幽门螺杆菌脂多糖对肠嗜铬样细胞功能的影响
作者：缪锟 孙亮 Laura H. Tang Irvin M. Modlin
单位：210019 南京医科大学第一附属医院消化内科(缪锟、孙亮)；美国耶鲁大学医学院外科系(Laura H. Tang、Irvin M. Modlin)
关键词：螺杆菌，幽门；脂多糖类；肠嗜铬细胞
中华内科杂志991007 【摘要】 目的 通过幽门螺杆菌(Hp)的脂多糖抗原对体外大鼠肠嗜铬样细胞功能的影响，深入探讨Hp改变胃酸分泌和黏膜增生的病理机制。方法 通过链球蛋白酶消化、淘析法和梯度离心分离出纯化率95%、成活率>90%的大鼠胃的肠嗜铬样细胞。短期培养后通过酶标免疫法，BrdU掺入试验分别测定肠嗜铬样细胞基础和刺激后的组胺分泌及DNA增生。结果 脂多糖抗原刺激基础组胺的分泌(EC50 4×10-11 mol/L)，同时显著增强胃泌素刺激组胺分泌的作用(EC50 10-10 mol/L)。生长抑素(10-12 mol/L)能完全抑制这些作用而胃泌素拮抗剂L365 260则无明显抑制作用。脂多糖抗原不能刺激肠嗜铬样细胞的DNA合成，但明显增强胃泌素对其DNA的合成(EC50 10-10 mol/L)。大肠杆菌的脂多糖抗原(10-12～10-6 mol/L)对肠嗜铬样细胞的组胺分泌和DNA合成均无明显作用。结论 在体外，Hp直接影响肠嗜铬样细胞的增生和分泌。高度提示脂多糖抗原同肠嗜铬样细胞的互相作用参于了Hp感染引起的酸分泌异常和胃黏膜的病理改变。
, 百拇医药
Influence of Helicobacter pylori lipopolysaccharide on the function of enterochromaffin-like cells in vitro
MIU Kun*, SUN Liang, Laura H. Tang, et al.
*Section of Digestive Disease, Department of Internal Medicine ,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between Helicobacter pylori (Hp) infection and pathophysiology of abnormal gastric acid secretion and mucosal proliferation by studying the effect of Hp lipopolysaccharide (LPS) on the function of enterochromaffin-like (ECL) cells in vitro. Methods Pure isolated ECL cell preparation with a purity of ±95% was developed by proteinase digestion, elutriation and density gradient centrifugation with viability of >95% as determined by trypan blue exclusion. After a short duration of culture basal and stimulated histamine secretion and DNA synthesis of ECL cells were measured by enzyme immunoassay and bromodeoxyuridine (BrdU) uptake, respectively. Results Hp LPS stimulated basal and gastrin-stimulated histamine secretion (EC504×10-11 mol/L and EC50 10-10 mol/L respectively). These effects were completely inhibited by somatostatin (10-10 mol/L) but not by gastrin receptor antagonist L365 260. Hp LPS did not stimulate basal DNA synthesis but significantly increased gastrin stimulated BrdU uptake with EC50 of 10-10 mol/L. Escherichia coil LPS had no significant effect on both histamine secretion and DNA synthesis. Conclusion Hp stimulates both ECL cell proliferation and secretion in vitro. An interaction between Hp LPS and ECL cells may contribute to the reported abnormalities in acid secretion and gastric pathophysiology noted in Hp infection.
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【Key words】 Helicobacter pylori Lipopolysaccharides Enterochromaffin cells
幽门螺杆菌(Hp)的感染同慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的关系已被普遍接受。具有强力趋化作用的Hp表面的脂多糖(LPS)也被认为是Hp感染的主要致病因子[1-3]。我们试图通过LPS在体外对大鼠胃的肠嗜铬样(ECL)细胞的直接作用，深入探讨Hp感染引起胃酸分泌异常及黏膜增生的发病机制。
材料和方法
1.材料：Hp的LPS通过热酚水提取法从Hp菌株84-183提出[4]。分子量5 000～10 000。大肠杆菌的LPS购于美国Sigma公司，是通过血清02∶B6的细胞中制备。其余所有材料均购于美国Sigma公司。
2.ECL细胞的分离和纯化：采用改良的Prins方法[5]。每次实验取4只空腹雌性的Sprague-Dawley鼠,重约200～250 g。经CO2麻醉后迅速取出鼠胃做成黏膜翻转在外的囊袋。经PBS冲洗后向囊内注射3 ml(1.6 g/L)链球蛋白酶。然后将其放在含有1 mmol/L EDTA的含氧无钙溶液中孵化。30分钟后转移到含钙的溶液中孵化10分钟再转回到EDTA无钙溶液30分钟。胃黏膜细胞通过磁棒在无钙溶液中分离，通过离心(100 g 5分钟)收集。收集的细胞通过对流淘析法在离心速度2 000 r/min、细胞流速20 ml/min时收集直径8～10 μm的小细胞。这些细胞通过颗粒梯度离心(1 100 r/min，8分钟)在1.040 g/ml的颗粒界面上收集。
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3.ECL细胞的短期培养：纯化后的ECL细胞混悬在生长培养液中(培养液以Dulbecco F2为基础，加入2%小牛血清，0.5 g/L胰岛素，10 nmol/ L氢化泼尼松和0.1 g/L庆大霉素，pH 7.4)。细胞的浓度为10-5 cells/ml。细胞悬液加入覆有胶原-1培养板(Collaborative Research Bedford，MA)中培养12小时。每100 μl的细胞悬液用于测定DNA合成。每200 μl的细胞悬液用于测定组胺的分泌。
4.DNA的合成：细胞经过12小时培养后其培养液和坏死细胞被吸出，替换上含有1∶200 BrdU(Amersham)的生长培养液并加入有关刺激剂。经培养24小时后将培养液去除用固定液(90%乙醇、5%醋酸和5%水)在4℃温度下将细胞固定。然后用PPS冲洗。在室温下加入1∶400抗BrdU抗体(Amersham)60分钟。经3次冲洗后在室温下加入连接了辣根过氧化酶的兔抗鼠免疫球蛋白G(1∶800;Amersham)。30分钟后经过3次冲洗加入底物(次酚基二胺柠檬酸)。在波长405 nm测定吸光度(Bio Tek Model EL 312e，Bio Tek Instrument，Winnoski，VT)，结果用A405表示，最后结果用与对照组的比值表示。
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5.组胺分泌的测定：细胞经12小时培养后将生长培养液去除，替换200 μl的一般培养液(Dulbecco medium F12加入20%牛血清白蛋白，pH 7.9)。在加入有关刺激剂60分钟后收集180 ml的培养液，经离心(10 000 r/min，5分钟)将上清液提取保存在-20℃的低温冰箱中。组胺的测定采用酶标免疫法(AMAC，Immunotech，Westbrook，ME)。最后结果用与对照组的平均百分比表示。
结果
1.与对照组相比大肠杆菌的LPS(10-10～10-6 mol/L)对ECL细胞的组胺分泌无刺激作用(P>0.05)。在高浓度时对胃泌素刺激组胺的分泌有抑制作用(P<0.05)。
2.与对照组相比Hp的LPS能刺激ECL细胞的组胺分泌(P<0.05；EC50 4×10-11 mol/L),并能明显增强胃泌素(10-10 mol/L)刺激组胺分泌的作用(P<0.05；EC50 10-10 mol/L)。
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3.胃泌素受体拮抗剂L365 260(10-12～10-6 mol/L)对Hp的LPS刺激组胺分泌无抑制(P>0.05)。
4.生长抑素(10-12 mol/L)能有效地抑制Hp的LPS刺激ECL细胞分泌组胺的作用。
5.Hp的LPS对ECL细胞DNA合成无明显作用，但对胃泌素(10-8 mol/L)刺激ECL细胞DNA合成有明显的增强作用(P<0.05；EC50 10-10 mol/L)。
讨论
ECL细胞是一种神经内分泌细胞，广泛分布在胃的泌酸黏膜中。在胃酸分泌中起着重要的调节作用。主要机制是胃泌素作用其细胞膜的CCK-b受体，通过调节Ca离子浓度刺激组胺的分泌和细胞的增生[6]。Hp感染过程中引起胃酸分泌异常和胃黏膜细胞的增生已得到充分肯定，但其作用机制尚待进一步研究。本研究表明Hp的LPS在能直接刺激ECL细胞分泌组胺的同时，增强胃泌素刺激ECL细胞分泌组胺的作用，而大肠杆菌的LPS则无此作用。这不仅是因为Hp的LPS在结构、作用方式和生理活性上同大肠杆菌LPS的差异[7]，同时也证实了Hp对ECL细胞作用的特异性。Hp的LPS对ECL细胞组胺分泌的直接作用参与了Hp感染引起的胃酸分泌异常的病理过程。
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Hp的LPS的作用机制也是一个值得探讨的问题。胃泌素受体拮抗剂L365 260对Hp的LPS刺激组胺分泌无抑制作用，提示LPS的作用与激活胃泌素受体无关。生长抑素主要通过激活ECL细胞膜上生长抑素-2受体抑制其分泌组胺[8]，并能有效地抑制Hp的LPS刺激组胺分泌的作用。LPS和生长抑素的相互拮抗作用是在受体水平还是通过第二信使水平的调节有待进一步的研究。在体内Hp感染后生长抑素及其信使RNA水平均下降[9]，因此必然导致Hp的LPS刺激ECL细胞分泌组胺的功能增强。
作为致癌因子，Hp对胃黏膜增生的作用已经被肯定。Hp对ECL细胞病理增生的直接作用尚不清楚，但内分泌细胞可能参与了微小结节假性增生的现象提示它们之间可能存在互相作用[10]。ECL细胞的增生主要受胃泌素的调节，长期的高胃泌素血症引起ECL细胞过度增生，甚至产生类癌。在体外Hp的LPS能增强胃泌素刺激ECL细胞DNA合成的作用提示，在Hp感染过程中胃体微小结节增生可能同Hp直接作用于神经内分泌细胞有关。
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总之，体外研究表明Hp的LPS对ECL细胞的分泌和增生有促进作用。因此，在体内Hp对ECL细胞的刺激引起胃酸分泌异常。Hp对胃癌发生的影响是一个复杂过程，对神经内分泌细胞的增生作用可能是其中原因之一。
参考文献
[1] Mooney C, Keenan J, Munster D, et al. Neutrophil activation by Helicobacter pylori. Gut, 1991,32:853-857.
[2] Mai UE, Perez-Perez GI, Wahl LM, et al. Soluble surface proteins from Helicobacter pylori activate monocytes/macrophages by lipopolysaccaride independent mechanism. J Clin Invest ,1991, 87:894-900.
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[3] Crabtree JE, Shallcross TM, Heatley RV, et al. Mucosal tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 in patients with Helicobacter pylori associated gastritis. Gut ,1991, 32:1473-1477.
[4] Young GO, Stemmet N, Lastovica A, et al. Helicobacter pylori lipopolysaccharide stimulates gastric mucosal pepsinogen secretion. Aliment Pharamcol Ther, 1992,6:169-179.
[5] Lawton GP, Tang LH, Miu K, et al. Adrenergic and cromolyn sodium modulation of ECL cell histamine secretion. J Surg Res, 1995,58:96-104.
, 百拇医药
[6] Modlin IM, Tang LH. The gastric enterochromaffin-like cell. An enigmatic cellular lesion. Gastroenterology, 1996,111:783-810.
[7] Perez-Perez GI, Sheperd VI, Morrow JD, et al. Activation of human TMP-1 cells and rat bone marrow-derived macrophages by Helicobacter pylori lipopolysaccharide. Infect Immunol ,1995,63:1183-1187.
[8] Sander A, Kidd M, Lawton GP, et al. Neurohormonal modulation of rat enterochromaffin-like cell histamine secretion. Gastroenterology ,1996,110:1084-1092.
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[9] Moss SF, Legon S, Bishop AE, et al. Effect of Helicobatcter pylori on gastric somatostatin in duodenal ulcer disease. Lancet ,1992, 340:930-932.
[10] Olcia E, Fiocca R, Havu N, et al. Gastric endocrine cells and gastritis in patients receiving long-term omeprazole treatment. Digestion,1992,51:82-92.
(收稿：1999-01-04 修回：1999-07-04), 百拇医药
单位：210019 南京医科大学第一附属医院消化内科(缪锟、孙亮)；美国耶鲁大学医学院外科系(Laura H. Tang、Irvin M. Modlin)
关键词：螺杆菌，幽门；脂多糖类；肠嗜铬细胞
中华内科杂志991007 【摘要】 目的 通过幽门螺杆菌(Hp)的脂多糖抗原对体外大鼠肠嗜铬样细胞功能的影响，深入探讨Hp改变胃酸分泌和黏膜增生的病理机制。方法 通过链球蛋白酶消化、淘析法和梯度离心分离出纯化率95%、成活率>90%的大鼠胃的肠嗜铬样细胞。短期培养后通过酶标免疫法，BrdU掺入试验分别测定肠嗜铬样细胞基础和刺激后的组胺分泌及DNA增生。结果 脂多糖抗原刺激基础组胺的分泌(EC50 4×10-11 mol/L)，同时显著增强胃泌素刺激组胺分泌的作用(EC50 10-10 mol/L)。生长抑素(10-12 mol/L)能完全抑制这些作用而胃泌素拮抗剂L365 260则无明显抑制作用。脂多糖抗原不能刺激肠嗜铬样细胞的DNA合成，但明显增强胃泌素对其DNA的合成(EC50 10-10 mol/L)。大肠杆菌的脂多糖抗原(10-12～10-6 mol/L)对肠嗜铬样细胞的组胺分泌和DNA合成均无明显作用。结论 在体外，Hp直接影响肠嗜铬样细胞的增生和分泌。高度提示脂多糖抗原同肠嗜铬样细胞的互相作用参于了Hp感染引起的酸分泌异常和胃黏膜的病理改变。
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Influence of Helicobacter pylori lipopolysaccharide on the function of enterochromaffin-like cells in vitro
MIU Kun*, SUN Liang, Laura H. Tang, et al.
*Section of Digestive Disease, Department of Internal Medicine ,The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between Helicobacter pylori (Hp) infection and pathophysiology of abnormal gastric acid secretion and mucosal proliferation by studying the effect of Hp lipopolysaccharide (LPS) on the function of enterochromaffin-like (ECL) cells in vitro. Methods Pure isolated ECL cell preparation with a purity of ±95% was developed by proteinase digestion, elutriation and density gradient centrifugation with viability of >95% as determined by trypan blue exclusion. After a short duration of culture basal and stimulated histamine secretion and DNA synthesis of ECL cells were measured by enzyme immunoassay and bromodeoxyuridine (BrdU) uptake, respectively. Results Hp LPS stimulated basal and gastrin-stimulated histamine secretion (EC504×10-11 mol/L and EC50 10-10 mol/L respectively). These effects were completely inhibited by somatostatin (10-10 mol/L) but not by gastrin receptor antagonist L365 260. Hp LPS did not stimulate basal DNA synthesis but significantly increased gastrin stimulated BrdU uptake with EC50 of 10-10 mol/L. Escherichia coil LPS had no significant effect on both histamine secretion and DNA synthesis. Conclusion Hp stimulates both ECL cell proliferation and secretion in vitro. An interaction between Hp LPS and ECL cells may contribute to the reported abnormalities in acid secretion and gastric pathophysiology noted in Hp infection.
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【Key words】 Helicobacter pylori Lipopolysaccharides Enterochromaffin cells
幽门螺杆菌(Hp)的感染同慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的关系已被普遍接受。具有强力趋化作用的Hp表面的脂多糖(LPS)也被认为是Hp感染的主要致病因子[1-3]。我们试图通过LPS在体外对大鼠胃的肠嗜铬样(ECL)细胞的直接作用，深入探讨Hp感染引起胃酸分泌异常及黏膜增生的发病机制。
材料和方法
1.材料：Hp的LPS通过热酚水提取法从Hp菌株84-183提出[4]。分子量5 000～10 000。大肠杆菌的LPS购于美国Sigma公司，是通过血清02∶B6的细胞中制备。其余所有材料均购于美国Sigma公司。
2.ECL细胞的分离和纯化：采用改良的Prins方法[5]。每次实验取4只空腹雌性的Sprague-Dawley鼠,重约200～250 g。经CO2麻醉后迅速取出鼠胃做成黏膜翻转在外的囊袋。经PBS冲洗后向囊内注射3 ml(1.6 g/L)链球蛋白酶。然后将其放在含有1 mmol/L EDTA的含氧无钙溶液中孵化。30分钟后转移到含钙的溶液中孵化10分钟再转回到EDTA无钙溶液30分钟。胃黏膜细胞通过磁棒在无钙溶液中分离，通过离心(100 g 5分钟)收集。收集的细胞通过对流淘析法在离心速度2 000 r/min、细胞流速20 ml/min时收集直径8～10 μm的小细胞。这些细胞通过颗粒梯度离心(1 100 r/min，8分钟)在1.040 g/ml的颗粒界面上收集。
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3.ECL细胞的短期培养：纯化后的ECL细胞混悬在生长培养液中(培养液以Dulbecco F2为基础，加入2%小牛血清，0.5 g/L胰岛素，10 nmol/ L氢化泼尼松和0.1 g/L庆大霉素，pH 7.4)。细胞的浓度为10-5 cells/ml。细胞悬液加入覆有胶原-1培养板(Collaborative Research Bedford，MA)中培养12小时。每100 μl的细胞悬液用于测定DNA合成。每200 μl的细胞悬液用于测定组胺的分泌。
4.DNA的合成：细胞经过12小时培养后其培养液和坏死细胞被吸出，替换上含有1∶200 BrdU(Amersham)的生长培养液并加入有关刺激剂。经培养24小时后将培养液去除用固定液(90%乙醇、5%醋酸和5%水)在4℃温度下将细胞固定。然后用PPS冲洗。在室温下加入1∶400抗BrdU抗体(Amersham)60分钟。经3次冲洗后在室温下加入连接了辣根过氧化酶的兔抗鼠免疫球蛋白G(1∶800;Amersham)。30分钟后经过3次冲洗加入底物(次酚基二胺柠檬酸)。在波长405 nm测定吸光度(Bio Tek Model EL 312e，Bio Tek Instrument，Winnoski，VT)，结果用A405表示，最后结果用与对照组的比值表示。
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5.组胺分泌的测定：细胞经12小时培养后将生长培养液去除，替换200 μl的一般培养液(Dulbecco medium F12加入20%牛血清白蛋白，pH 7.9)。在加入有关刺激剂60分钟后收集180 ml的培养液，经离心(10 000 r/min，5分钟)将上清液提取保存在-20℃的低温冰箱中。组胺的测定采用酶标免疫法(AMAC，Immunotech，Westbrook，ME)。最后结果用与对照组的平均百分比表示。
结果
1.与对照组相比大肠杆菌的LPS(10-10～10-6 mol/L)对ECL细胞的组胺分泌无刺激作用(P>0.05)。在高浓度时对胃泌素刺激组胺的分泌有抑制作用(P<0.05)。
2.与对照组相比Hp的LPS能刺激ECL细胞的组胺分泌(P<0.05；EC50 4×10-11 mol/L),并能明显增强胃泌素(10-10 mol/L)刺激组胺分泌的作用(P<0.05；EC50 10-10 mol/L)。
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3.胃泌素受体拮抗剂L365 260(10-12～10-6 mol/L)对Hp的LPS刺激组胺分泌无抑制(P>0.05)。
4.生长抑素(10-12 mol/L)能有效地抑制Hp的LPS刺激ECL细胞分泌组胺的作用。
5.Hp的LPS对ECL细胞DNA合成无明显作用，但对胃泌素(10-8 mol/L)刺激ECL细胞DNA合成有明显的增强作用(P<0.05；EC50 10-10 mol/L)。
讨论
ECL细胞是一种神经内分泌细胞，广泛分布在胃的泌酸黏膜中。在胃酸分泌中起着重要的调节作用。主要机制是胃泌素作用其细胞膜的CCK-b受体，通过调节Ca离子浓度刺激组胺的分泌和细胞的增生[6]。Hp感染过程中引起胃酸分泌异常和胃黏膜细胞的增生已得到充分肯定，但其作用机制尚待进一步研究。本研究表明Hp的LPS在能直接刺激ECL细胞分泌组胺的同时，增强胃泌素刺激ECL细胞分泌组胺的作用，而大肠杆菌的LPS则无此作用。这不仅是因为Hp的LPS在结构、作用方式和生理活性上同大肠杆菌LPS的差异[7]，同时也证实了Hp对ECL细胞作用的特异性。Hp的LPS对ECL细胞组胺分泌的直接作用参与了Hp感染引起的胃酸分泌异常的病理过程。
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Hp的LPS的作用机制也是一个值得探讨的问题。胃泌素受体拮抗剂L365 260对Hp的LPS刺激组胺分泌无抑制作用，提示LPS的作用与激活胃泌素受体无关。生长抑素主要通过激活ECL细胞膜上生长抑素-2受体抑制其分泌组胺[8]，并能有效地抑制Hp的LPS刺激组胺分泌的作用。LPS和生长抑素的相互拮抗作用是在受体水平还是通过第二信使水平的调节有待进一步的研究。在体内Hp感染后生长抑素及其信使RNA水平均下降[9]，因此必然导致Hp的LPS刺激ECL细胞分泌组胺的功能增强。
作为致癌因子，Hp对胃黏膜增生的作用已经被肯定。Hp对ECL细胞病理增生的直接作用尚不清楚，但内分泌细胞可能参与了微小结节假性增生的现象提示它们之间可能存在互相作用[10]。ECL细胞的增生主要受胃泌素的调节，长期的高胃泌素血症引起ECL细胞过度增生，甚至产生类癌。在体外Hp的LPS能增强胃泌素刺激ECL细胞DNA合成的作用提示，在Hp感染过程中胃体微小结节增生可能同Hp直接作用于神经内分泌细胞有关。
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总之，体外研究表明Hp的LPS对ECL细胞的分泌和增生有促进作用。因此，在体内Hp对ECL细胞的刺激引起胃酸分泌异常。Hp对胃癌发生的影响是一个复杂过程，对神经内分泌细胞的增生作用可能是其中原因之一。
参考文献
[1] Mooney C, Keenan J, Munster D, et al. Neutrophil activation by Helicobacter pylori. Gut, 1991,32:853-857.
[2] Mai UE, Perez-Perez GI, Wahl LM, et al. Soluble surface proteins from Helicobacter pylori activate monocytes/macrophages by lipopolysaccaride independent mechanism. J Clin Invest ,1991, 87:894-900.
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[3] Crabtree JE, Shallcross TM, Heatley RV, et al. Mucosal tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 in patients with Helicobacter pylori associated gastritis. Gut ,1991, 32:1473-1477.
[4] Young GO, Stemmet N, Lastovica A, et al. Helicobacter pylori lipopolysaccharide stimulates gastric mucosal pepsinogen secretion. Aliment Pharamcol Ther, 1992,6:169-179.
[5] Lawton GP, Tang LH, Miu K, et al. Adrenergic and cromolyn sodium modulation of ECL cell histamine secretion. J Surg Res, 1995,58:96-104.
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[6] Modlin IM, Tang LH. The gastric enterochromaffin-like cell. An enigmatic cellular lesion. Gastroenterology, 1996,111:783-810.
[7] Perez-Perez GI, Sheperd VI, Morrow JD, et al. Activation of human TMP-1 cells and rat bone marrow-derived macrophages by Helicobacter pylori lipopolysaccharide. Infect Immunol ,1995,63:1183-1187.
[8] Sander A, Kidd M, Lawton GP, et al. Neurohormonal modulation of rat enterochromaffin-like cell histamine secretion. Gastroenterology ,1996,110:1084-1092.
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[10] Olcia E, Fiocca R, Havu N, et al. Gastric endocrine cells and gastritis in patients receiving long-term omeprazole treatment. Digestion,1992,51:82-92.
(收稿：1999-01-04 修回：1999-07-04), 百拇医药