物的耐药机制,我们从临床上收集志贺菌进行药敏试验、利血平逆转试验、R质粒接合试验和细菌内诺氟沙星聚积的测定,并对耐药菌和敏感菌的gyrA基因进行了克隆和序列分析。
资料和方法
一、菌株来源
于1995年8~10月在浙江省4个地区(杭州、湖州、金华、嘉兴)收集腹泻患者粪便培养细菌标本,在当地经初步鉴定后,送本院重新进行生化和血清学鉴定。
, http://www.100md.com
二、抗菌药敏纸片
共14种,除奈替米星药敏纸片采用温州制药厂提供的标准品自行制作,氨曲南药敏纸片为上海施贵宝制药公司惠赠外,其余均购自浙江省军区卫生防疫检验所。诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星标准品分别由浙江新昌制药厂和温州制药厂提供。
三、试剂
志贺菌属诊断血清购自卫生部兰州生物制品研究所。利血平为广州侨光制药厂产品,氯霉素和利福霉素SV钠购自中国药品生物制品检定所,受体菌为大肠埃希菌K12W1485Rifr,聚合酶链反应(PCR)所用的引物及试剂均购自美国Promega公司,使用Promega公司的pGEM-T Easy Vector SystemsⅠ进行 PCR产物的克隆,测序试剂盒为Promega公司的TaqTrack Sequencing Core System,测序引物委托美国GiBcoBRL公司合成,放射性核素采用α-32PdATP,购自北京亚辉生物医学工程公司。
, 百拇医药
四、仪器
日立-4000荧光分光光度计、PE480热循环仪、GiBcoBRL sequencing Model S2 DNA测序仪。
五、抗菌药物敏感试验
采用改良Kirby-Bauer法,诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星3种药物采用平皿双倍稀释法进行最低抑菌浓度(MIC)的测定,结果按照美国NCCLS的标准进行判断[2],质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。
六、利血平逆转试验
按照Ng等[3]介绍的方法进行。
七、R质粒接合试验
157株志贺菌均进行R质粒接合试验,按文献[4]的方法进行。
, http://www.100md.com
八、细菌内诺氟沙星聚积的测定
按照文献[5]的方法进行。
九、耐药菌gyrA基因点突变的检测
1.细菌染色体DNA的提取:按照文献[6]的方法进行。
2.PCR扩增gyrA基因5′末端区: 由于志贺菌与大肠埃希菌同属肠道杆菌埃希菌族,在遗传学上两者相近。因此我们参照文献及大肠埃希菌gyrase基因序列设计PCR引物和测序引物[7,8],PCR扩增片段位于gyrA基因24~671位点,引物Ⅰ:5′-TACACCGGTCAACATTGAGG-3′, 引物Ⅱ:5′-TTAATGATTGCCGCCGTCGG-3′。100 μl PCR反应混合液包括:10×PCR缓冲液10 μl, 25 mmol/L MgCl2 7 μl, 20 mmol/L dNTP 0.5 μl, 引物Ⅰ和引物Ⅱ各100 ng, Taq酶2.5 U,模板DNA 50 ng,去离子水75 μl。反应条件:94℃1分钟,56℃45秒,72℃30秒,共35个循环, PCR反应重复2次,反应结束后取10 μl进行0.7%琼脂糖电泳,EB染色。
, 百拇医药
3.PCR产物克隆和gyr A基因序列测定:按照文献[9]介绍的方法进行。测序反应为Sanger双脱氧链末端终止法,测序引物序列为5′-CGTACTAGGCAATGACTGGA,始于gyr A基因的第159核苷酸,测序反应和电泳重复2次。
结果
一、药物敏感试验结果
收集到的志贺菌中有156株福氏志贺菌,均为福氏ⅡA,宋内志贺菌1株。156株福氏志贺菌的纸片法药敏结果见表1,1株宋内志贺菌对诺氟沙星、氧氟沙星和环丙沙星呈低水平耐药。3种氟喹诺酮类药物对志贺菌的MIC见表2。10株用于诺氟沙星聚积测定和分子生物学实验的志贺菌的MIC详见表3。
表1 156株福氏志贺菌的纸片法药敏结果(株数) 抗菌药物
耐药
, http://www.100md.com
中度敏感
敏感
耐药率(%)
四环素
153
0
3
98.1
氨苄西林
148
6
2
94.9
, http://www.100md.com
复方新诺明
137
0
19
87.8
氯霉素
32
54
70
20.5
呋喃唑酮
1
13
, 百拇医药 142
0.6
诺氟沙星
43
11
102
27.6
氧氟沙星
18
24
114
11.5
环丙沙星
, http://www.100md.com 24
26
106
15.4
头孢唑啉
5
0
151
3.2
头孢曲松
4
1
151
2.6
, 百拇医药
氨曲南
2
2
152
1.3
庆大霉素
2
0
154
1.3
阿米卡星
1
0
155
, 百拇医药
0.6
奈替米星
1
0
155
0.6
表2 3种氟喹诺酮类药物对志贺菌的最低抑菌浓度(MIC,mg/L) 菌种
株数
MIC范围
MIC50
MIC90
诺氟沙星
, 百拇医药
氧氟沙星
环丙沙星
诺氟沙星
氧氟沙星
环丙沙星
诺氟沙星
氧氟沙星
环丙沙星
福氏
156
0.25~128
0.25~32
0.25~64
, 百拇医药
4
1
1
32
8
8
宋内
1
16
8
4
表3 3种氟喹诺酮类药物对10株志贺菌的最低抑菌浓度(mg/L) 菌株编号
诺氟沙星
, 百拇医药
氧氟沙星
环丙沙星
1
32
4
8
2
32
8
8
3
32
8
8
, http://www.100md.com
4
128
8
8
5
32
8
8
6
≥128
16
32
7
32
, http://www.100md.com
8
8
8
16
8
4
9
0.5
<0.25
0.5
10
≤0.125
≤0.125
, 百拇医药 ≤0.125
注:1~8号菌株为耐药株,9号菌株为敏感株,10号菌株为志贺菌标准菌株51573,其中8号菌株为宋内志贺菌
表4 gyrA基因序列和相关氨基酸的结果 菌株编号
gyrA基因
大肠埃希菌
CAT
GGT
GAC
TCG
GCG
GTC
, 百拇医药 TAT
GAC
ACG
ATT
GTC
CGC
ATG
GCG
Val
ILe
Arg
85
89
, 百拇医药 91
9(10)
CAT
GGT
GAC
TCG
GCG
GTT
TAT
GAC
ACG
ATC
GTC
, 百拇医药 CGT
ATG
GCG
His
Gly
Asp
Ser
Ala
Val
Tyr
Asp
Thr
ILe
, 百拇医药 Val
Arg
Met
Ala
81
83
87
92
1
TTG
GGC
Leu
Gly
2
, 百拇医药
TTG
AAC
Asn
3
TTG
AAC
4
TTG
GGC
AAG
Lys
5
TTG
, 百拇医药 GGC
6
TTG
AAC
7
AGT
Ser
8
TTG
GGC
注:1~8号菌株为耐药株,9号菌株为敏感株,10号菌株为志贺菌标准菌株51573,其中8号菌株为宋内志贺菌
二、利血平逆转试验结果
, 百拇医药
利血平不能降低诺氟沙星对耐药志贺菌的MIC值。
三、R质粒接合试验结果
接合体呈不透明蓝绿色,光滑湿润,边缘整齐,未经接合的供、受体菌不能在含有抗生素的中国蓝培养基上生长,接合体也不能在含诺氟沙星的培养基上生长,诺氟沙星耐药菌的R质粒接合试验阳性率达51.2%。
四、菌体内诺氟沙星聚积浓度的测定结果
诺氟沙星的激发波长为280 nm,放射波长为448 nm,图1显示2株细菌诺氟沙星的聚积在5分钟内达到平衡状态,耐药菌与敏感菌体内的诺氟沙星聚积浓度未见明显差异。
注:每点为2次测量的平均值
, http://www.100md.com
图1 细菌内诺氟沙星的聚积
五、耐药志贺菌gyrA基因点突变的检测结果
PCR反应产物的电泳结果见图2, PCR扩增产物为648 bp。聚丙烯酰胺凝胶电泳核素放射自显影结果见图3。gyrA基因序列及相关氨基酸的结果见表4。敏感菌和标准菌的gyrA基因序列与国外报道的序列相同[7],与大肠埃希菌gyrA基因序列在85、89、91位点上存在遗传变异[8],但编码相同的氨基酸。
M:1 kb分子量标准,C:空白对照
图2 聚合酶链反应产物的0.7%琼脂糖电泳结果
, 百拇医药
图3 1~10号菌株的gyr A基因序列的核素放射自显影结果
讨论
细菌性痢疾是我国最为常见的感染性腹泻,本研究结果显示,156株福氏志贺菌对多种抗菌药物耐药,尤其是对四环素、氨苄西林和复方新诺明的耐药率相当高,同时对氟喹诺酮类药物也有了一定程度的耐药性,对诺氟沙星的耐药率已达到了27.6%, 而对氧氟沙星和环丙沙星的耐药率相对较低,同时还发现了1株对氟喹诺酮类药物呈低水平耐药的宋内志贺菌。本研究证实,R质粒能介导志贺菌对多种抗菌药物的耐药性,但不介导对氟喹诺酮类药物的耐药性,这与国内外研究结果相符合。存在于细菌内膜上的药物主动流出系统是造成金黄色葡萄球菌等细菌对氟喹诺酮类药物耐药的一个重要原因[10],可以被利血平所逆转,但在本研究中未发现耐药志贺菌中存在着主动流出系统介导的耐药性。通过药物浓度的测定也未发现耐药志贺菌膜的通透性发生改变,这些情况尚待今后进一步的研究。
, 百拇医药
Rahman等[7]对喹诺酮类耐药痢疾志贺菌的研究中检测到,耐药菌gyrA基因上83位丝氨酸突变为亮氨酸,并用限制片段长度多态性(RFLP)方法得到了同样的结果,证明gyrA基因的点突变造成痢疾志贺菌产生了耐药性。Horiuchi[11]对氟喹诺酮类药物敏感性下降的宋内志贺菌进行了研究,用体外测定DNA旋转酶活性的方法发现,敏感性下降菌株的DNA旋转酶活性并没有被氧氟沙星有效地抑制,用核素14C标记的氧氟沙星测定了细菌对药物的聚积,没有发现敏感性下降菌株与敏感菌株之间有任何差异,推测宋内志贺菌对氟喹诺酮类药物敏感性下降可能是由于DNA旋转酶gyrA基因产生了突变。
我们对耐药福氏和宋内志贺菌gyr A基因序列的研究中发现了5个导致氨基酸改变 的基因点突变:甘氨酸-81→丝氨酸,丝氨酸-83→亮氨酸,天冬氨酸-87→天冬酰氨,天冬氨酸-87→甘氨酸,甲硫氨酸-92→赖氨酸,其中92位氨基酸的编码基因由ATG突变为AAG,相应氨基酸由甲硫氨酸突变为赖氨酸,是研究中新发现的一个基因突变位点,在其他耐药细菌gyrA基因突变的研究中未见报道过,这个新的基因突变位点与福氏志贺菌耐药性的关系有待于进一步的阐明。
, 百拇医药
综上所述,我们认为目前志贺菌属对氟喹诺酮类药物产生耐药性与gyrA基因的点突变有关。
参考文献
1 Cambau E, Gutmann L. Mechanisms of resistance to quinolones.Drugs,1993,45 Suppl 3:15-23.
2 娄永新,王金良,主编.实用临床细菌学检验与进展.天津:天津科技翻译出版公司, 1994.252-256.
3 Ng EY, Trucksis M, Hooper DC. Quinolone resistance mediated by norA: physiologic characterization and relationship to flqB,a quinolone resistance locus on the Staphylococcus aureus chromosome. Antimicrob Agents Chemother,1994,38: 1345-1355.
, http://www.100md.com
4 张子康,何光泽,主编.医学微生物与免疫学实验教程.成都:四川科学技术出版社, 1989.39-40.
5 Chapman JS, Georgopapadakou NH. Fluorometric assay for fleroxacin uptake by bacterial cells.Antimicrob Agents Chemother,1989,33:27-29.
6 卢圣栋,主编.现代分子生物学实验技术.北京:高等教育出版社,1993.415-417.
7 Rahman M, Mauff G, Levy J, et al. Detection of 4-quinolone resistance mutation in gyrA gene of Shigella dysenteria type 1 by PCR. Antimicrob Agents Chemother, 1994,38:2488-2491.
, 百拇医药
8 Swanberg SL,Wang JC. Cloning and sequencing of the Escherichia coli gyrA gene coding for the A subunit of DNA gyrase. J Mol Biol,1987,197:729-736.
9 金冬雁,黎孟枫,译.分子克隆实验指南.第2版.北京:科学出版社,1995.602-640.
10 Kaatz GW, Seo SM, Ruble CA. Efflux-mediated fluoroquinolone resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother,1993,37:1086-1094.
11 Horiuchi S. Reduced susceptibilities of Shigella sonnei strains isolated from patients with dysentery to fluoroquinolones. Antimicrob Agents Chemother, 1993,37:2486-2489.
(收稿:1998-10-20 修回:1999-04-30), 百拇医药