阿奇霉素对肺间质纤维化大鼠干预作用的研究
作者：陈建 何冰 李永春 王广发 章巍
单位：
关键词：肺纤维化；NF-κB；阿奇霉素
中华内科杂志991009 【摘要】 目的 探讨阿奇霉素对博莱霉素所致大鼠肺间质纤维化的干预作用及机制。方法 雄性Wistar大鼠42只，分为3组。博莱霉素模型组：18只，大鼠气管内一次性注入博莱霉素5mg/kg，制成肺间质纤维化模型；阿奇霉素治疗组：18只，模型制备同博莱霉素模型组，模型制备2小时后，经胃管注入阿奇霉素80 mg/kg，每日1次，每周连续3日。两组动物于1、2和4周处死。对照组：6只，大鼠气管内注入生理盐水0.5 ml，1周后处死。各组动物处死后提取肺组织，作HE染色、Masson染色进行病理半定量分析，并作肿瘤坏死因子(TNF)α和转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达及支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白水平的测定。肺泡巨噬细胞作核因子κB(NF-κB)活性、TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达及蛋白测定。NF-κB活性测定用凝胶迁移率法，mRNA表达用Northern杂交法，蛋白水平的测定用ELISA方法。结果 病理结果显示，阿奇霉素治疗1、2和4周时肺泡炎、纤维化病变均较博莱霉素模型组好转。博莱霉素1、2周时肺组织TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达均较正常组织增高，BALF中其蛋白水平也相应增高，阿奇霉素治疗组上述测定结果均较博莱霉素模型组有所降低(P<0.05)。博莱霉素1周时肺泡巨噬细胞NF-κB活性较对照组明显增高，阿奇霉素治疗1周时其活性明显降低(67.2%)，其TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达及蛋白水平测定与肺组织有一致的变化。结论 阿奇霉素通过抑制NF-κB活性，减少了TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达及蛋白产生，使炎症及纤维化病变减轻，是其治疗肺间质纤维化的机制之一。
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An experimental study on the effect of azithromycin treatment in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats
HEN Jian，HE Bing，LI Yongchun , et al.
Department of Pulmonary Medicine，The First Hospital，Beijing Medical University，Beijing 100034
【Abstract】 Objective To evaluate the therapeutic effects and mechanism of azithromycin treatment in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats. Methods Animal model of bleomycin-A5-induced pulmonary fibrosis was established in rats.36 animal models were divided into two groups: a bleomycin-induced pulmonary fibrosis group and a azithromycin group in which the animal models were treated with azithromycin (80 mg/kg once a day for three continuous days in a week). The animals of the two groups were killed at the first,second and fourth week respectively.Another six rats constituted a normal control group, instillated withsaline intratracheally and killed at the first week. Pathological changes activity of nuclear factor κB (NF-κB) of alveolar macrophage, cytokine tumor necrosis factor (TNF)α、transforming growth factor-β (TGF-β)mRNA expression and protein levels of alveolar macrophage and lung tissue were studied or measured. Results Amelioration of alveolitis and lung fibrosis after treatment with azithromycin was shown in pathological section(P<0.05). The activity of NF-κB was significantly higher in one-week pulmonary fibrosis model than that in normal control and its level in alveolar macrophage reduced (67.2%) after treatment with azithromycin. The level of protein and mRNA of TNFα、TGF-β in lung tissue and alveolar macrophage was increased in the early stage of pulmonary fibrosis and reduced after treatment with azithromycin(P<0.05). Conclusion It is suggested that azithromycin might be a therapeutic drug for pulmonary fibrosis in the future. Azithromycin reduced the degree of alveolitis and fibrosis through inhibition of the activity of NF-κB and the expression of TNFα、TGF-β mRNA and lowering the level of protein in alveolar macrophage and lung tissue in the early stage of pulmonary fibrosis . This might be one of the mechanisms of azithromycin treatment in pulmonary fibrosis.
, 百拇医药
【Key words】 Pulmonary fibrosis NF-kappa B Azithromycin
目前肺间质纤维化的发病机制尚未完全明了，近年来该病发生有增多趋势，临床疗效差，患者往往因呼吸衰竭而死亡。近年来的研究表明，阿奇霉素除抗菌作用外，还具有抗炎作用[1]。本研究建立大鼠肺纤维化模型，观察阿奇霉素的疗效并探讨其机制，现将结果报告如下。
材料和方法
一、材料
雄性Wistar大鼠(北京医科大学实验动物中心提供)42只，体重200～250 g。分为3组，博莱霉素模型组(A组)：18只，经乙醚麻醉，气管插管，气管内一次性注入博莱霉素A5(天津太河制药有限公司)5mg/kg，制成肺间质纤维化模型,动物分别于1、2和4周处死；阿奇霉素治疗组(B组)：18只，模型制备同博莱霉素模型组，模型制备2小时后，经胃管注入阿奇霉素(辉瑞制药有限公司)80 mg/kg(经注射用水稀释)，每日1次，每周连续用3日。动物分别于1(胃管注入阿奇霉素，每日1次，每周连续用3日，用1周)、2(胃管注入阿奇霉素，每日1次，每周连续用3日，连续用2周)和4周(胃管注入阿奇霉素，每日1次，每周连续3日，连续用4周)处死。对照组：6只，气管插管内注入生理盐水0.5 ml，1周后处死。各组动物处死后提取肺组织，行病理HE染色，Masson染色，作肿瘤坏死因子(TNF)α和转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达及支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白水平测定。肺泡巨噬细胞作核因子κB(NF-κB)活性测定、TNFα和TGF-β mRNA表达及蛋白水平测定。
, 百拇医药
二、观察指标及方法
1.病理观察：各组动物取右上肺标本行HE染色，Masson染色，根据Szapiel等[2]提供的方法，确定肺泡炎(HE染色)及肺纤维化(Masson染色)程度，进行病理半定量分析。肺泡炎分级：0级：无肺泡炎；1级：轻度肺泡炎，病变范围局限在全肺20%以下；2级：中度肺泡炎，病变范围占全肺20%～50%；3级：弥漫性肺泡炎，病变范围大于50%。肺间质纤维化分级：0级：无肺间质纤维化；1级：轻度肺间质纤维化，病变范围局限在全肺20%以下；2级：中度肺间质纤维化，病变范围占全肺20%～50%；3级：重度肺间质纤维化，病变范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。
2.NF-κB活性测定：凝胶迁移率法[3]。结果用IBAS-2000图象分析系统测定杂交带的积分吸光度(A)来反映NF-κB活性。NF-κB探针为Promega公司生产。
, 百拇医药
3.TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达：按异硫氰双胍一步法[4]提取细胞及肺组织总RNA。mRNA表达用Northern杂交法[5]测定,设β-actin为内参照。结果用IBAS-2000图象分析系统测定杂交带的A来反映mRNA水平。
4.TNFα蛋白和TGF-β蛋白水平测定采用ELISA法。TNFα ELISA试剂盒为北京帮定公司。TGF-β ELISA试剂盒为深圳晶美公司。
三、统计学方法
采用计算机SPSS软件系统进行F检验和t检验，病理半定量结果采用非参数秩和检验。
结果
一、病理观察
博莱霉素模型组和阿奇霉素治疗组肺泡炎及纤维化病理半定量结果见表1。
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表1 三组肺泡炎及纤维化病理半定量结果 组别
鼠数
(只)
肺泡炎分级
肺间质纤维化分级
0级
1级
2级
3级
0级
1级
2级
3级
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对照组
6
6
0
0
0
6
0
0
0
A组
18
1周
0
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0
1
5
3
2
1
0
2周
0
0
2
4**
1
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3
1
1
4周
0
2
3
1
0
0
2
4
B组
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18
1周
0
2
2
2
4
1
1
0
2周
0
3
, 百拇医药
1
2
3
2
1
0
4周
1
3
2
0
0
3
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3
0
注：与相应的A组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.01 二、肺泡巨噬细胞NF-κB活性，TNFα mRNA、TGF-β mRNA及蛋白水平
肺泡巨噬细胞NF-κB活性，TNFα mRNA、TGF-β mRNA及蛋白水平见表2。博莱霉素1周时肺泡巨噬细胞NF-κB较对照组明显升高，2周时降至正常，4周时降低于正常，阿奇霉素治疗1周时NF-κB活性比博莱霉素1周时明显降低(67.2%)。
Northern杂交显示：正常肺泡巨噬细胞基本不表达TNFα及TGF-β，肺泡巨噬细胞TNFα mRNA及TGF-β mRNA表达在博莱霉素1、2周时明显增高，高峰均位于博莱霉素1周。阿奇霉素治疗1周与博莱霉素1周比较，肺泡巨噬细胞TNFα mRNA及TGF-β mRNA表达分别降低36.6%和30.2%，2周时分别降低32.4%和28.6%。
, 百拇医药
博莱霉素1、2周时巨噬细胞培养上清TNFα、TGF-β蛋白水平较对照组明显增高，差异有显著性，P值均<0.05，其高峰位于1周。阿奇霉素治疗1、2周时TNFα、TGF-β蛋白水平与博莱霉素1、2周时比较均有所降低，差异有显著性，P值均<0.05。
表2 三组巨噬细胞NF-κB活性、TNFα、TGF-β mRNA表达与蛋白测定(
±s) 组别
鼠数
(只)
NF-κB
(A)
TNFα
mRNA
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(A)
TGF-β
mRNA
(A)
TNFα蛋白
(ng/L)
TGF-β蛋白
(ng/L)
对照组
6
20.83±
5.60
-
, 百拇医药
-
129.7±
31.2
202.2±
60.5
A组
18
1周
49.57±
8.60**
12.39±
3.90
13.49±
, 百拇医药
2.90
581.2±
169.8**
634.5±
195.3**
2周
23.76±
9.40
8.44±
1.60
10.49±
2.80
, 百拇医药
328.5±
117.3**
366.1±
43.2**
4周
6.19±
3.20
-
-
144.3±
53.4
242.2±
, 百拇医药
39.9
B组
18
1周
16.29±
9.40*
7.82±
2.60
9.42±
3.70
441.2±
121.7*
, 百拇医药
468.4±
74.2*
2周
15.97±
9.80*
5.71±
1.70
7.49±
2.40
246.7±
34.5*
285.6±
, 百拇医药
56.3*
4周
3.18±
1.20
-
-
129.1±
38.0
231.1±
35.2
注：NF-κB：核因子κB；TNF：肿瘤坏死因子；TGF-β：转化生长因子-β；-为未做 与相应的A组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.05
, 百拇医药
三、肺组织中TNFα和TGF-β mRNA表达
Northern杂交显示：正常肺组织中基本不表达TNFα和TGF-β，肺组织中TNFα和TGF-β mRNA表达在博莱霉素1、2周时明显增高，1周时达高峰，阿奇霉素治疗1周时肺组织TNFα和TGF-β mRNA表达与博莱霉素1周时比较，分别降低36.6%和36.8%，2周分别降低32.4%和39.2%。
四、BALF中TNFα和TGF-β蛋白水平测定
BALF中TNFα和TGF-β蛋白水平测定见表3。表3 BALF中TNFα和TGF-β蛋白测定及肺组织中TNFα和TGF-β mRNA表达(±s) 组别
鼠数
, http://www.100md.com (只)
BALF(×103ng/L)
肺组织(A)
TNFα蛋白
TGF-β蛋白
TNFα
mRNA
TGF-β
mRNA
对照组
6
0.19±
, 百拇医药 0.06
0.35±
0.21
-
-
A组
18
1周
1.61±
0.91**
2.85±
0.68**
16.29±
, 百拇医药
4.60
15.32±
1.90
2周
0.98±
0.19**
1.64±
1.21**
12.49±
1.80
10.06±
0.90
, 百拇医药
4周
0.22±
0.19
0.39±
0.26
-
-
B组
18
1周
1.13±
0.26*
1.97±
, 百拇医药
1.05*
10.33±
1.20
9.68±
2.10
2周
0.65±
0.46*
1.06±
0.46*
8.44±
3.20
, http://www.100md.com
6.12±
1.20
4周
0.23±
0.09
0.29±
0.17
-
-
注：BALF：支气管肺泡灌洗液；TNF：肿瘤坏死因子；TGF-β：转化生长因子-β；-为未做 与相应的A组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.05讨论
肺间质纤维化开始的病理改变是以肺泡炎为主，当肺泡巨噬细胞受到各种刺激物刺激活化后，分泌TNFα、白细胞介素(IL)-1等多种细胞因子，导致炎症反应并刺激成纤维细胞使其过度增生，分泌纤维结素，形成纤维化。NF-κB为DNA结合蛋白，是真核细胞基因转录中的重要的调控因子,具有广泛的生物活性。目前研究表明，NF-κB参与调节免疫反应及炎症过程，NF-κB促进前炎症因子(IL-1, TNFα，IL-6)、趋化因子(IL-8, 巨噬细胞炎症蛋白-1)等炎性基因及TGF-β基因的转录，这些细胞因子[6]在肺泡炎中起重要作用，它们可引起中性粒细胞及巨噬细胞活化，增强中性粒细胞及单核细胞趋化功能，刺激成纤维细胞增殖等。而IL-1、TNFα作为细胞外刺激信号，又可激活NF-κB,进一步放大炎症反应[7，8]。因此，IL-1、TNFα与NF-κB之间造成细胞因子网络中的恶性循环。本研究发现，在博莱霉素A5致肺纤维化模型中，肺泡巨噬细胞NF-κB活性在1周时较对照组明显升高，2周时有所降低，4周时低于正常，这与其调控的炎性因子TNFα以及TGF-β mRNA表达及其蛋白改变的水平是一致的，表明NF-κB在肺间质纤维化中起重要作用。近年研究发现，红霉素及阿奇霉素(十四员及十五员环大环内酯类抗生素)除抗菌作用外，还具有抗炎的作用，试验研究证明阿奇霉素能影响巨噬细胞生长、趋化及吞噬功能[1，9]，红霉素能减缓博莱霉素诱导的肺间质纤维化[10]，而阿奇霉素对肺间质纤维化的疗效及其对核因子κB的作用目前未见报道。我们观察了阿奇霉素治疗博莱霉素A5致肺纤维化模型中肺泡炎及肺纤维化病变均有一定程度的减轻，而在阿奇霉素治疗1周时巨噬细胞NF-κB活性受到抑制,同时巨噬细胞及肺组织TNFα和TGF-β mRNA的表达及蛋白水平均有一定程度降低。阿奇霉素减轻肺纤维化病变的可能机制是其抑制NF-κB活性，阻断了NF-κB与TNFα、TGF-β形成的恶性循环，从而使肺泡炎及纤维化的程度减轻。从本结果看，阿奇霉素治疗肺间质纤维化将是可选用的措施。
, 百拇医药
参考文献
[1] Kobayashi H , Takeda H , Sakayori S , et al . Study on azithromycin in treatment of diffuse panbronchiolitis. Kansenshogaku Zasshi ， 1995，69 : 711-722.
[2] Szapiel SV, Elson NA , Fulmer JD , et al . Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude , athymic mouse . Am Rev Respir Dis, 1979 , 120 : 893-899.
[3] Sundstedt A , Sigvardsson M , Leanderson T , et al . In vivo anergized CD4+ T cells express perturbed AP-1 and NF-kappa B transcription factors. Proc Natl Acad Sci U S A , 1996 , 93 : 979-984.
, 百拇医药
[4] Chomczynski P , Sacchi N . Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem , 1987, 162 : 156-159.
[5] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 分子克隆实验指南. 金冬雁，黎孟枫, 译.第2版.北京：科学出版社， 1989 . 363-371.
[6] Li H , He B , Que C , et al . Expression of TGF-beta 1 , PDGF and IGF-1 mRNA in lung of bleomycin-A5-induced pulmonary fibrosis in rats. Chin Med J , 1996 , 109 : 533-536.
, 百拇医药
[7] Blackwell TS，Christman JW. The role of nuclear factor-kappa B in cytokine gene regulation . Am J Respir Cell Mol Biol ，1997，17：3-9.
[8] Thanos D, Maniatis T . NF-kappa B: a lesson in family values . Cell , 1995 , 80 : 529-532.
[9] Xu G , Fujita J , Negayama K , et al . Effect of macrolide antibiotics on macrophage functions. Microbiol Immunol , 1996 , 40 : 473-479.
[10] Chen B , Jiang L , Zhao W , et al . Ameliorating effect of erythromycin on bleomycin-induced pulmonary fibrosis: role of alveolar macrophage activation and cytokine release . Respirology , 1997 , 2 : 151-155.
(收稿：1999-01-04 修回：1999-05-30), http://www.100md.com
单位：
关键词：肺纤维化；NF-κB；阿奇霉素
中华内科杂志991009 【摘要】 目的 探讨阿奇霉素对博莱霉素所致大鼠肺间质纤维化的干预作用及机制。方法 雄性Wistar大鼠42只，分为3组。博莱霉素模型组：18只，大鼠气管内一次性注入博莱霉素5mg/kg，制成肺间质纤维化模型；阿奇霉素治疗组：18只，模型制备同博莱霉素模型组，模型制备2小时后，经胃管注入阿奇霉素80 mg/kg，每日1次，每周连续3日。两组动物于1、2和4周处死。对照组：6只，大鼠气管内注入生理盐水0.5 ml，1周后处死。各组动物处死后提取肺组织，作HE染色、Masson染色进行病理半定量分析，并作肿瘤坏死因子(TNF)α和转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达及支气管肺泡灌洗液(BALF)蛋白水平的测定。肺泡巨噬细胞作核因子κB(NF-κB)活性、TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达及蛋白测定。NF-κB活性测定用凝胶迁移率法，mRNA表达用Northern杂交法，蛋白水平的测定用ELISA方法。结果 病理结果显示，阿奇霉素治疗1、2和4周时肺泡炎、纤维化病变均较博莱霉素模型组好转。博莱霉素1、2周时肺组织TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达均较正常组织增高，BALF中其蛋白水平也相应增高，阿奇霉素治疗组上述测定结果均较博莱霉素模型组有所降低(P<0.05)。博莱霉素1周时肺泡巨噬细胞NF-κB活性较对照组明显增高，阿奇霉素治疗1周时其活性明显降低(67.2%)，其TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达及蛋白水平测定与肺组织有一致的变化。结论 阿奇霉素通过抑制NF-κB活性，减少了TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达及蛋白产生，使炎症及纤维化病变减轻，是其治疗肺间质纤维化的机制之一。
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An experimental study on the effect of azithromycin treatment in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats
HEN Jian，HE Bing，LI Yongchun , et al.
Department of Pulmonary Medicine，The First Hospital，Beijing Medical University，Beijing 100034
【Abstract】 Objective To evaluate the therapeutic effects and mechanism of azithromycin treatment in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats. Methods Animal model of bleomycin-A5-induced pulmonary fibrosis was established in rats.36 animal models were divided into two groups: a bleomycin-induced pulmonary fibrosis group and a azithromycin group in which the animal models were treated with azithromycin (80 mg/kg once a day for three continuous days in a week). The animals of the two groups were killed at the first,second and fourth week respectively.Another six rats constituted a normal control group, instillated withsaline intratracheally and killed at the first week. Pathological changes activity of nuclear factor κB (NF-κB) of alveolar macrophage, cytokine tumor necrosis factor (TNF)α、transforming growth factor-β (TGF-β)mRNA expression and protein levels of alveolar macrophage and lung tissue were studied or measured. Results Amelioration of alveolitis and lung fibrosis after treatment with azithromycin was shown in pathological section(P<0.05). The activity of NF-κB was significantly higher in one-week pulmonary fibrosis model than that in normal control and its level in alveolar macrophage reduced (67.2%) after treatment with azithromycin. The level of protein and mRNA of TNFα、TGF-β in lung tissue and alveolar macrophage was increased in the early stage of pulmonary fibrosis and reduced after treatment with azithromycin(P<0.05). Conclusion It is suggested that azithromycin might be a therapeutic drug for pulmonary fibrosis in the future. Azithromycin reduced the degree of alveolitis and fibrosis through inhibition of the activity of NF-κB and the expression of TNFα、TGF-β mRNA and lowering the level of protein in alveolar macrophage and lung tissue in the early stage of pulmonary fibrosis . This might be one of the mechanisms of azithromycin treatment in pulmonary fibrosis.
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【Key words】 Pulmonary fibrosis NF-kappa B Azithromycin
目前肺间质纤维化的发病机制尚未完全明了，近年来该病发生有增多趋势，临床疗效差，患者往往因呼吸衰竭而死亡。近年来的研究表明，阿奇霉素除抗菌作用外，还具有抗炎作用[1]。本研究建立大鼠肺纤维化模型，观察阿奇霉素的疗效并探讨其机制，现将结果报告如下。
材料和方法
一、材料
雄性Wistar大鼠(北京医科大学实验动物中心提供)42只，体重200～250 g。分为3组，博莱霉素模型组(A组)：18只，经乙醚麻醉，气管插管，气管内一次性注入博莱霉素A5(天津太河制药有限公司)5mg/kg，制成肺间质纤维化模型,动物分别于1、2和4周处死；阿奇霉素治疗组(B组)：18只，模型制备同博莱霉素模型组，模型制备2小时后，经胃管注入阿奇霉素(辉瑞制药有限公司)80 mg/kg(经注射用水稀释)，每日1次，每周连续用3日。动物分别于1(胃管注入阿奇霉素，每日1次，每周连续用3日，用1周)、2(胃管注入阿奇霉素，每日1次，每周连续用3日，连续用2周)和4周(胃管注入阿奇霉素，每日1次，每周连续3日，连续用4周)处死。对照组：6只，气管插管内注入生理盐水0.5 ml，1周后处死。各组动物处死后提取肺组织，行病理HE染色，Masson染色，作肿瘤坏死因子(TNF)α和转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达及支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白水平测定。肺泡巨噬细胞作核因子κB(NF-κB)活性测定、TNFα和TGF-β mRNA表达及蛋白水平测定。
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二、观察指标及方法
1.病理观察：各组动物取右上肺标本行HE染色，Masson染色，根据Szapiel等[2]提供的方法，确定肺泡炎(HE染色)及肺纤维化(Masson染色)程度，进行病理半定量分析。肺泡炎分级：0级：无肺泡炎；1级：轻度肺泡炎，病变范围局限在全肺20%以下；2级：中度肺泡炎，病变范围占全肺20%～50%；3级：弥漫性肺泡炎，病变范围大于50%。肺间质纤维化分级：0级：无肺间质纤维化；1级：轻度肺间质纤维化，病变范围局限在全肺20%以下；2级：中度肺间质纤维化，病变范围占全肺20%～50%；3级：重度肺间质纤维化，病变范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。
2.NF-κB活性测定：凝胶迁移率法[3]。结果用IBAS-2000图象分析系统测定杂交带的积分吸光度(A)来反映NF-κB活性。NF-κB探针为Promega公司生产。
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3.TNFα mRNA和TGF-β mRNA表达：按异硫氰双胍一步法[4]提取细胞及肺组织总RNA。mRNA表达用Northern杂交法[5]测定,设β-actin为内参照。结果用IBAS-2000图象分析系统测定杂交带的A来反映mRNA水平。
4.TNFα蛋白和TGF-β蛋白水平测定采用ELISA法。TNFα ELISA试剂盒为北京帮定公司。TGF-β ELISA试剂盒为深圳晶美公司。
三、统计学方法
采用计算机SPSS软件系统进行F检验和t检验，病理半定量结果采用非参数秩和检验。
结果
一、病理观察
博莱霉素模型组和阿奇霉素治疗组肺泡炎及纤维化病理半定量结果见表1。
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表1 三组肺泡炎及纤维化病理半定量结果 组别
鼠数
(只)
肺泡炎分级
肺间质纤维化分级
0级
1级
2级
3级
0级
1级
2级
3级
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对照组
6
6
0
0
0
6
0
0
0
A组
18
1周
0
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0
1
5
3
2
1
0
2周
0
0
2
4**
1
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3
1
1
4周
0
2
3
1
0
0
2
4
B组
, http://www.100md.com
18
1周
0
2
2
2
4
1
1
0
2周
0
3
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1
2
3
2
1
0
4周
1
3
2
0
0
3
, 百拇医药
3
0
注：与相应的A组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.01 二、肺泡巨噬细胞NF-κB活性，TNFα mRNA、TGF-β mRNA及蛋白水平
肺泡巨噬细胞NF-κB活性，TNFα mRNA、TGF-β mRNA及蛋白水平见表2。博莱霉素1周时肺泡巨噬细胞NF-κB较对照组明显升高，2周时降至正常，4周时降低于正常，阿奇霉素治疗1周时NF-κB活性比博莱霉素1周时明显降低(67.2%)。
Northern杂交显示：正常肺泡巨噬细胞基本不表达TNFα及TGF-β，肺泡巨噬细胞TNFα mRNA及TGF-β mRNA表达在博莱霉素1、2周时明显增高，高峰均位于博莱霉素1周。阿奇霉素治疗1周与博莱霉素1周比较，肺泡巨噬细胞TNFα mRNA及TGF-β mRNA表达分别降低36.6%和30.2%，2周时分别降低32.4%和28.6%。
, 百拇医药
博莱霉素1、2周时巨噬细胞培养上清TNFα、TGF-β蛋白水平较对照组明显增高，差异有显著性，P值均<0.05，其高峰位于1周。阿奇霉素治疗1、2周时TNFα、TGF-β蛋白水平与博莱霉素1、2周时比较均有所降低，差异有显著性，P值均<0.05。
表2 三组巨噬细胞NF-κB活性、TNFα、TGF-β mRNA表达与蛋白测定(
±s) 组别鼠数
(只)
NF-κB
(A)
TNFα
mRNA
, http://www.100md.com
(A)
TGF-β
mRNA
(A)
TNFα蛋白
(ng/L)
TGF-β蛋白
(ng/L)
对照组
6
20.83±
5.60
-
, 百拇医药
-
129.7±
31.2
202.2±
60.5
A组
18
1周
49.57±
8.60**
12.39±
3.90
13.49±
, 百拇医药
2.90
581.2±
169.8**
634.5±
195.3**
2周
23.76±
9.40
8.44±
1.60
10.49±
2.80
, 百拇医药
328.5±
117.3**
366.1±
43.2**
4周
6.19±
3.20
-
-
144.3±
53.4
242.2±
, 百拇医药
39.9
B组
18
1周
16.29±
9.40*
7.82±
2.60
9.42±
3.70
441.2±
121.7*
, 百拇医药
468.4±
74.2*
2周
15.97±
9.80*
5.71±
1.70
7.49±
2.40
246.7±
34.5*
285.6±
, 百拇医药
56.3*
4周
3.18±
1.20
-
-
129.1±
38.0
231.1±
35.2
注：NF-κB：核因子κB；TNF：肿瘤坏死因子；TGF-β：转化生长因子-β；-为未做 与相应的A组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.05
, 百拇医药
三、肺组织中TNFα和TGF-β mRNA表达
Northern杂交显示：正常肺组织中基本不表达TNFα和TGF-β，肺组织中TNFα和TGF-β mRNA表达在博莱霉素1、2周时明显增高，1周时达高峰，阿奇霉素治疗1周时肺组织TNFα和TGF-β mRNA表达与博莱霉素1周时比较，分别降低36.6%和36.8%，2周分别降低32.4%和39.2%。
四、BALF中TNFα和TGF-β蛋白水平测定
BALF中TNFα和TGF-β蛋白水平测定见表3。表3 BALF中TNFα和TGF-β蛋白测定及肺组织中TNFα和TGF-β mRNA表达(
±s) 组别鼠数
, http://www.100md.com (只)
BALF(×103ng/L)
肺组织(A)
TNFα蛋白
TGF-β蛋白
TNFα
mRNA
TGF-β
mRNA
对照组
6
0.19±
, 百拇医药 0.06
0.35±
0.21
-
-
A组
18
1周
1.61±
0.91**
2.85±
0.68**
16.29±
, 百拇医药
4.60
15.32±
1.90
2周
0.98±
0.19**
1.64±
1.21**
12.49±
1.80
10.06±
0.90
, 百拇医药
4周
0.22±
0.19
0.39±
0.26
-
-
B组
18
1周
1.13±
0.26*
1.97±
, 百拇医药
1.05*
10.33±
1.20
9.68±
2.10
2周
0.65±
0.46*
1.06±
0.46*
8.44±
3.20
, http://www.100md.com
6.12±
1.20
4周
0.23±
0.09
0.29±
0.17
-
-
注：BALF：支气管肺泡灌洗液；TNF：肿瘤坏死因子；TGF-β：转化生长因子-β；-为未做 与相应的A组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.05讨论
肺间质纤维化开始的病理改变是以肺泡炎为主，当肺泡巨噬细胞受到各种刺激物刺激活化后，分泌TNFα、白细胞介素(IL)-1等多种细胞因子，导致炎症反应并刺激成纤维细胞使其过度增生，分泌纤维结素，形成纤维化。NF-κB为DNA结合蛋白，是真核细胞基因转录中的重要的调控因子,具有广泛的生物活性。目前研究表明，NF-κB参与调节免疫反应及炎症过程，NF-κB促进前炎症因子(IL-1, TNFα，IL-6)、趋化因子(IL-8, 巨噬细胞炎症蛋白-1)等炎性基因及TGF-β基因的转录，这些细胞因子[6]在肺泡炎中起重要作用，它们可引起中性粒细胞及巨噬细胞活化，增强中性粒细胞及单核细胞趋化功能，刺激成纤维细胞增殖等。而IL-1、TNFα作为细胞外刺激信号，又可激活NF-κB,进一步放大炎症反应[7，8]。因此，IL-1、TNFα与NF-κB之间造成细胞因子网络中的恶性循环。本研究发现，在博莱霉素A5致肺纤维化模型中，肺泡巨噬细胞NF-κB活性在1周时较对照组明显升高，2周时有所降低，4周时低于正常，这与其调控的炎性因子TNFα以及TGF-β mRNA表达及其蛋白改变的水平是一致的，表明NF-κB在肺间质纤维化中起重要作用。近年研究发现，红霉素及阿奇霉素(十四员及十五员环大环内酯类抗生素)除抗菌作用外，还具有抗炎的作用，试验研究证明阿奇霉素能影响巨噬细胞生长、趋化及吞噬功能[1，9]，红霉素能减缓博莱霉素诱导的肺间质纤维化[10]，而阿奇霉素对肺间质纤维化的疗效及其对核因子κB的作用目前未见报道。我们观察了阿奇霉素治疗博莱霉素A5致肺纤维化模型中肺泡炎及肺纤维化病变均有一定程度的减轻，而在阿奇霉素治疗1周时巨噬细胞NF-κB活性受到抑制,同时巨噬细胞及肺组织TNFα和TGF-β mRNA的表达及蛋白水平均有一定程度降低。阿奇霉素减轻肺纤维化病变的可能机制是其抑制NF-κB活性，阻断了NF-κB与TNFα、TGF-β形成的恶性循环，从而使肺泡炎及纤维化的程度减轻。从本结果看，阿奇霉素治疗肺间质纤维化将是可选用的措施。
, 百拇医药
参考文献
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[6] Li H , He B , Que C , et al . Expression of TGF-beta 1 , PDGF and IGF-1 mRNA in lung of bleomycin-A5-induced pulmonary fibrosis in rats. Chin Med J , 1996 , 109 : 533-536.
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[9] Xu G , Fujita J , Negayama K , et al . Effect of macrolide antibiotics on macrophage functions. Microbiol Immunol , 1996 , 40 : 473-479.
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(收稿：1999-01-04 修回：1999-05-30), http://www.100md.com