维生素E对肝星状细胞增殖及胶原合成的影响
作者：展玉涛 尤大钰 姜藻 李定国 刘琛 王红
单位：展玉涛 李定国(上海第二医科大学新华医院 200092)；尤大钰 姜藻 刘琛 王红(南京铁道医学院)
关键词：
中华内科杂志000721 动物实验研究表明维生素E(Vit E)具有抗肝纤维化作用[1]，但其具体机制不明。目前认为肝星状细胞(HSC)在肝纤维化形成中起关键作用[2]。为探讨Vit E抗肝纤维化的细胞学机制，我们以白细胞介素-2(IL -2)及肿瘤坏死因子α(TNFα)作为刺激因素观察了Vit E对大鼠HSC增殖和胶原合成的调控作用。
—、材料和方法
1.实验动物：雄性SD大鼠，体重550 g。
, http://www.100md.com
2.大鼠HSC的分离和培养：采用链酶蛋白酶和胶原酶液原位循环灌注消化肝脏，经11% Metrizamide液一步密度梯度离心分离大鼠HSC。将分离的HSC按2.5×105/ml接种于24孔培养板中，每孔1 ml。
3.实验分组：培养7d后按下列分组(每组6复孔)处理：(1)空白对照组；(2)IL-2组(100 U/ml)；(3)IL-2+Vit E(0.1 mol/L)；(4)IL-2+Vit E(0.2 mol/L)；(5)IL-2+Vit E(0.3 mol/L)；(6)TNFα (1 000 U/ml)；(7)TNFα+Vit E(0.1 mol/L)；(8)TNFα+Vit E (0.2 mol/L)；(9)TNFα+Vit E (0.3 mol/L)。
4.细胞增殖和胶原合成的测定：按以上分组施加处理因素作用24h后对各组的3复孔加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) (3.7×108 Bq/L)继续培养4h，各组的另3复孔加入3H-脯氨酸(3.7×108Bq/L)继续培养24 h，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA液消化细胞脱离孔壁，置细胞移于F49型纤维膜上，经生理盐水洗涤后以10%三氯醋酸固定18 h，再以HCl 5 mol/L脱水，70℃烤箱中烘1h，然后置于闪烁瓶中并加闪烁液3 ml。以Bq/2.5×105 个细胞表示其活性。以t检验进行显著性检验。
, 百拇医药
5.倒置相差显微镜下观察各组细胞形态及损伤程度。
二、结果
1.IL-2及TNFα对HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响:见表1。
2.Vit E对IL-2作用的HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响：见表2。
3.Vit E对TNFα作用的HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响:见表3。
4.倒置显微镜下HSC形态:正常对照组、IL-2组、TNFα组及Vit E处理的各组HSC，其细胞核完整，无细胞脱失区，无细胞碎片。
, http://www.100md.com
表1 IL-2及TNFα对HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响(Bq×103，
±s) 组别
3 H-TdR
3 H-脯氨酸
空白对照组
87.1± 4.6
127.6±5.8
IL-2组
214.1± 7.2***
, 百拇医药
165.9±7.0**
TNFα组
106.2±11.2*
66.4±5.2**
注：各组样本数均为3 与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001表2 VitE对IL-2作用的HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响(Bq×103，±s) Vit E (mol/L)
3 H-TdR
, http://www.100md.com
3 H-脯氨酸
0.0
214.1± 7.2
165.9±7.0
0.1
171.2± 8.6**
144.3±5.5*
0.2
139.2±11.2**
133.6±5.8**
0.3
, http://www.100md.com
124.2± 7.2**
132.7±6.5**
注：IL-2均为100 U/ml，各组样本数均为3 与仅用IL-2组比较，*P<0.05,**P<0.01表3 VitE对TNFα作用的HSC 3 H-TdR和3 H-脯氨酸掺入量的影响(Bq×103，±s) Vit E (mol/L)
3 H-TdR
3 H-脯氨酸
0.0
, 百拇医药
106.2±7.1
69.6±5.2
0.1
100.9±5.6*
54.3±5.9**
0.2
92.4±4.9*
50.9±5.3**
0.3
88.5±6.5**
48.4±5.6**
, 百拇医药
注：TNFα浓度均为1 000 U/ml；各组样本数均为3 与仅用TNFα组比较，*P>0.05,**P<0.05 讨论 临床研究发现原发性胆汁性肝硬化或慢性肝硬化患者血清Vit E低于正常水平。动物实验结果表明Vit E能抑制大鼠肝纤维化的形成[1]。上述资料提示临床上应用Vit E对于阻止慢性肝病患者向肝硬化发展可能是有益的。
我们发现TNFα及IL-2 能增加HSC增殖，IL-2能增加HSC胶原合成，TNFα能抑制HSC胶原合成，Vit E能抑制IL-2或TNFα引起的HSC增殖，并能抑制IL-2引起的HSC胶原合成，增强TNFα对HSC胶原合成的抑制作用。Vit E对HSC增殖及胶原合成的抑制可能是其抗肝纤维化的重要作用机制之一。我们发现倒置显微镜下各组细胞核完整，无细胞脱失区，无细胞碎片，提示Vit E对HSC的影响不是通过细胞毒作用实现的。Vit E影响HSC增殖及胶原合成的具体机制不明，有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：铁道部科技基金资助课题(J96Z009)
参考文献
1，王雅凡，李奇芬，王洪，等.维生素E抗大鼠四氯化碳所致肝纤维化的实验研究.中华消化杂志,1998，18:101-103.
2，Carloni V,Romanelli RG,Pinzani M，et al.Focal adhesion kinase and phospholipase C gamma involvement in adhesion and migration of human hepatic stellate cells.Gastroenterology,1997，112:522-531.
收稿日期：1999-07-17, 百拇医药
单位：展玉涛 李定国(上海第二医科大学新华医院 200092)；尤大钰 姜藻 刘琛 王红(南京铁道医学院)
关键词：
中华内科杂志000721 动物实验研究表明维生素E(Vit E)具有抗肝纤维化作用[1]，但其具体机制不明。目前认为肝星状细胞(HSC)在肝纤维化形成中起关键作用[2]。为探讨Vit E抗肝纤维化的细胞学机制，我们以白细胞介素-2(IL -2)及肿瘤坏死因子α(TNFα)作为刺激因素观察了Vit E对大鼠HSC增殖和胶原合成的调控作用。
—、材料和方法
1.实验动物：雄性SD大鼠，体重550 g。
, http://www.100md.com
2.大鼠HSC的分离和培养：采用链酶蛋白酶和胶原酶液原位循环灌注消化肝脏，经11% Metrizamide液一步密度梯度离心分离大鼠HSC。将分离的HSC按2.5×105/ml接种于24孔培养板中，每孔1 ml。
3.实验分组：培养7d后按下列分组(每组6复孔)处理：(1)空白对照组；(2)IL-2组(100 U/ml)；(3)IL-2+Vit E(0.1 mol/L)；(4)IL-2+Vit E(0.2 mol/L)；(5)IL-2+Vit E(0.3 mol/L)；(6)TNFα (1 000 U/ml)；(7)TNFα+Vit E(0.1 mol/L)；(8)TNFα+Vit E (0.2 mol/L)；(9)TNFα+Vit E (0.3 mol/L)。
4.细胞增殖和胶原合成的测定：按以上分组施加处理因素作用24h后对各组的3复孔加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) (3.7×108 Bq/L)继续培养4h，各组的另3复孔加入3H-脯氨酸(3.7×108Bq/L)继续培养24 h，用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA液消化细胞脱离孔壁，置细胞移于F49型纤维膜上，经生理盐水洗涤后以10%三氯醋酸固定18 h，再以HCl 5 mol/L脱水，70℃烤箱中烘1h，然后置于闪烁瓶中并加闪烁液3 ml。以Bq/2.5×105 个细胞表示其活性。以t检验进行显著性检验。
, 百拇医药
5.倒置相差显微镜下观察各组细胞形态及损伤程度。
二、结果
1.IL-2及TNFα对HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响:见表1。
2.Vit E对IL-2作用的HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响：见表2。
3.Vit E对TNFα作用的HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响:见表3。
4.倒置显微镜下HSC形态:正常对照组、IL-2组、TNFα组及Vit E处理的各组HSC，其细胞核完整，无细胞脱失区，无细胞碎片。
, http://www.100md.com
表1 IL-2及TNFα对HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响(Bq×103，
±s) 组别3 H-TdR
3 H-脯氨酸
空白对照组
87.1± 4.6
127.6±5.8
IL-2组
214.1± 7.2***
, 百拇医药
165.9±7.0**
TNFα组
106.2±11.2*
66.4±5.2**
注：各组样本数均为3 与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001表2 VitE对IL-2作用的HSC 3 H-TdR和3H-脯氨酸掺入量的影响(Bq×103，
±s) Vit E (mol/L)3 H-TdR
, http://www.100md.com
3 H-脯氨酸
0.0
214.1± 7.2
165.9±7.0
0.1
171.2± 8.6**
144.3±5.5*
0.2
139.2±11.2**
133.6±5.8**
0.3
, http://www.100md.com
124.2± 7.2**
132.7±6.5**
注：IL-2均为100 U/ml，各组样本数均为3 与仅用IL-2组比较，*P<0.05,**P<0.01表3 VitE对TNFα作用的HSC 3 H-TdR和3 H-脯氨酸掺入量的影响(Bq×103，
±s) Vit E (mol/L)3 H-TdR
3 H-脯氨酸
0.0
, 百拇医药
106.2±7.1
69.6±5.2
0.1
100.9±5.6*
54.3±5.9**
0.2
92.4±4.9*
50.9±5.3**
0.3
88.5±6.5**
48.4±5.6**
, 百拇医药
注：TNFα浓度均为1 000 U/ml；各组样本数均为3 与仅用TNFα组比较，*P>0.05,**P<0.05 讨论 临床研究发现原发性胆汁性肝硬化或慢性肝硬化患者血清Vit E低于正常水平。动物实验结果表明Vit E能抑制大鼠肝纤维化的形成[1]。上述资料提示临床上应用Vit E对于阻止慢性肝病患者向肝硬化发展可能是有益的。
我们发现TNFα及IL-2 能增加HSC增殖，IL-2能增加HSC胶原合成，TNFα能抑制HSC胶原合成，Vit E能抑制IL-2或TNFα引起的HSC增殖，并能抑制IL-2引起的HSC胶原合成，增强TNFα对HSC胶原合成的抑制作用。Vit E对HSC增殖及胶原合成的抑制可能是其抗肝纤维化的重要作用机制之一。我们发现倒置显微镜下各组细胞核完整，无细胞脱失区，无细胞碎片，提示Vit E对HSC的影响不是通过细胞毒作用实现的。Vit E影响HSC增殖及胶原合成的具体机制不明，有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：铁道部科技基金资助课题(J96Z009)
参考文献
1，王雅凡，李奇芬，王洪，等.维生素E抗大鼠四氯化碳所致肝纤维化的实验研究.中华消化杂志,1998，18:101-103.
2，Carloni V,Romanelli RG,Pinzani M，et al.Focal adhesion kinase and phospholipase C gamma involvement in adhesion and migration of human hepatic stellate cells.Gastroenterology,1997，112:522-531.
收稿日期：1999-07-17, 百拇医药