血脂康对低密度脂蛋白体外氧化修饰的影响
作者：徐伯平 程蕴琳 鲁翔
单位：210029 南京医科大学第一附属医院
关键词：动脉粥样硬化；脂蛋白类，LDL；血脂康
中华内科杂志990805 【摘 要】 目的 探讨血脂康对人低密度脂蛋白体外氧化修饰的影响。方法 通过体外实验，观察血脂康对铜离子介导人低密度脂蛋白氧化修饰后相对电泳迁移率的变化。结果 低密度脂蛋白在体外铜离子介导下，随作用时间延长，其相对电泳迁移率增大，表明铜离子可诱导低密度脂蛋白发生氧化修饰。当加入血脂康后，氧化低密度脂蛋白的相对电泳迁移率各时间点均较对照组低，两组相比，P<0.05，最大抑制率24小时达峰值，为33.5%。当加入不同浓度血脂康作用18小时，随血脂康浓度增加，其氧化低密度脂蛋白的相对电泳迁移率变小，抑制加强。结论 铜离子在体外能介导低密度脂蛋白氧化，随时间延长，氧化程度加重；血脂康能抑制铜离子介导的低密度脂蛋白氧化，随血脂康浓度增加，抑制加强。
, 百拇医药
The effect of Xuezhikang on oxidation of low-density lipoproteins in virto
XU Baoping, CHENG WenLing, LU Xing.
The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To study the effect of Xuezhikang on oxidation of human low-density lipoprotein. Methods In vitro experiment was used to study the effect of Xuezhikang on the change of human low-density lipoprotein. Relative electrophoresis movement rate after oxidation of low-density lipopotein mediated by addition of copper ion was observed. Results Oxidation of low-density lipoprotein mediated by copper ion was accelerated as the time of action prolonged and the process was accompanied by increased relative electrophoresis movement rate. Oxidation of low-density lipoprotein by copper ion was inhibited significantly in the presence of Xue zhikang as comparied with absence of XuezhiKang at all time points. A greater reduction of reative electrophoresis movement rate up to 33.5%, (P<0.05) was noted. With increase of Xuezhikang concentration, the extent of reduction increased. Conclusion It is shown that human low-density lipoprotein can be oxidized by mediation of copeper ion and XuezhiKang may inbibit the extent of oxidation of low-density lipoprotion by copper ion.
, 百拇医药
【Key words】 Atherosclerosis Lipoproteins, LDL Xuezhikang
动脉粥样硬化(AS)及其引发的心脑血管疾患是当今病人死亡的主要原因。近年来，脂蛋白氧化修饰学说在AS形成的机制中逐渐受到重视。动脉血管内膜下低密度脂蛋白(LDL) 发生氧化修饰是AS形成的关键过程。我们通过体外实验的方法观察了LDL氧化 修饰过程和血脂康的对其影响，探讨了血脂康抗AS的可能理论依据。
材料和方法
一、材料
健康成人献血员全血，用EDTA抗凝抗氧化。血脂康原粉 (北大维信科技有限公司产品)，溶于浓度为99.5%的二甲基亚砜(DMSO)中。超速离心机及Ti80转头为BeCkman公司产品，琼脂糖为进口分装，其余试剂等均为国产，分析纯。
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二、方法
1.LDL的制备及体外氧化修饰：按密度梯度序列超速离心法在健康成人献血员血浆中进行[1]，其中蛋白含量根据Lowry法测定，LDL体外氧化修饰按酮离子(Cu2+) 介导法[2]测定氧化修饰的LDL(OX-LDL) 在0.5%琼脂糖凝胶上相对电泳迁移率(REM)[3]，即OX-LDL电泳距离和非氧化LDL的电 泳距离之比的变化，判断其氧化修饰的程度。
2.血脂康对LDL氧化修饰的影响：在Cu2+介导LDL氧化修饰的过程中，分别加入不同浓度的血脂康(0～10 mg/ml)，作用18小时，或同一浓度的血脂康(5 mg/ml)，作用不同时间(0～48小时)，测定其REM，观察血脂康对Cu2+介导LDL氧化修饰后REM的变化。
3.统计分析：采用SAS软件，对数据进行配伍组设计方差分析。
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结果
1.在Cu2+介导组中，随着作用时间延长，LDL的REM增大，表明Cu2+在体外可以介导LDL发生氧化修饰。当加入终浓度为5 mg/ml的血脂康(药物组)后，其REM在各时间点均较对照组为低。经配伍组设计方差分析，两组相比(SNK法) 差异有显著性(P<0.05)，见表1。
表1 不同作用时间介导组和药物组氧化修饰的变化 时间
(小时)
介导组
(REM)
药物组
(REM)
, 百拇医药
抑制率
(%)
8
2.00
1.77
11.5
12
2.15
1.77
17.6
24
2.54
1.69
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33.5
36
2.58
1.90
23.6
48
2.75
2.00
27.3
注：REM：相对电泳迁移率 介导组无血脂康，药物组血脂康终浓度为5 mg/ml
2.血脂康浓度对LDL氧化修饰的影响：在Cu2+介导LDL氧化修饰的过程中，加入不同浓度的血脂康，作用18小时，观察其对LDL REM的变化，发现随血脂康浓度增加，REM变小。二甲基亚砜组中氧化LDL中的REM和无药物时相等，故二甲基亚砜对Cu2+介导LDL氧化的REM无影响。详见表2。
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表2 不同浓度血脂康对低密度脂蛋白氧化修饰的影响
血脂康浓度(mg/ml)
0
0.25
0.5
1
2.5
5
10
REM
2.4
2.4
2.2
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2.2
2.0
2.0
1.9
抑制率(%)
0
0
8.3
8.3
16.7
16.7
20
注：REM：相对电泳迁移率；二甲基亚砜对照组REM为2.4，抑制率为0讨论
, 百拇医药
既往研究LDL的氧化修饰，主要集中在动脉壁细胞对LDL的氧化作用[4]。目前认为LDL的氧化主要发生在血管内膜下，超氧阴离子可能在此过程中发挥重大作用，一些酶如磷酯酸A2或细胞分泌的活性成分在此过程中亦起一定的作用。在体外Cu2+和LDL结合后，使LDL中的脂质成分被氧化，产生丙二醛或4-羟基壬烯醛等，载脂蛋白B(ApoB) 中碱性氨基酸如赖氨酸被修饰和分子重排，聚积带有更多的负电荷；氧化程度越重，所带负电荷越多。本研究结果表明，Cu2+在体外确能介导LDL发生氧化，且随时间延长，氧化程度加重。LDL氧化后形成氧化LDL(OX-LDL) ，OX-LDL可促进血管平滑肌细胞增殖移行，趋化吸附淋巴-单核细胞到血管内膜下，分化成巨噬细胞，两者通过其表面的清道夫受体(SR)摄取OX-LDL，造成细胞内脂质沉积，形成泡沫细胞，后者是AS早期特征。
国外大型临床干预试验证实，他汀类调脂药在有效降低血脂的同时，能显著地减少心脑血管临床疾患的发生。其主要原因可能与他汀类调脂药能阻止动脉粥样斑块的进展，使斑块稳定有关。血脂康是从红曲菌中提取的，含有多种有效成分的调脂药，全国多中心“血脂康”扩大临床验证已证实其具有高效、安全，能降低总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯，升高高密度脂蛋白胆固醇的功效。本研究探讨了血脂康对在促进AS形成初始过程中起关键作用的LDL氧化修饰的影响，结果发现当氧化时间固定(18小时)时，随血脂康浓度的增加，对LDL氧化程度抑制作用亦增强，表现为REM变小。若血脂康浓度不变，则随氧化时间延长，血脂康对铜离子介导LDL氧化的相对电泳迁移率抑制增大，24小时达峰值，最大抑制率为33.5%。国外文献报道洛伐他汀抑制LDL氧化修饰[5]以硫代巴比妥酸反应物测量法(TBARS)测定值计算，24小时下降大约21%。 本研究所用血脂康中含洛伐他汀量和国外文献中洛伐他汀含量相等，氧化条件相同。血脂康抑制LDL氧化的主要机制可能有：(1) 所含的洛伐他汀直接和LDL结合，改变其脂质流动性，增加LDL对氧化剂的耐受性；通过和自由基、转金属离子等相结合，阻止其攻击LDL，失去氧化LDL中脂质的作用。(2) 含有异黄酮样物质和微量元素Se等抗氧化物。
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本研究结果表明，血脂康除了具有调节血脂作用外，尚有抑制LDL氧化作用，从而为使用该药预防AS的发生发展，提供了实验依据。
参考文献
1 陈琪，蔡海江，范乐明，等.人血 浆低密度脂蛋白亚组分氧化反应敏感性的比较.生物化学与生物物理学报，1994,26:271-275.
2 Lougheed M, Steinbrecher U. Mechanism of uptake of Copper- oxidized low-density lipoprotein in macrophages is dependenton its extent of oxidation. J Biol chem,1996,271:17798-11805.
3 Chen Q, Esterbauen H,Jurgegns G. Studies on epitopes on low- density lipoprotein modified by 4-hydroxynonenal. Biochemical characterization and determin- ation. Biochem J,1992, 288:249- 254.
, http://www.100md.com
4 Parthasarathy S, Steinberg D. Cell-induced oxidation of LDL. Curr Opin Lipidol,1992,3:313- 317.
5 Aviram M, Damkner G,Cogan U,et al. Lovastatin inbibits Low- density lipoprotein oxidation and alters its fludity and uptake by macrophages in vitro and in vivo studies.Metabolism, 1992,41:229-235.
(收稿：1999-01-12 修回：1999-05-28), 百拇医药
单位：210029 南京医科大学第一附属医院
关键词：动脉粥样硬化；脂蛋白类，LDL；血脂康
中华内科杂志990805 【摘 要】 目的 探讨血脂康对人低密度脂蛋白体外氧化修饰的影响。方法 通过体外实验，观察血脂康对铜离子介导人低密度脂蛋白氧化修饰后相对电泳迁移率的变化。结果 低密度脂蛋白在体外铜离子介导下，随作用时间延长，其相对电泳迁移率增大，表明铜离子可诱导低密度脂蛋白发生氧化修饰。当加入血脂康后，氧化低密度脂蛋白的相对电泳迁移率各时间点均较对照组低，两组相比，P<0.05，最大抑制率24小时达峰值，为33.5%。当加入不同浓度血脂康作用18小时，随血脂康浓度增加，其氧化低密度脂蛋白的相对电泳迁移率变小，抑制加强。结论 铜离子在体外能介导低密度脂蛋白氧化，随时间延长，氧化程度加重；血脂康能抑制铜离子介导的低密度脂蛋白氧化，随血脂康浓度增加，抑制加强。
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The effect of Xuezhikang on oxidation of low-density lipoproteins in virto
XU Baoping, CHENG WenLing, LU Xing.
The First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To study the effect of Xuezhikang on oxidation of human low-density lipoprotein. Methods In vitro experiment was used to study the effect of Xuezhikang on the change of human low-density lipoprotein. Relative electrophoresis movement rate after oxidation of low-density lipopotein mediated by addition of copper ion was observed. Results Oxidation of low-density lipoprotein mediated by copper ion was accelerated as the time of action prolonged and the process was accompanied by increased relative electrophoresis movement rate. Oxidation of low-density lipoprotein by copper ion was inhibited significantly in the presence of Xue zhikang as comparied with absence of XuezhiKang at all time points. A greater reduction of reative electrophoresis movement rate up to 33.5%, (P<0.05) was noted. With increase of Xuezhikang concentration, the extent of reduction increased. Conclusion It is shown that human low-density lipoprotein can be oxidized by mediation of copeper ion and XuezhiKang may inbibit the extent of oxidation of low-density lipoprotion by copper ion.
, 百拇医药
【Key words】 Atherosclerosis Lipoproteins, LDL Xuezhikang
动脉粥样硬化(AS)及其引发的心脑血管疾患是当今病人死亡的主要原因。近年来，脂蛋白氧化修饰学说在AS形成的机制中逐渐受到重视。动脉血管内膜下低密度脂蛋白(LDL) 发生氧化修饰是AS形成的关键过程。我们通过体外实验的方法观察了LDL氧化 修饰过程和血脂康的对其影响，探讨了血脂康抗AS的可能理论依据。
材料和方法
一、材料
健康成人献血员全血，用EDTA抗凝抗氧化。血脂康原粉 (北大维信科技有限公司产品)，溶于浓度为99.5%的二甲基亚砜(DMSO)中。超速离心机及Ti80转头为BeCkman公司产品，琼脂糖为进口分装，其余试剂等均为国产，分析纯。
, 百拇医药
二、方法
1.LDL的制备及体外氧化修饰：按密度梯度序列超速离心法在健康成人献血员血浆中进行[1]，其中蛋白含量根据Lowry法测定，LDL体外氧化修饰按酮离子(Cu2+) 介导法[2]测定氧化修饰的LDL(OX-LDL) 在0.5%琼脂糖凝胶上相对电泳迁移率(REM)[3]，即OX-LDL电泳距离和非氧化LDL的电 泳距离之比的变化，判断其氧化修饰的程度。
2.血脂康对LDL氧化修饰的影响：在Cu2+介导LDL氧化修饰的过程中，分别加入不同浓度的血脂康(0～10 mg/ml)，作用18小时，或同一浓度的血脂康(5 mg/ml)，作用不同时间(0～48小时)，测定其REM，观察血脂康对Cu2+介导LDL氧化修饰后REM的变化。
3.统计分析：采用SAS软件，对数据进行配伍组设计方差分析。
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结果
1.在Cu2+介导组中，随着作用时间延长，LDL的REM增大，表明Cu2+在体外可以介导LDL发生氧化修饰。当加入终浓度为5 mg/ml的血脂康(药物组)后，其REM在各时间点均较对照组为低。经配伍组设计方差分析，两组相比(SNK法) 差异有显著性(P<0.05)，见表1。
表1 不同作用时间介导组和药物组氧化修饰的变化 时间
(小时)
介导组
(REM)
药物组
(REM)
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抑制率
(%)
8
2.00
1.77
11.5
12
2.15
1.77
17.6
24
2.54
1.69
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33.5
36
2.58
1.90
23.6
48
2.75
2.00
27.3
注：REM：相对电泳迁移率 介导组无血脂康，药物组血脂康终浓度为5 mg/ml
2.血脂康浓度对LDL氧化修饰的影响：在Cu2+介导LDL氧化修饰的过程中，加入不同浓度的血脂康，作用18小时，观察其对LDL REM的变化，发现随血脂康浓度增加，REM变小。二甲基亚砜组中氧化LDL中的REM和无药物时相等，故二甲基亚砜对Cu2+介导LDL氧化的REM无影响。详见表2。
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表2 不同浓度血脂康对低密度脂蛋白氧化修饰的影响
血脂康浓度(mg/ml)
0
0.25
0.5
1
2.5
5
10
REM
2.4
2.4
2.2
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2.2
2.0
2.0
1.9
抑制率(%)
0
0
8.3
8.3
16.7
16.7
20
注：REM：相对电泳迁移率；二甲基亚砜对照组REM为2.4，抑制率为0讨论
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既往研究LDL的氧化修饰，主要集中在动脉壁细胞对LDL的氧化作用[4]。目前认为LDL的氧化主要发生在血管内膜下，超氧阴离子可能在此过程中发挥重大作用，一些酶如磷酯酸A2或细胞分泌的活性成分在此过程中亦起一定的作用。在体外Cu2+和LDL结合后，使LDL中的脂质成分被氧化，产生丙二醛或4-羟基壬烯醛等，载脂蛋白B(ApoB) 中碱性氨基酸如赖氨酸被修饰和分子重排，聚积带有更多的负电荷；氧化程度越重，所带负电荷越多。本研究结果表明，Cu2+在体外确能介导LDL发生氧化，且随时间延长，氧化程度加重。LDL氧化后形成氧化LDL(OX-LDL) ，OX-LDL可促进血管平滑肌细胞增殖移行，趋化吸附淋巴-单核细胞到血管内膜下，分化成巨噬细胞，两者通过其表面的清道夫受体(SR)摄取OX-LDL，造成细胞内脂质沉积，形成泡沫细胞，后者是AS早期特征。
国外大型临床干预试验证实，他汀类调脂药在有效降低血脂的同时，能显著地减少心脑血管临床疾患的发生。其主要原因可能与他汀类调脂药能阻止动脉粥样斑块的进展，使斑块稳定有关。血脂康是从红曲菌中提取的，含有多种有效成分的调脂药，全国多中心“血脂康”扩大临床验证已证实其具有高效、安全，能降低总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯，升高高密度脂蛋白胆固醇的功效。本研究探讨了血脂康对在促进AS形成初始过程中起关键作用的LDL氧化修饰的影响，结果发现当氧化时间固定(18小时)时，随血脂康浓度的增加，对LDL氧化程度抑制作用亦增强，表现为REM变小。若血脂康浓度不变，则随氧化时间延长，血脂康对铜离子介导LDL氧化的相对电泳迁移率抑制增大，24小时达峰值，最大抑制率为33.5%。国外文献报道洛伐他汀抑制LDL氧化修饰[5]以硫代巴比妥酸反应物测量法(TBARS)测定值计算，24小时下降大约21%。 本研究所用血脂康中含洛伐他汀量和国外文献中洛伐他汀含量相等，氧化条件相同。血脂康抑制LDL氧化的主要机制可能有：(1) 所含的洛伐他汀直接和LDL结合，改变其脂质流动性，增加LDL对氧化剂的耐受性；通过和自由基、转金属离子等相结合，阻止其攻击LDL，失去氧化LDL中脂质的作用。(2) 含有异黄酮样物质和微量元素Se等抗氧化物。
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本研究结果表明，血脂康除了具有调节血脂作用外，尚有抑制LDL氧化作用，从而为使用该药预防AS的发生发展，提供了实验依据。
参考文献
1 陈琪，蔡海江，范乐明，等.人血 浆低密度脂蛋白亚组分氧化反应敏感性的比较.生物化学与生物物理学报，1994,26:271-275.
2 Lougheed M, Steinbrecher U. Mechanism of uptake of Copper- oxidized low-density lipoprotein in macrophages is dependenton its extent of oxidation. J Biol chem,1996,271:17798-11805.
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5 Aviram M, Damkner G,Cogan U,et al. Lovastatin inbibits Low- density lipoprotein oxidation and alters its fludity and uptake by macrophages in vitro and in vivo studies.Metabolism, 1992,41:229-235.
(收稿：1999-01-12 修回：1999-05-28), 百拇医药