R-苯异丙基腺苷对气道上皮细胞一氧化氮及其合酶基因表达的影响
作者：李荣 张珍祥 彭则
单位：430030 武汉，同济医科大学同济医院呼吸系病研究室
关键词：
中华内科杂志990918 气道上皮细胞在支气管哮喘发病和治疗有重要地位，一氧化氮(NO)为内皮源性舒张因子,具有舒张气道平滑肌的作用。腺苷在心血管系统的研究已广泛深入，在肺脏的作用报道较少。本研究通过腺苷受体激动剂R-苯异丙基腺苷(R-PIA)对气道上皮细胞一氧化氮合酶(NOS)mRNA表达及NO生成的影响，探讨R-PIA在气道上皮的作用。
一、材料与方法
1.气道上皮细胞的培养方法：基础疾病为中央型肺癌患者20例，在行纤维支气管镜检查的同时经患者同意，取其正常部位的气道上皮细胞，每人取4～6小块，用1%青、链霉素(双抗)的无菌Hank液反复冲洗后，置于2% dispase(Gibco公司)、5 mmol/L二硫苏糖醇(Sigma公司)、25 mmol/L Hepes (Sigma公司)、1%双抗的Hank液中,放入5% CO2、100%湿度的CO2培养箱孵育2～3小时孵化，然后贴附2小时，除去巨噬细胞及成纤维细胞,收集上清液，离心取沉淀。用10%胎牛血清(Gibco公司)、1%双抗、25 μg/L表皮生长因子(Sigma公司)、5 ng/L转铁蛋白(Sigma公司)的DMEM(Gibco公司)培养液调整细胞浓度为每升5×108个,用锥虫蓝染色断细胞活率,活率>99%。然后置于细胞培养板进行细胞培养。
, 百拇医药
2.气道上皮细胞免疫组化：用鼠抗人细胞角质素单克隆抗体，采用SP法免疫组化试剂盒检查所培养的气道上皮细胞爬片。定量计数细胞200个，计算气道上皮细胞纯度。
3.实验步骤：将培养的气道上皮随机分为2组，常规制作细胞爬片。对照组：10例，置于CO2培养箱，37℃,72小时后离心收获上清液和细胞,-70℃冷藏，准备测NO、环磷酸腺苷(cAMP)含量。并处理细胞爬片，-70℃冷藏,准备做原位杂交。R-PIA组：10例，加入R-PIA(Sigma)，使细胞培养上清浓度为10-7 mol/L,置于CO2培养箱中，37℃，72小时后离心收获上清和细胞,处理细胞爬片方法同上。(1)原位杂交和图像分析：NOS(cDNA)探针,地高辛随机引物标记检测试剂盒(德国宝灵曼公司)，阴性对照以未标记的探针代替。将原位杂交切片进行灰度扫描,以对照组灰度为1，分别记录对照组和R-PIA组气道上皮细胞内NOS mRNA表达相对强度。(2)细胞上清液NO测定采用北京邦定生物医学公司NO测试盒，细胞cAMP测定采用上海中医药大学同位素室125 I-cAMP RIA Kit放免药盒，具体操作见说明书。
, http://www.100md.com
4.统计学方法：采用t检验。
二、结果
1.气道上皮细胞免疫组化显示，细胞浆呈现黄色，呈阳性反应，证实所培养的细胞确为气道上皮细胞。阳性细胞的百分率为98%以上(计数200个细胞)。
2.原位杂交结果显示，对照组气道上皮细胞内有NOS mRNA表达,而R-PIA组气道上皮细胞内NOS mRNA表达明显减弱(P<0.01)，见图1，2。
图1 气道上皮细胞内有一氧化氮合酶mRNA表达
, http://www.100md.com
图2 气道上皮细胞内一氧化氮合酶mRNA表达减弱 均为原位杂交×200
3.R-PIA对气道上皮细胞NOS mRNA表达、细胞NO、cAMP含量的影响：见表1。
表1 R-PIA对气道上皮细胞NOS mRNA表达、细胞一氧化氮、环磷酸腺苷含量的影响(
±s) 组别
例数
NOS mRNA
表达强度
一氧化氮
(μmol/L)
环磷酸腺苷
, 百拇医药
(pmol/mg蛋白)
对照组
10
1.08±0.22
2.54±0.22
40.18±8.37
R-PIA组
10
0.69±0.12*
0.95±0.12*
26.47±5.31*
, http://www.100md.com
注：R-PIA：R-苯异丙基腺苷；NOS：一氧化氮合酶 与对照组比较，*P<0.01 讨论 腺苷为能量代谢的中间产物，是ATP代谢产物5′AMP在细胞内经5′核苷酸酶脱磷酸产生，主要存在于血管内皮细胞、心肌细胞、肾上腺素能、嘌呤能神经元中。腺苷半衰期短(<10秒)，为缺氧时局部代谢产生的一种调节性物质，具有扩张冠脉、调节和改善心肌细胞氧供和代谢平衡功能。研究发现腺苷能抑制呼吸中枢，兴奋外周化学感受器，这两种作用的相对强弱决定最终呼吸效应。腺甘和5′AMP均可以引起气管、支气管收缩反应。哮喘患者吸入腺苷也立即导致支气管收缩反应，1秒钟用力呼气容积下降，而氨茶碱可以对抗腺苷的收缩作用。
气管、支气管上存在两种腺苷受体A1和A2，A1具有抑制腺苷酸环化酶的作用，A2具有激活腺苷酸环化酶的作用，R-PIA为A1受体激动剂，其作用A1大于A2。本研究发现R-PIA具有抑制气道上皮细胞NOS mRNA表达和NO生成的作用，这与文献[1]报道一致。NO具有舒张气道平滑肌的作用，而cAMP具有稳定支气管平滑肌膜电位、抑制组胺、慢反应物质释放的作用。本研究发现，R-PIA导致气道上皮细胞cAMP生成下降,是否是由于ATP代谢为cAMP、cAMP代谢为5′AMP、5′AMP代谢为腺苷的环路中，R-PIA为腺苷类似物,发生负反馈作用,或腺苷直接激动A1受体，抑制腺苷酸环化酶，目前还不清楚，尚需深入研究。研究发现培养的犬气道上皮细胞中NO释放，伴随细胞内cAMP增加，认为NO释放与cAMP有密切联系[2]。本研究也发现给予R-PIA，人气道上皮细胞NO生成下降伴随cAMP下降，进而认为cAMP可能对气道上皮细胞NO释放有重要作用[3]。
, 百拇医药
R-PIA在心血管的作用[4]与在气道的作用不同,R-PIA在气道上皮细胞中抑制了NOS mRNA表达，降低了NO和cAMP的生成，推测R-PIA也是一种支气管哮喘收缩性物质。
参考文献
[1] Hon WM, Khoo HE, Ngoi SS, et al. Effects of adenosine receptor agonists on nitric oxide release in mouse during endotoxemia. Biochem Pharmacol, 1995,50:45-57.
[2] Tamaoki J, Kondo M,Takemura H,et al. Cyclic adenosine monophosphate-mediated release of nitric oxide from canine cultured tracheal epithelium. Am J Respir Crit Care Med, 1995,152(4 Pt 1):1325-1330.
, 百拇医药
[3] Mullet D, Fertel RH, Kniss D, et al. An increase in intracellular cyclic AMP modulates nitric oxide production in IFN-gamma-treated macrophages. J Immunol, 1997,158:897-904.
[4] 李小鹰,郑华光,刘玲玲,等.腺苷A1受体激动剂对兔心肌缺血-再灌注一氧化氮及其合酶基因表达的影响.中华心血管病杂志,1996, 24:139-142.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-05-20), 百拇医药
单位：430030 武汉，同济医科大学同济医院呼吸系病研究室
关键词：
中华内科杂志990918 气道上皮细胞在支气管哮喘发病和治疗有重要地位，一氧化氮(NO)为内皮源性舒张因子,具有舒张气道平滑肌的作用。腺苷在心血管系统的研究已广泛深入，在肺脏的作用报道较少。本研究通过腺苷受体激动剂R-苯异丙基腺苷(R-PIA)对气道上皮细胞一氧化氮合酶(NOS)mRNA表达及NO生成的影响，探讨R-PIA在气道上皮的作用。
一、材料与方法
1.气道上皮细胞的培养方法：基础疾病为中央型肺癌患者20例，在行纤维支气管镜检查的同时经患者同意，取其正常部位的气道上皮细胞，每人取4～6小块，用1%青、链霉素(双抗)的无菌Hank液反复冲洗后，置于2% dispase(Gibco公司)、5 mmol/L二硫苏糖醇(Sigma公司)、25 mmol/L Hepes (Sigma公司)、1%双抗的Hank液中,放入5% CO2、100%湿度的CO2培养箱孵育2～3小时孵化，然后贴附2小时，除去巨噬细胞及成纤维细胞,收集上清液，离心取沉淀。用10%胎牛血清(Gibco公司)、1%双抗、25 μg/L表皮生长因子(Sigma公司)、5 ng/L转铁蛋白(Sigma公司)的DMEM(Gibco公司)培养液调整细胞浓度为每升5×108个,用锥虫蓝染色断细胞活率,活率>99%。然后置于细胞培养板进行细胞培养。
, 百拇医药
2.气道上皮细胞免疫组化：用鼠抗人细胞角质素单克隆抗体，采用SP法免疫组化试剂盒检查所培养的气道上皮细胞爬片。定量计数细胞200个，计算气道上皮细胞纯度。
3.实验步骤：将培养的气道上皮随机分为2组，常规制作细胞爬片。对照组：10例，置于CO2培养箱，37℃,72小时后离心收获上清液和细胞,-70℃冷藏，准备测NO、环磷酸腺苷(cAMP)含量。并处理细胞爬片，-70℃冷藏,准备做原位杂交。R-PIA组：10例，加入R-PIA(Sigma)，使细胞培养上清浓度为10-7 mol/L,置于CO2培养箱中，37℃，72小时后离心收获上清和细胞,处理细胞爬片方法同上。(1)原位杂交和图像分析：NOS(cDNA)探针,地高辛随机引物标记检测试剂盒(德国宝灵曼公司)，阴性对照以未标记的探针代替。将原位杂交切片进行灰度扫描,以对照组灰度为1，分别记录对照组和R-PIA组气道上皮细胞内NOS mRNA表达相对强度。(2)细胞上清液NO测定采用北京邦定生物医学公司NO测试盒，细胞cAMP测定采用上海中医药大学同位素室125 I-cAMP RIA Kit放免药盒，具体操作见说明书。
, http://www.100md.com
4.统计学方法：采用t检验。
二、结果
1.气道上皮细胞免疫组化显示，细胞浆呈现黄色，呈阳性反应，证实所培养的细胞确为气道上皮细胞。阳性细胞的百分率为98%以上(计数200个细胞)。
2.原位杂交结果显示，对照组气道上皮细胞内有NOS mRNA表达,而R-PIA组气道上皮细胞内NOS mRNA表达明显减弱(P<0.01)，见图1，2。
图1 气道上皮细胞内有一氧化氮合酶mRNA表达
, http://www.100md.com
图2 气道上皮细胞内一氧化氮合酶mRNA表达减弱 均为原位杂交×200
3.R-PIA对气道上皮细胞NOS mRNA表达、细胞NO、cAMP含量的影响：见表1。
表1 R-PIA对气道上皮细胞NOS mRNA表达、细胞一氧化氮、环磷酸腺苷含量的影响(
±s) 组别例数
NOS mRNA
表达强度
一氧化氮
(μmol/L)
环磷酸腺苷
, 百拇医药
(pmol/mg蛋白)
对照组
10
1.08±0.22
2.54±0.22
40.18±8.37
R-PIA组
10
0.69±0.12*
0.95±0.12*
26.47±5.31*
, http://www.100md.com
注：R-PIA：R-苯异丙基腺苷；NOS：一氧化氮合酶 与对照组比较，*P<0.01 讨论 腺苷为能量代谢的中间产物，是ATP代谢产物5′AMP在细胞内经5′核苷酸酶脱磷酸产生，主要存在于血管内皮细胞、心肌细胞、肾上腺素能、嘌呤能神经元中。腺苷半衰期短(<10秒)，为缺氧时局部代谢产生的一种调节性物质，具有扩张冠脉、调节和改善心肌细胞氧供和代谢平衡功能。研究发现腺苷能抑制呼吸中枢，兴奋外周化学感受器，这两种作用的相对强弱决定最终呼吸效应。腺甘和5′AMP均可以引起气管、支气管收缩反应。哮喘患者吸入腺苷也立即导致支气管收缩反应，1秒钟用力呼气容积下降，而氨茶碱可以对抗腺苷的收缩作用。
气管、支气管上存在两种腺苷受体A1和A2，A1具有抑制腺苷酸环化酶的作用，A2具有激活腺苷酸环化酶的作用，R-PIA为A1受体激动剂，其作用A1大于A2。本研究发现R-PIA具有抑制气道上皮细胞NOS mRNA表达和NO生成的作用，这与文献[1]报道一致。NO具有舒张气道平滑肌的作用，而cAMP具有稳定支气管平滑肌膜电位、抑制组胺、慢反应物质释放的作用。本研究发现，R-PIA导致气道上皮细胞cAMP生成下降,是否是由于ATP代谢为cAMP、cAMP代谢为5′AMP、5′AMP代谢为腺苷的环路中，R-PIA为腺苷类似物,发生负反馈作用,或腺苷直接激动A1受体，抑制腺苷酸环化酶，目前还不清楚，尚需深入研究。研究发现培养的犬气道上皮细胞中NO释放，伴随细胞内cAMP增加，认为NO释放与cAMP有密切联系[2]。本研究也发现给予R-PIA，人气道上皮细胞NO生成下降伴随cAMP下降，进而认为cAMP可能对气道上皮细胞NO释放有重要作用[3]。
, 百拇医药
R-PIA在心血管的作用[4]与在气道的作用不同,R-PIA在气道上皮细胞中抑制了NOS mRNA表达，降低了NO和cAMP的生成，推测R-PIA也是一种支气管哮喘收缩性物质。
参考文献
[1] Hon WM, Khoo HE, Ngoi SS, et al. Effects of adenosine receptor agonists on nitric oxide release in mouse during endotoxemia. Biochem Pharmacol, 1995,50:45-57.
[2] Tamaoki J, Kondo M,Takemura H,et al. Cyclic adenosine monophosphate-mediated release of nitric oxide from canine cultured tracheal epithelium. Am J Respir Crit Care Med, 1995,152(4 Pt 1):1325-1330.
, 百拇医药
[3] Mullet D, Fertel RH, Kniss D, et al. An increase in intracellular cyclic AMP modulates nitric oxide production in IFN-gamma-treated macrophages. J Immunol, 1997,158:897-904.
[4] 李小鹰,郑华光,刘玲玲,等.腺苷A1受体激动剂对兔心肌缺血-再灌注一氧化氮及其合酶基因表达的影响.中华心血管病杂志,1996, 24:139-142.
(收稿：1998-12-09 修回：1999-05-20), 百拇医药