恶性血液病患者降钙素基因高度甲基化检测的临床意义
作者：管洪在 乔宏 卢伟 谭齐贤
单位：山东省青岛大学医学院血液学教研室 266021
关键词：
中华内科杂志000824 我们利用限制性内切酶和聚合酶链反应(PCR)技术对恶性血液病进行降钙素基因异常甲基化研究，旨在探讨降钙素基因高度甲基化与恶性血液病发生、发展的关系，从而为恶性血液病的诊断、鉴别诊断以及预后判断提供一个可靠的基因标志。
一、资料与方法
1.标本来源：根据FAB标准确诊的急性淋巴细胞白血病(ALL)30例。急性非淋巴细胞白血病(ANLL)34例。慢性粒细胞白血病(CML)51例,其中慢性期32例，加速期8例，急变期11例。骨髓增生异常综合征(MDS)20例，其中难治性贫血 (RA) 6例，环形铁粒幼红细胞性难治性贫血(RARS) 2例，原始细胞过多性难治性贫血(RAEB)6例，转化性原始细胞过多性难治性贫血(RAEB-t) 4例，慢性单核细胞白血病(CMMoL) 2例。恶性淋巴瘤14例，其中霍奇金病6例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)8例。完全缓解(CR)的急性白血病(AL)17例。对照组30例，包括良性血液病20例，正常人10例。阳性对照为HL-60细胞株。
, http://www.100md.com
2.DNA的提取：参照文献[1]略加改进。
3.限制性内切酶的消化：每份标本取DNA 2 μg，以20 U HpⅡ充分消化DNA。
4.PCR扩增：参照文献[2]引物对2293-2294,序列为：2293，5′-CCTCTGATCCAAGCCACCTC-3′；2294，5′-CGCCTGCT-GGCACCTCAGTC-3′。循环30个周期后取扩增产物行聚丙烯酰胺电泳，溴化乙锭染色，紫外投射反射仪检测并照相。分子量标记为PBR322/Hae Ⅲ。
5.扩增产物的半定量分析：引用竞争性PCR的概念，测定特异性带(566 bp)与非特异带(639 bp)的吸光度值A，计算 A566/A639，比值≥1为降钙素基因高度甲基化阳性，<1则为阴性。
6.统计学方法：χ2检验。
, 百拇医药
二、结果
166例恶性血液病患者中，94例降钙素基因高度甲基化阳性。每组病例的结果分别为：(1) 30例ALL中21例阳性，阳性率为70.0%；34例ANLL中27例阳性，阳性率为79.4%。(2)51例CML 23例阳性，阳性率为45.1%。其中慢性期8例阳性，加速期5例阳性而急变期有10例阳性，阳性率分别为 25.0%(8/32) 、62.5%(5/8)、90.9%(10/11)，阳性率随疾病的进展呈递增趋势(χ2=15.5，P<0.05)。对8 例慢性期阳性的病人经一年多的临床随访，发现在之后的2～8个月内有4例发生急淋变，1例骨髓坏死，1 例骨髓纤维化，另有2例仍处于慢性期。(3) 20例MDS中14例阳性，阳性率为70.0%，其中RA 2例，RARS 1例，RAEB 5例，RAEB-t 4例，CMMoL 2 例。(4)14例淋巴瘤9例阳性，阳性率为64.3%。(5) 17例CR的AL有10例阳性，阳性率为58.8%，随访发现10例阳性病人有7例在半年内复发，而7例阴性病人仅有2例在同期内复发。(6)10例正常人及20 例良性血液病患者均为阴性。
, http://www.100md.com
讨论 降钙素基因位于人类11号染色体短臂11P15，长约39 Kb[3]。降钙素基因5′端的基因区域包含了许多肿瘤抑制因子，它的高度甲基化能潜在地抑制肿瘤抑制基因的转录和(或)产生不稳定的因素，这些将促使正常组织细胞的异常生长并向肿瘤细胞分化，研究发现其5′“CCGG”位点的高度甲基化与人类小细胞肺癌、结肠癌、淋巴瘤及白血病等恶性疾病密切相关[3]。
我们检测了恶性血液病患者166例，发现70.0% ALL、79.4% ANLL、70.0% MDS，45.1%的CML及64.3%恶性淋巴瘤发生了降钙素基因高度甲基化。ANLL、ALL及MDS的各亚型均发现不同程度的阳性。良性血液病及正常人均阴性。这表明降钙素基因高度甲基化与恶性克隆增殖密切相关，是一个新的检测恶性血液病通用的分子标志。高度甲基化阳性的CR病人复发率较高，而阴性病人同期内复发率较低，这说明降钙素基因的高度甲基化与病人的预后密切相关。
, 百拇医药
CML是一种发展较为缓慢的骨髓增生性疾病。目前,尚无预测CML病程进展的实验室指标，Ph染色体易位所致的ABL/BCR融合基因的出现只是提供了CML的基因标志，出现在整个病程中，它与CML的病程进展没有直接关系，因此,不能用来作为判断CML恶化的基因标志。 Malinen等[4]的研究发现在CML的慢性阶段降钙素基因高度甲基化是CML病情进展的一个预先征兆，它比出现临床症状或骨髓形态学的改变提前2～8个月预测CML的病情进展。本实验结果也说明在CML的加速期与急变期降钙素 基因高度甲基化的阳性率明显增高且呈递增趋势，而在疾病的慢性期仅25.0%的病人呈阳性，由此可见降钙素基因的高度甲基化与CML的临床分期有着密切的关系，降钙素基因的高度甲基化是CML病情进展一个有临床价值的分子基因标志。
NHL是淋巴系统的恶性肿瘤，随病情进展常出现骨髓及外周血受累，但常规形态学检查诊断率低。我们检测了骨髓常规检查全部阴性的NHL病人14例，其中9例降钙素基因高度甲基化阳性，阳性率达64.3%。 由此可见降钙素基因高度甲基化是检测微量肿瘤细胞的标志。
, http://www.100md.com
基金项目：山东省教委资助项目(J90K05)
参考文献
1，Fey MF, Pilkington SP, Summers C, et al. Molecular diagnosis of haematological disorders using DNA from stored bone marrow slides. Br J Haematol,1987,67: 489-492.
2，Fukuhara T, Hooper WC, Baylin SB, et al. Use of the polymerase chain reaction to detect hypermethylation in the calcitonin gene. A new sensitive approach to monitor tumor cells in acute myelogenous leukemia. Leukemia Res, 1992,16 :1031-1040.
, http://www.100md.com
3，Przepiorka D, Baylin SB, McBride OW, et al. The humas calcitonin gene is located on the short arm of chromsome 11. Biochem Biophys Res Commun,1984,120:493-499.
4，Malinen T, Palotie A, Pakkala S, et al. Acceleration of chronic myeloid leukemia correlates with calcitonin gene hypermethylation. Blood, 1991, 77:2435-2440.
(收稿日期：1999-08-11), http://www.100md.com
单位：山东省青岛大学医学院血液学教研室 266021
关键词：
中华内科杂志000824 我们利用限制性内切酶和聚合酶链反应(PCR)技术对恶性血液病进行降钙素基因异常甲基化研究，旨在探讨降钙素基因高度甲基化与恶性血液病发生、发展的关系，从而为恶性血液病的诊断、鉴别诊断以及预后判断提供一个可靠的基因标志。
一、资料与方法
1.标本来源：根据FAB标准确诊的急性淋巴细胞白血病(ALL)30例。急性非淋巴细胞白血病(ANLL)34例。慢性粒细胞白血病(CML)51例,其中慢性期32例，加速期8例，急变期11例。骨髓增生异常综合征(MDS)20例，其中难治性贫血 (RA) 6例，环形铁粒幼红细胞性难治性贫血(RARS) 2例，原始细胞过多性难治性贫血(RAEB)6例，转化性原始细胞过多性难治性贫血(RAEB-t) 4例，慢性单核细胞白血病(CMMoL) 2例。恶性淋巴瘤14例，其中霍奇金病6例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)8例。完全缓解(CR)的急性白血病(AL)17例。对照组30例，包括良性血液病20例，正常人10例。阳性对照为HL-60细胞株。
, http://www.100md.com
2.DNA的提取：参照文献[1]略加改进。
3.限制性内切酶的消化：每份标本取DNA 2 μg，以20 U HpⅡ充分消化DNA。
4.PCR扩增：参照文献[2]引物对2293-2294,序列为：2293，5′-CCTCTGATCCAAGCCACCTC-3′；2294，5′-CGCCTGCT-GGCACCTCAGTC-3′。循环30个周期后取扩增产物行聚丙烯酰胺电泳，溴化乙锭染色，紫外投射反射仪检测并照相。分子量标记为PBR322/Hae Ⅲ。
5.扩增产物的半定量分析：引用竞争性PCR的概念，测定特异性带(566 bp)与非特异带(639 bp)的吸光度值A，计算 A566/A639，比值≥1为降钙素基因高度甲基化阳性，<1则为阴性。
6.统计学方法：χ2检验。
, 百拇医药
二、结果
166例恶性血液病患者中，94例降钙素基因高度甲基化阳性。每组病例的结果分别为：(1) 30例ALL中21例阳性，阳性率为70.0%；34例ANLL中27例阳性，阳性率为79.4%。(2)51例CML 23例阳性，阳性率为45.1%。其中慢性期8例阳性，加速期5例阳性而急变期有10例阳性，阳性率分别为 25.0%(8/32) 、62.5%(5/8)、90.9%(10/11)，阳性率随疾病的进展呈递增趋势(χ2=15.5，P<0.05)。对8 例慢性期阳性的病人经一年多的临床随访，发现在之后的2～8个月内有4例发生急淋变，1例骨髓坏死，1 例骨髓纤维化，另有2例仍处于慢性期。(3) 20例MDS中14例阳性，阳性率为70.0%，其中RA 2例，RARS 1例，RAEB 5例，RAEB-t 4例，CMMoL 2 例。(4)14例淋巴瘤9例阳性，阳性率为64.3%。(5) 17例CR的AL有10例阳性，阳性率为58.8%，随访发现10例阳性病人有7例在半年内复发，而7例阴性病人仅有2例在同期内复发。(6)10例正常人及20 例良性血液病患者均为阴性。
, http://www.100md.com
讨论 降钙素基因位于人类11号染色体短臂11P15，长约39 Kb[3]。降钙素基因5′端的基因区域包含了许多肿瘤抑制因子，它的高度甲基化能潜在地抑制肿瘤抑制基因的转录和(或)产生不稳定的因素，这些将促使正常组织细胞的异常生长并向肿瘤细胞分化，研究发现其5′“CCGG”位点的高度甲基化与人类小细胞肺癌、结肠癌、淋巴瘤及白血病等恶性疾病密切相关[3]。
我们检测了恶性血液病患者166例，发现70.0% ALL、79.4% ANLL、70.0% MDS，45.1%的CML及64.3%恶性淋巴瘤发生了降钙素基因高度甲基化。ANLL、ALL及MDS的各亚型均发现不同程度的阳性。良性血液病及正常人均阴性。这表明降钙素基因高度甲基化与恶性克隆增殖密切相关，是一个新的检测恶性血液病通用的分子标志。高度甲基化阳性的CR病人复发率较高，而阴性病人同期内复发率较低，这说明降钙素基因的高度甲基化与病人的预后密切相关。
, 百拇医药
CML是一种发展较为缓慢的骨髓增生性疾病。目前,尚无预测CML病程进展的实验室指标，Ph染色体易位所致的ABL/BCR融合基因的出现只是提供了CML的基因标志，出现在整个病程中，它与CML的病程进展没有直接关系，因此,不能用来作为判断CML恶化的基因标志。 Malinen等[4]的研究发现在CML的慢性阶段降钙素基因高度甲基化是CML病情进展的一个预先征兆，它比出现临床症状或骨髓形态学的改变提前2～8个月预测CML的病情进展。本实验结果也说明在CML的加速期与急变期降钙素 基因高度甲基化的阳性率明显增高且呈递增趋势，而在疾病的慢性期仅25.0%的病人呈阳性，由此可见降钙素基因的高度甲基化与CML的临床分期有着密切的关系，降钙素基因的高度甲基化是CML病情进展一个有临床价值的分子基因标志。
NHL是淋巴系统的恶性肿瘤，随病情进展常出现骨髓及外周血受累，但常规形态学检查诊断率低。我们检测了骨髓常规检查全部阴性的NHL病人14例，其中9例降钙素基因高度甲基化阳性，阳性率达64.3%。 由此可见降钙素基因高度甲基化是检测微量肿瘤细胞的标志。
, http://www.100md.com
基金项目：山东省教委资助项目(J90K05)
参考文献
1，Fey MF, Pilkington SP, Summers C, et al. Molecular diagnosis of haematological disorders using DNA from stored bone marrow slides. Br J Haematol,1987,67: 489-492.
2，Fukuhara T, Hooper WC, Baylin SB, et al. Use of the polymerase chain reaction to detect hypermethylation in the calcitonin gene. A new sensitive approach to monitor tumor cells in acute myelogenous leukemia. Leukemia Res, 1992,16 :1031-1040.
, http://www.100md.com
3，Przepiorka D, Baylin SB, McBride OW, et al. The humas calcitonin gene is located on the short arm of chromsome 11. Biochem Biophys Res Commun,1984,120:493-499.
4，Malinen T, Palotie A, Pakkala S, et al. Acceleration of chronic myeloid leukemia correlates with calcitonin gene hypermethylation. Blood, 1991, 77:2435-2440.
(收稿日期：1999-08-11), http://www.100md.com