HLA-DRB1高分辨基因分型在造血干细胞移植中的意义探讨
作者：屠敏 孔繁华 奚永志 孙玉英 刘楠 郭斯启
单位：100039北京，军事医学科学院附属医院免疫学研究室及国家生物医学分析中心免疫分析实验室
关键词：HLA；基因；造血干细胞移植
中华内科杂志000504 【摘要】 目的 探讨造血干细胞移植中进行供-受体 HLA-DRB1高分辨基因分型的重要作用，并对HLA-DRB1等位基因频率在中国人群中的分布进行分析。 方法 采用美国莱姆达公司提供的微量SSPTM HLA-DRB1 PCR-SSP低分辨及高分辨分型试剂盒对101例造血干细胞移植供-受体进行高分辨基因分型，其中供-受体37对，无关个体50例。 结果 在37对供-受体分型中，有2对为低分辨HLA-DRB1位点相合，而高分辨结果为不合，其余35例低分辨及高分辨结果一致。对50例无血源关系供体的HLA-DRB1位点高分辨结果进行了等位基因频率分析, 发现DRB1.09012、DRB1.12021/022、DRB1.0701、DRB1.03011、 DRB1.15011/012出现频率比较高，其频率分别为36%、22%、20%、12%、12%。结论 HLA-DRB1高分辨基因分型分辨率高，可明确判定基因型别，对于同胞间或无关供-受体间造血干细胞移植具有重要意义。
, 百拇医药
A study on the significance of HLA-DRB1 high resolution typing method in hematological stem cell transplantation
TU Min KONG Fanhua XI Yongzhi
(Department of Immunology, The Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Science, Beijing, 100039，China)
【Abstract】 Objectives To study the significance of HLA-DRB1 high resolution typing method in hematological stem cell transplantation and to analyze the distribution of HLA-DRB1 alleles in Chinese population. Methods Low resolution and high resolution typing methods of HLA-DRB1 PCR-SSP (Lambda, Inc) were employed to type 101 cases of related hematological stem cell transplant donors and recipients, in which there were 37 donor-recipient pairs and 50 unrelated individuals. Results Among the typing results of 37 donor-recipient pairs, there were 2 pairs whose low resolution typing results were identical, but the high resolution results were incompatible, and the typing results by the two methods in the other 35 pairs were identical. HLA-DRB1 allelic frequencies of the 50 unrelated individuals were analyzed by using HLA high resolution typing results, in which the frequencies of DRB1.09012, 12021/022, 0701, 03011 and 15011/012 were relateivly high and their frequencies were 36%, 22%, 20%, 12% and 12% respectively. Conclusions HLA-DRB1 high resolution typing method can accurately designate HLA-DRB1 alleles and possesses great importance in related and unrelated hematological stem cell transplantation.
, 百拇医药
【Key words】 HLA； Gene; Hematopoientic stem cell transplantation
人类白细胞抗原(HLA)是目前所知的最具高度多态性的抗原系统。检测HLA多态性，选择HLA相合供体，可降低宿主排斥移植物及移植物抗宿主病(GVHD)发生率和强度，有利于延长移植物的存活时间[1-4] ，所以选择HLA匹配的供体是移植成功的关键。目前国内一般在同胞兄弟姐妹之间选择HLA相合的供-受体进行造血干细胞移植, 由于遗传背景的相似性，一般情况下只做血清学或低分辨基因分型就可满足临床移植的要求[5]，但是随着我国计划生育政策的实施，独生子女越来越多，选择无血缘关系的无关个体进行骨髓移植已势在必行，这就对HLA 配型提出了更高的要求。为探讨HLA高分辨基因分型在造血干细胞移植中的作用，本研究对101例供-受体进行HLA-DRB1低、高分辨分型方法的比较分析。
材料与方法
, http://www.100md.com
1.标本来源：采集拟进行移植的供-受体静脉血各1份，0.5 % EDTA抗凝。
2.DNA的提取: 采用QIAGEN公司提供QIAamp Blood kit提取。取0.5%EDTA抗凝全血200 μl至1.5 ml离心管，加入200 μl Buffer AL，20 μl PK混匀，56℃温育10min，加入200 μl无水乙醇混匀，转移至树脂柱，8 000 r/min离心1 min，加入500 μl Buffer AW1，8 000 r/min离心1 min，加入500 μl Buffer AW2，8 000 r/min离心3 min。将树脂柱转移至1.5 ml离心管中，加入200 μl Buffer AE，室温放置1 min，8 000 r/min离心1 min在-20℃保存。
3. HLA-II类PCR - SSP高、低分辨基因分型方法: 分别采用美国莱姆达公司提供的微量SSPTM HLA-DRB1 PCR-SSP分型试剂盒和SSPTM HLA-II类DNA分型试剂盒。先在分型板的阴性对照孔中加入1 μl DNA溶解液(Buffer AE)，微量管(D-MIX管)中加入2 μl(5 U/μl )的Taq DNA聚合酶(PE公司)，混匀后取9 μl加入分型板的阴性对照孔中，取39 μl DNA加入微量管中混匀，在分型板每个反应孔中加入10 μl上述混合液，阴性孔不加，盖紧盖子。将反应板置于PE - 9700 PCR仪上进行PCR反应，反应参数为(94℃ 130 s，63℃ 60 s),1个循环→(94℃ 10 s,63℃ 60 s),9个循环→(94℃ 10 s,59℃ 50 s,72℃ 30 s), 20个循环。取PCR反应产物10 μl上样到2.5% 琼脂糖凝胶中电泳，电压140 V，4 min，在紫外检测仪下观察结果，分析电泳带的格局，确定等位基因。
, 百拇医药
结果
1. 1例特殊家系HLA-DRB1 PCR-SSP低、高分辨基因分型结果,见图1～3。
图中1、2、3、4行为患者HLA-DRB1的PCR产物电泳结果；5、6、7、8为其胞妹的HLA-DRB1的PCR产物电泳结果
图1 HLA-Ⅱ类PCR-SSP低分辨基因分型结果
图中可以看出1行4孔、3行6孔及4行3孔出现阳性带
图2 患者父亲HLA-Ⅱ类PCR-SSP低分辨基因分型结果
, 百拇医药
图中1、2行为患者HLA-DRB1的PCR产物电泳结果；3、4行为其胞妹的HLA-DRB1的PCR产物电泳结果；5、6为其父亲的HLA-DRB1的PCR产物电泳结果
图3 HLA-DRB1 PCR-SSP高分辨基因分型结果
从图1中可以看出，1、5行的4孔，3、7行的2、6、8孔及4、8行的3、4孔，出现阳性带。根据HLA-DRB1、DQB1低分辨反应格局可以判断，该患者及供体基因型别均为DRB1*15，DRB1*07，DQB1*06，DQB1*02。
从图2中可以看出，1行的4孔，3行的6孔及4行的3孔，出现阳性带。根据HLA-DRB1、DQB1低分辨反应格局可以判断，该患者父亲基因型别为DRB1*15，-，DQB1*06，- 。
从图3中可以看出，1、5行的2～6孔，2行的3孔、3行的2～5孔，4行的4孔及6行的3、4孔，出现阳性带。根据HLA-DRB1高分辨反应格局可以判断，该患者基因型别为DRB1*15011/012，供体基因型别为DRB1*15021/022，其父亲的基因型别为DRB1*15011/012，DRB1*15021/022。
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2. HLA-DRB1等位基因亚型在中国人群中的分布，见表1。
对50例无血源关系供体的HLA-DRB1位点高分辨结果，进行了等位基因频率分析, 发现DRB1*
表1 50例无关供体HLA-DRB1位点等位基因亚型的分布频率 HLA-DRB1 亚型
频率(%)
HLA-DRB1亚型
频率(%)
DRB1*0101
4
DRB1*1302
4
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DRB1*01021/022
2
DRB1*1401
10
DRB1*15011/012
12
DRB1*1404
4
DRB1*15021/022
4
DRB1*1405
4
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DRB1*1504
2
DRB1*1110/1120
4
DRB1*16021
6
DRB1*1117
2
DRB1*03011
12
DRB1*11011-30
4
, http://www.100md.com DRB1*0403
4
DRB1*12021/022
22
DRB1*04051/052
4
DRB1*1201
6
DRB1*04011/012
2
DRB1*1205
2
, 百拇医药 DRB1*0406
2
DRB1*0701
20
DRB1*0410
6
DRB1*08031/032
4
DRB1*1301
6
DRB1*09012
36
09012、DRB1*12021/022、DRB1*0701、DRB1*03011、 DRB1*15011/012出现频率比较高，其频率分别为36%、22%、20%、12%、12%。
, 百拇医药
讨论
GVHD是导致造血干细胞移植失败的主要因素之一。异基因骨髓移植供、受体之间主要组织相容性复合物的差异和次要组织相容性复合物的差异均可引起GVHD[6]。目前，国内一般选择同胞兄弟姐妹HLA相合者进行骨髓移植,但是在较低水平上的配型常导致移植后GVHD的发生，这说明HLA抗原之间存在交叉反应，而且HLA位点相合并不代表等位基因水平上的一致，故本研究对101例造血干细胞移植供-受体进行高分辨基因分型探讨，其中供-受体37对，无关个体50例。
HLA-II 类低分辨只能确定组特异性而不能确定亚型，对于组特异性相同的无关个体其亚型很可能不同，即使对有血缘关系的低分辨相合供、受体，其高分辨基因型别也并不都一致。我们发现1例兄妹低分辨相合，型别为DRB1*15，DRB1*07，DQB1*06，DQB1*02。但是DRB1*15的高分辨却不同，患者为 DRB1*15011/012，供者为DRB1*15021/022，于是又对其父进行HLA分型，低分辨结果为 DRB1*15，DQB1*06位点纯合，而父亲DRB1*15高分辨非纯合，为DRB1*15011/012，DRB1*15021/022。这说明兄妹二人虽然都有DRB1*15位点，但是它们来源于父亲不同的两条单倍体。另外，我们还发现1例同父异母的兄弟低分辨时相合，型别为 DRB1*11，DRB1*09，DQB1*03，DQB1*09。但是 DRB1*11的高分辨结果却不同，患者为 DRB1*11011-30，供者为DRB1*1117。说明患者的父亲有可能DRB1*11低分辨纯合，但高分辨并不纯合，兄弟二人DRB1*11分别来源于父亲不同的两条单倍体，也可能兄弟二人的生母都有DRB1*11位点，该位点分别来自各自的母亲。综上所述，如果父母双方低分辨有纯合或有相同位点时，子女虽然低分辨相合，但此相合位点很有可能来源于不同单倍体，其高分辨基因型别有可能不同，因此，对于特殊家系应进行高分辨检测，对于骨髓移植选择最合适的供体具有重要意义。
, 百拇医药
通过对50例无关个体HLA-DRB1高分辨型别统计分析得出DRB1*09012、DRB1*0701、DRB1*12021/022、DRB1*03011、DRB1*15011/012出现频率比较高。DRB1*09012频率为36%，DRB1*0701频率为20%，DRB1*12021/022频率为22%，DRB1*03011频率为12%，DRB1*15011 /012频率为12%，DRB1*04频率为18%，DRB1*14频率为18%，但是DRB1*04、 DRB1*14基因亚型的种类比较多。随着我国计划生育政策的实施，独生子女越来越多，选择无血缘关系的无关个体进行骨髓移植已势在必行，具有以上型别的患者寻找无关供者可能相对容易一些，同时也提示，如果受体具有亚型种类比较多的型别，在进行供体选择时更有必要进行高分辨分型。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900187)
参考文献
, 百拇医药 1，敖世洲，主编.基因分子生物学研究进展.上海：上海科学技术出版社，1992.145.
2，Theobald M. Allorecognition and graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplant, 1995,15: 489-498.
3，Lazarus HM, Rowe JM. New and experimental therapies for treating graft-versus-host disease. Blood Reviews, 1995,9: 117-133.
4，Jordan F, McWhinnie AJ, Turner S, et al. Comparison of HLA-DRB1 typing by DNA-RFLP, PCR-SSO and PCR-SSP methods and their application in providing matched unrelated donors for bone marrow transplantation. Tissue Antigens, 1995,45: 103-110.
, 百拇医药
5，Brojer E, Sankowska M, Stanczak JJ, et al. DRB polymerase chain reaction fingerprinting, DQA oligotyping and mixed lymphocyte culture results in related bone marrow donors and recipients. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 1995,43:89-92.
6，Yeager AM, Vogelsang GB, Jones RJ, et al. Induction of cutaneous graft-versus-host disease by administration of cyclosporine to patients undergoing autologous bone marrow transplantation for acute myeloid leukemia. Blood, 1992, 79: 3031-3035.
(收稿日期：1999-12-23), http://www.100md.com
单位：100039北京，军事医学科学院附属医院免疫学研究室及国家生物医学分析中心免疫分析实验室
关键词：HLA；基因；造血干细胞移植
中华内科杂志000504 【摘要】 目的 探讨造血干细胞移植中进行供-受体 HLA-DRB1高分辨基因分型的重要作用，并对HLA-DRB1等位基因频率在中国人群中的分布进行分析。 方法 采用美国莱姆达公司提供的微量SSPTM HLA-DRB1 PCR-SSP低分辨及高分辨分型试剂盒对101例造血干细胞移植供-受体进行高分辨基因分型，其中供-受体37对，无关个体50例。 结果 在37对供-受体分型中，有2对为低分辨HLA-DRB1位点相合，而高分辨结果为不合，其余35例低分辨及高分辨结果一致。对50例无血源关系供体的HLA-DRB1位点高分辨结果进行了等位基因频率分析, 发现DRB1.09012、DRB1.12021/022、DRB1.0701、DRB1.03011、 DRB1.15011/012出现频率比较高，其频率分别为36%、22%、20%、12%、12%。结论 HLA-DRB1高分辨基因分型分辨率高，可明确判定基因型别，对于同胞间或无关供-受体间造血干细胞移植具有重要意义。
, 百拇医药
A study on the significance of HLA-DRB1 high resolution typing method in hematological stem cell transplantation
TU Min KONG Fanhua XI Yongzhi
(Department of Immunology, The Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Science, Beijing, 100039，China)
【Abstract】 Objectives To study the significance of HLA-DRB1 high resolution typing method in hematological stem cell transplantation and to analyze the distribution of HLA-DRB1 alleles in Chinese population. Methods Low resolution and high resolution typing methods of HLA-DRB1 PCR-SSP (Lambda, Inc) were employed to type 101 cases of related hematological stem cell transplant donors and recipients, in which there were 37 donor-recipient pairs and 50 unrelated individuals. Results Among the typing results of 37 donor-recipient pairs, there were 2 pairs whose low resolution typing results were identical, but the high resolution results were incompatible, and the typing results by the two methods in the other 35 pairs were identical. HLA-DRB1 allelic frequencies of the 50 unrelated individuals were analyzed by using HLA high resolution typing results, in which the frequencies of DRB1.09012, 12021/022, 0701, 03011 and 15011/012 were relateivly high and their frequencies were 36%, 22%, 20%, 12% and 12% respectively. Conclusions HLA-DRB1 high resolution typing method can accurately designate HLA-DRB1 alleles and possesses great importance in related and unrelated hematological stem cell transplantation.
, 百拇医药
【Key words】 HLA； Gene; Hematopoientic stem cell transplantation
人类白细胞抗原(HLA)是目前所知的最具高度多态性的抗原系统。检测HLA多态性，选择HLA相合供体，可降低宿主排斥移植物及移植物抗宿主病(GVHD)发生率和强度，有利于延长移植物的存活时间[1-4] ，所以选择HLA匹配的供体是移植成功的关键。目前国内一般在同胞兄弟姐妹之间选择HLA相合的供-受体进行造血干细胞移植, 由于遗传背景的相似性，一般情况下只做血清学或低分辨基因分型就可满足临床移植的要求[5]，但是随着我国计划生育政策的实施，独生子女越来越多，选择无血缘关系的无关个体进行骨髓移植已势在必行，这就对HLA 配型提出了更高的要求。为探讨HLA高分辨基因分型在造血干细胞移植中的作用，本研究对101例供-受体进行HLA-DRB1低、高分辨分型方法的比较分析。
材料与方法
, http://www.100md.com
1.标本来源：采集拟进行移植的供-受体静脉血各1份，0.5 % EDTA抗凝。
2.DNA的提取: 采用QIAGEN公司提供QIAamp Blood kit提取。取0.5%EDTA抗凝全血200 μl至1.5 ml离心管，加入200 μl Buffer AL，20 μl PK混匀，56℃温育10min，加入200 μl无水乙醇混匀，转移至树脂柱，8 000 r/min离心1 min，加入500 μl Buffer AW1，8 000 r/min离心1 min，加入500 μl Buffer AW2，8 000 r/min离心3 min。将树脂柱转移至1.5 ml离心管中，加入200 μl Buffer AE，室温放置1 min，8 000 r/min离心1 min在-20℃保存。
3. HLA-II类PCR - SSP高、低分辨基因分型方法: 分别采用美国莱姆达公司提供的微量SSPTM HLA-DRB1 PCR-SSP分型试剂盒和SSPTM HLA-II类DNA分型试剂盒。先在分型板的阴性对照孔中加入1 μl DNA溶解液(Buffer AE)，微量管(D-MIX管)中加入2 μl(5 U/μl )的Taq DNA聚合酶(PE公司)，混匀后取9 μl加入分型板的阴性对照孔中，取39 μl DNA加入微量管中混匀，在分型板每个反应孔中加入10 μl上述混合液，阴性孔不加，盖紧盖子。将反应板置于PE - 9700 PCR仪上进行PCR反应，反应参数为(94℃ 130 s，63℃ 60 s),1个循环→(94℃ 10 s,63℃ 60 s),9个循环→(94℃ 10 s,59℃ 50 s,72℃ 30 s), 20个循环。取PCR反应产物10 μl上样到2.5% 琼脂糖凝胶中电泳，电压140 V，4 min，在紫外检测仪下观察结果，分析电泳带的格局，确定等位基因。
, 百拇医药
结果
1. 1例特殊家系HLA-DRB1 PCR-SSP低、高分辨基因分型结果,见图1～3。
图中1、2、3、4行为患者HLA-DRB1的PCR产物电泳结果；5、6、7、8为其胞妹的HLA-DRB1的PCR产物电泳结果
图1 HLA-Ⅱ类PCR-SSP低分辨基因分型结果
图中可以看出1行4孔、3行6孔及4行3孔出现阳性带
图2 患者父亲HLA-Ⅱ类PCR-SSP低分辨基因分型结果
, 百拇医药
图中1、2行为患者HLA-DRB1的PCR产物电泳结果；3、4行为其胞妹的HLA-DRB1的PCR产物电泳结果；5、6为其父亲的HLA-DRB1的PCR产物电泳结果
图3 HLA-DRB1 PCR-SSP高分辨基因分型结果
从图1中可以看出，1、5行的4孔，3、7行的2、6、8孔及4、8行的3、4孔，出现阳性带。根据HLA-DRB1、DQB1低分辨反应格局可以判断，该患者及供体基因型别均为DRB1*15，DRB1*07，DQB1*06，DQB1*02。
从图2中可以看出，1行的4孔，3行的6孔及4行的3孔，出现阳性带。根据HLA-DRB1、DQB1低分辨反应格局可以判断，该患者父亲基因型别为DRB1*15，-，DQB1*06，- 。
从图3中可以看出，1、5行的2～6孔，2行的3孔、3行的2～5孔，4行的4孔及6行的3、4孔，出现阳性带。根据HLA-DRB1高分辨反应格局可以判断，该患者基因型别为DRB1*15011/012，供体基因型别为DRB1*15021/022，其父亲的基因型别为DRB1*15011/012，DRB1*15021/022。
, http://www.100md.com
2. HLA-DRB1等位基因亚型在中国人群中的分布，见表1。
对50例无血源关系供体的HLA-DRB1位点高分辨结果，进行了等位基因频率分析, 发现DRB1*
表1 50例无关供体HLA-DRB1位点等位基因亚型的分布频率 HLA-DRB1 亚型
频率(%)
HLA-DRB1亚型
频率(%)
DRB1*0101
4
DRB1*1302
4
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DRB1*01021/022
2
DRB1*1401
10
DRB1*15011/012
12
DRB1*1404
4
DRB1*15021/022
4
DRB1*1405
4
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DRB1*1504
2
DRB1*1110/1120
4
DRB1*16021
6
DRB1*1117
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DRB1*03011
12
DRB1*11011-30
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, http://www.100md.com DRB1*0403
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4
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6
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2
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, 百拇医药 DRB1*0406
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DRB1*0701
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DRB1*0410
6
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DRB1*1301
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DRB1*09012
36
09012、DRB1*12021/022、DRB1*0701、DRB1*03011、 DRB1*15011/012出现频率比较高，其频率分别为36%、22%、20%、12%、12%。
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讨论
GVHD是导致造血干细胞移植失败的主要因素之一。异基因骨髓移植供、受体之间主要组织相容性复合物的差异和次要组织相容性复合物的差异均可引起GVHD[6]。目前，国内一般选择同胞兄弟姐妹HLA相合者进行骨髓移植,但是在较低水平上的配型常导致移植后GVHD的发生，这说明HLA抗原之间存在交叉反应，而且HLA位点相合并不代表等位基因水平上的一致，故本研究对101例造血干细胞移植供-受体进行高分辨基因分型探讨，其中供-受体37对，无关个体50例。
HLA-II 类低分辨只能确定组特异性而不能确定亚型，对于组特异性相同的无关个体其亚型很可能不同，即使对有血缘关系的低分辨相合供、受体，其高分辨基因型别也并不都一致。我们发现1例兄妹低分辨相合，型别为DRB1*15，DRB1*07，DQB1*06，DQB1*02。但是DRB1*15的高分辨却不同，患者为 DRB1*15011/012，供者为DRB1*15021/022，于是又对其父进行HLA分型，低分辨结果为 DRB1*15，DQB1*06位点纯合，而父亲DRB1*15高分辨非纯合，为DRB1*15011/012，DRB1*15021/022。这说明兄妹二人虽然都有DRB1*15位点，但是它们来源于父亲不同的两条单倍体。另外，我们还发现1例同父异母的兄弟低分辨时相合，型别为 DRB1*11，DRB1*09，DQB1*03，DQB1*09。但是 DRB1*11的高分辨结果却不同，患者为 DRB1*11011-30，供者为DRB1*1117。说明患者的父亲有可能DRB1*11低分辨纯合，但高分辨并不纯合，兄弟二人DRB1*11分别来源于父亲不同的两条单倍体，也可能兄弟二人的生母都有DRB1*11位点，该位点分别来自各自的母亲。综上所述，如果父母双方低分辨有纯合或有相同位点时，子女虽然低分辨相合，但此相合位点很有可能来源于不同单倍体，其高分辨基因型别有可能不同，因此，对于特殊家系应进行高分辨检测，对于骨髓移植选择最合适的供体具有重要意义。
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通过对50例无关个体HLA-DRB1高分辨型别统计分析得出DRB1*09012、DRB1*0701、DRB1*12021/022、DRB1*03011、DRB1*15011/012出现频率比较高。DRB1*09012频率为36%，DRB1*0701频率为20%，DRB1*12021/022频率为22%，DRB1*03011频率为12%，DRB1*15011 /012频率为12%，DRB1*04频率为18%，DRB1*14频率为18%，但是DRB1*04、 DRB1*14基因亚型的种类比较多。随着我国计划生育政策的实施，独生子女越来越多，选择无血缘关系的无关个体进行骨髓移植已势在必行，具有以上型别的患者寻找无关供者可能相对容易一些，同时也提示，如果受体具有亚型种类比较多的型别，在进行供体选择时更有必要进行高分辨分型。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900187)
参考文献
, 百拇医药 1，敖世洲，主编.基因分子生物学研究进展.上海：上海科学技术出版社，1992.145.
2，Theobald M. Allorecognition and graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplant, 1995,15: 489-498.
3，Lazarus HM, Rowe JM. New and experimental therapies for treating graft-versus-host disease. Blood Reviews, 1995,9: 117-133.
4，Jordan F, McWhinnie AJ, Turner S, et al. Comparison of HLA-DRB1 typing by DNA-RFLP, PCR-SSO and PCR-SSP methods and their application in providing matched unrelated donors for bone marrow transplantation. Tissue Antigens, 1995,45: 103-110.
, 百拇医药
5，Brojer E, Sankowska M, Stanczak JJ, et al. DRB polymerase chain reaction fingerprinting, DQA oligotyping and mixed lymphocyte culture results in related bone marrow donors and recipients. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 1995,43:89-92.
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(收稿日期：1999-12-23), http://www.100md.com