细胞因子诱导人胸膜细胞释放纤溶酶原激活物抑制剂-1的研究
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中华内科杂志 2000年第9期第39卷
作者：闵锐 李淑云 王虹 张劲松 王彤 杨玉
单位：210029 南京医科大学第一附属医院呼吸内科
关键词：胸膜；间皮细胞；细胞因子；纤溶酶原激活物抑制物1
中华内科杂志000908 【摘要】 目的 研究细胞因子对人胸膜间皮细胞(HPMC)释放纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的诱导效应。方法 取材于渗出性胸膜腔积液的6份原代HPMC，置于DMEM/F12培养液中体外孵育, 观察白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子α(TNFα)和转化生长因子(TGF)-β1对HPMC纤溶活动的影响。对分离细胞的纯度进行光镜下细胞学形态、电镜下超微结构和免疫组化染色的鉴定,加入IL-1β、TNFα及TGF-β1诱导培养第三代HPMC 24 h后，对HPMC培养液中PAI-1活性采用底物显色法进行测定。结果 终浓度为0.20、2.00和20.00 μg/L 水平的IL-1β、TNFα或TGF-β1诱导培养第三代HPMC 24 h后，均能显著增加HPMC培养液中的PAI-1活性,而且HPMC对TGF-β1的反应显著高于对IL-1β或TNFα的反应。结论 炎症细胞因子在体内可能调节HPMC释放PAI-1,由此影响纤维蛋白在胸膜腔内的沉积而向纤维化发展。
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Cytokine-induced release of plasminogen activator inhibitor-1 by human pleural mesothelial cells
MIN Rui, LI Shuyun,WANG Hong,et al.
Department of Pulmonology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of inflammatory cytokines on the production of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) by human pleural mesothelial cells (HPMC). Methods Six primary cultures of HPMC isolated from patients with exudative pleural effusion were incubated in DMEM/F12 medium to examine the effect of interleukin-1β(IL-1β), tumor necrosis factor-α(TNFα) or transforming growth factor-β1(TGF-β1) on the fibrinolytic properties of HPMC in vitro. The purity of the cell population was assessed by morphologic, ultrastructural and immunohistochemical characteristics. PAI-1 activity in the conditioned media of third passage HPMC was detected using chromogenic substrate method. Results As compared with the controls, PAI-1 activity in the conditioned media of HPMC increased significantly by stimulation with IL-1β,TNFα or TGF-β1 for 24 hours at the level of 0.20 μg/L(IL-1β:q=3.38,P<0.05; TNFα:q=4.41,P<0.05;TGF-β1:q=22.03,P<0.01), 2.00 μg/L(IL-1β:q=12.28,P<0.01; TNFα:q=16.60,P<0.01; TGF-β1:q=19.23,P<0.01) and 20.00 μg/L(IL-1β:q=24.30,P<0.01; TNFα:q=25.00,P<0.01; TGF-β1: q=49.30,P<0.01). Furthermore, HPMC responses to TGF-β1 were significantly greater than those to IL-1β or TNFα. Conclusion These results suggest that inflammatory cytokines might mediate the release of PAI-1 by HPMC in vivo, affect the deposition of fibrin within the pleural cavity and favor fibrogenesis.
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【Key words】 Pleura； Mesothelial cells； Cytokines； Plasminogen activator inhibitor 1
各种原因引起的胸膜损伤其预后可能是痊愈,重建胸膜单层间皮细胞，或是出现纤维化,胸膜增厚形成纤维包膜,决定发生胸膜纤维化的调控机制至今尚未完全阐明。国外近年研究显示，纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)在胸膜腔纤溶/促凝(fibrinolytic / procoagulation)平衡调节中起重要作用,并影响胸膜纤维化进程[1,2]。由于腹膜也涉及浆膜纤维化问题,如普外科术后腹膜粘连、肾科长期腹膜透析出现的腹膜纤维化等,目前针对腹膜间皮细胞的研究在方法和观点上趋于成熟,已证实前炎症细胞因子脂多糖、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子α(TNFα)和转化生长因子(TGF)-β1可诱导腹膜间皮细胞合成PAI-1[3],鉴于胸膜和腹膜在组织学上均系间皮细胞,起源于中胚层体腔膜，互相具有借鉴意义,为此我们分离培养了人胸膜间皮细胞( HPMC),并对细胞因子诱导HPMC释放PAI-1效应进行研究。
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材料和方法
一、材料
1.研究对象：胸膜腔积液标本取自我院呼吸内科住院及门诊14例有胸膜腔积液的患者,分离后经HPMC细胞纯度鉴定有6例患者的胸膜腔积液标本达到实验要求，其中男4例，女2例, 平均年龄(41.3±8.0)岁。
2.主要试剂和设备：DMEM/F12细胞培养液(1∶1，Hyclone公司)，转铁蛋白(Sigma公司)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，胰蛋白酶(Sigma公司)，重组人细胞因子IL-1β、TNFα、TGF-β1(Promega公司)，抗细胞角蛋白、抗波形蛋白、抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原的鼠抗人单克隆抗体(DAKO公司)，ABC kit (DAKO公司)，PAI-1活性测定试剂盒(上海医科大学分子学遗传室提供)。33365/N型细胞培养箱(Forma Scientific公司);DIAPHOTTMO型倒置相差显微镜(Nikon公司); EM-400Philips透射电镜;SX-40型扫描电镜等。
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二、方法
1.HPMC的分离和体外培养：在无菌条件下经胸穿分别抽取胸膜腔积液200～300 ml,参照Griffith等[4]的方法分离HPMC后加入DMEM/F12培养液(内含青霉素100 kU/L,链霉素100 mg/L,转铁蛋白0.5 mg/L,胰岛素10 U/L,氢化可的松1 mg/L,15%新生牛血清), 以1×104/ml细胞浓度接种于培养瓶内,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
2.HPMC细胞纯度的鉴定：(1)细胞学形态观察:使用盖片细胞培养技术将第二代HPMC进行HE染色,光镜下观察细胞形态。(2)细胞表面标志鉴定:以ABC 法分别用抗细胞角蛋白、抗波形蛋白、抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原的鼠抗人单克隆抗体做免疫细胞化学染色,实验中均设置阳性和阴性对照。(3)细胞超微结构观察：透射电子显微镜观察时先取足量HPMC细胞悬液,离心后戊二醛固定,经醋酸铀染色，丙酮梯度脱水，包埋后超薄切片,上支持膜电镜观察; 扫描电子显微镜时先用盖片培养技术将HPMC分别经戊二醛和四氧化锇固定，丙酮/醋酸异戊脂脱水，临界点干燥，喷金后电镜观察。
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3.PAI-1活性检测：将第二代培养的HPMC用胰蛋白酶消化,用不含新生牛血清的DMEM/F12将第三代HPMC调成浓度为2×105/ml细胞悬液,在96孔细胞培养板中每孔加100 μl,同时分别加入细胞因子IL-1β、TNFα、TGF-β1,使其终浓度分别为0.02 μg/L、0.20 μg/L、2.00 μg/L及20.00 μg/L, 并设空白对照(不加任何细胞因子,单纯DMEM/F12培养),孵育24 h后吸取上清,参照张欣平等[5]的方法用PAI-1活性测定试剂盒检测其中PAI-1的活性。
三、统计学方法
数据以
±s表示,采用多组资料方差分析(ANOVA)F检验,若有组间差异用两样本均数间q检验(Newman-Keuls法),P<0.05为差异有显著性。
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结果
一、HPMC纯度鉴定
在相差显微镜下可见贴壁生长的HPMC为单层扁平细胞，呈多边形,类似鹅卵石,在生长至汇合状态时尤为典型(图1); HPMC经HE染色后胞浆薄染成淡粉红色，中央为一深蓝色扁圆形核,处于增殖期者双核清晰可见(图2);HPMC经免疫细胞化学染色后抗细胞角蛋白和抗波形蛋白阳性(图3,4),抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原阴性(图5,6);在透射电子显微镜下可见HPMC细胞表面有微绒毛,细胞内有丰富的细胞浆囊泡以及分化成熟的内质网、线粒体(图7)；在扫描电子显微镜下可见HPMC表面大量微绒毛密集排列成丛状,局部放大时可见微绒毛主干上有许多次级微绒毛(图8)。
二、PAI-1的活性变化
采用直线回归法得出标准曲线方程为y=0.899-0.145x，r=-0.996, HPMC经不同浓度的细胞因子诱导培养24h后培养液的结果显示: 三种细胞因子在终浓度分别为0.02 μg/L、0.20μg/L、 2.00 μg/L及20.00 μg/L时均可使HPMC释放PAI-1显著增加，而终浓度为0.02 μg/L时则没有这一显著效应(F=0.27,P>0.05)，见表1。q检验显示，TGF-β1对HPMC释放PAI-1的诱导作用显著高于IL-1β或TNFα(表2)。
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讨论
不少全身性疾病或肺部疾病会波及胸膜，导致胸膜发生炎症反应和病理损伤,胸膜间皮细胞作为胸膜的主要细胞群体必然受到影响。近年的研究表明，HPMC的作用不仅仅是超滤胸膜腔积液和作为分子转运的屏障, 而且主动参与胸膜腔的抗感染和免疫应答反应[6]。研究胸膜纤维化机制的临床意义主要在两个方面： (1) 首先是在感染性胸膜炎,如肺炎旁渗出液、脓胸、结核性胸膜炎等,在使用有效抗生素和充分引流后仍不能完全避免胸膜的粘连、纤维化和胸膜增厚,重者可能形成纤维胸,导致肺膨缩受限、呼吸功能减退。此外，在结核性胸膜炎的治疗方案上,目前国外已有学者否定在化疗基础上加用糖皮质类固醇激素可防治胸膜粘连、纤维化的传统观点[7]。(2)对恶性胸膜腔积液(MPE)、反复自发性气胸施行的胸膜粘连术,是一种人为形成的胸膜粘连、纤维化,却有积极的临床意义,如遏止MPE无限增加或气胸反复发生、减轻MPE的呼吸压迫症状和避免蛋白大量丢失,但对其治疗机制的认识仍不统一。总之,亟待对胸膜纤维化机制进行深入研究, 有助于临床治疗，即按病情需要选择抑制或促进胸膜纤维化进程。
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表1 HPMC经不同浓度细胞因子诱导24 h后培养液中PAI-1的活性变化(×103 IU/L，±s)
PAI-1
PAI-1
终浓度为0.02μg/L
终浓度为2.00μg/L
空白对照
1.91±0.76
空白对照
2.56±0.44
IL-1β
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2.01±0.62
IL-1β
9.07±2.46
TNFα
2.37±0.92
TNFα
11.36±0.61
TGF-β1
2.65±0.71
TGF-β1
13.33±0.56
F值
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0.27
F值
76.89
P值
>0.05
P值
<0.01
终浓度为0.20μg/L
终浓度为20.00μg/L
空白对照
2.33±1.18
空白对照
2.60±0.27
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IL-1β
3.55±0.42
IL-1β
10.62±1.35
TNFα
3.92±0.56
TNFα
10.85±0.57
TGF-β1
10.26±1.13
TGF-β1
18.87±0.63
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F值
96.04
F值
401
P值
<0.01
P值
<0.01
注：*P<0.05，**P<0.01表2 不同浓度下各细胞因子对HPMC释放PAI-1作用的均数q检验
0.20μg/L
2.00μg/L
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20.00μg/L
IL-1β
TNFα
TGF-β1
IL-1β
TNFα
TGF-β1
IL-1β
TNFα
TGF-β1
空白对照
3.38*
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4.41*
22.03**
12.28**
16.60**
19.23**
24.30**
25.00**
49.30**
IL-1β
1.02
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18.64**
3.32
8.04**
0.69
25.00**
TNFα
17.61**
3.72**
24.30**
PAI是组织型纤溶酶原激活物(t-PA)与尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)的特异性快速抑制剂,PAI-1是血浆和组织中主要的PAI,作用远强于PAI-2,在纤溶系统中起着关键作用,以此调控纤维蛋白在胸膜腔和腹膜腔的沉积。在渗出性胸膜腔积液中PAI-1含量是血浆中的80～4 000倍, PAI-1可能来自毛细血管炎性渗出或胸膜腔内细胞的合成[1]。已证实PAI-1广泛分布于成纤维细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞, Idell等[8]采用Northern blot印迹法观察体外培养的HPMC能合成PAI-1和PAI-2,这一过程可被放线菌素与环乙酰胺所阻断,作者认为鉴于HPMC能大量合成和释放PAI-1,可能是胸膜腔积液中高水平PAI-1的主要来源。
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HPMC和其他炎症细胞大量合成与释放PAI-1, 必将影响胸膜损伤后的再生修复,并促使胸膜纤维化。近年来的基础研究显示至少有以下两种机制：首先是在细胞表面存在波状蛋白受体(αvβ3 vitronectin receptor, VNr)与尿激酶受体(urokinase plasminogen activator receptor, uPAr),这两种受体都各有位点可与细胞外基质(ECM)中的波状蛋白结合,这一结合决定着HPMC对ECM的黏附以及移行生长,而PAI-1不但能与t-PA或u-PA结合, 还能结合在波状蛋白的氨基端促生长因子B区或羧基端364～380肽段区, 过量的PAI-1将干扰波状蛋白与HPMC上的VNr或uPAr结合, 使HPMC无法与ECM黏附,因此抑制HPMC的移行生长,可影响胸膜的修复和再生[2,9]。 其次，PAI-1对纤溶酶活性的抑制也影响着ECM重建, 不仅在于纤溶酶能直接降解数种ECM成分,而且基质金属蛋白酶( MMP)的激活也依赖纤溶酶的参与。MMP可降解至少一种ECM成分,纤溶酶与MMP的协同作用能够降解几乎所有的ECM成分, PAI-1对纤溶酶活性的抑制必将从另一个方面影响ECM的重建[10]。
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本实验不仅观察到IL-1β、TNFα对HPMC释放PAI-1的诱导作用,而且观察和比较了TGF-β1的诱导作用。因为，既往的研究显示，TGF-β1是一种重要的促纤维化细胞因子,具有促进成纤维细胞在炎症部位的聚集和ECM合成增加等功能。本实验中TGF-β1对HPMC释放PAI-1的诱导作用要显著高于IL-1β、TNFα，与Tietze等[3]对腹膜间皮细胞研究的结果类似。总之, 对细胞因子诱导HPMC释放PAI-1进行深入研究有助于进一步揭示胸膜纤维化的机制。
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图1 人胸膜间皮细胞(HPMC)生长至汇合状态,呈多边形 倒置相差显微镜 ×200 图2 HPMC胞浆薄染成淡粉红色，中央为一深蓝色扁圆形核,处于增殖期者可见双核 HE ×200 图3 HPMC抗细胞角蛋白阳性 ABC ×100 图4 HPMC抗波形蛋白阳性 ABC ×100 图5 抗第Ⅷ因子相关抗原阴性 ABC ×100 图6 抗CD45抗原阴性 ABC ×100
图7 人胸膜间皮细胞(HPMC)细胞表面有微绒毛,细胞内有丰富的细胞浆囊泡以及分化成熟的内质网、线粒体 透射电子显微镜 × 3 000 图8 HPMC表面大量微绒毛密集排列成丛状 扫描电子显微镜 ×3 500
志谢 南京医科大学呼吸内科教研室殷凯生教授、黄茂副教授等以及附院中心实验室张寄南教授、丁小健老师等给予本研究鼎力协助和支持
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参考文献
1，Idell S,Girard W,Koenig KB,et al.Abnormalities of pathways in fibrin turnover of the human pleural space. Am Rev Respir Dis, 1991,144:187-194.
2，Rougier JP,Guia S,Hagege J,et al. PAI-1 secretion and matrix deposition in human peritoneal mesothelial cell cultures: transcriptional regulation by TGF-beta 1. Kidney Int， 1998,54:87-98.
3，Tietze L,Elbrecht A,Schauerte C,et al. Modulation of pro- and antifibrinolytic properties of human peritoneal mesothelial cells by transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1),tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha)and interleukin 1 beta(IL-1 beta).Thromb Haemost, 1998,79:362-370.
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6，Antony VB,Hott JW,Kunkel SL,et al. Pleural mesothelial cell expression of C-C(monocyte chemotactic peptide)and C-X-C(interleukin 8)chemokines. Am J Respir Cell Mol Biol, 1995,12:581-588.
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7，Wyser C,Bernard W. Using corticosteroids to treat tuberculous pleurisy.Chest,1997, 112:291-292.
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9，Waltz DA,Natkin LR,Fujita RM,et al.Plasmin and plasminogen activator inhibitor type 1 promote cellular motility by regulating the interaction between the urokinase receptor and vitronectin. J Clin Invest, 1997, 100:58-67.
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(收稿日期：2000-05-15), 百拇医药
单位：210029 南京医科大学第一附属医院呼吸内科
关键词：胸膜；间皮细胞；细胞因子；纤溶酶原激活物抑制物1
中华内科杂志000908 【摘要】 目的 研究细胞因子对人胸膜间皮细胞(HPMC)释放纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的诱导效应。方法 取材于渗出性胸膜腔积液的6份原代HPMC，置于DMEM/F12培养液中体外孵育, 观察白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子α(TNFα)和转化生长因子(TGF)-β1对HPMC纤溶活动的影响。对分离细胞的纯度进行光镜下细胞学形态、电镜下超微结构和免疫组化染色的鉴定,加入IL-1β、TNFα及TGF-β1诱导培养第三代HPMC 24 h后，对HPMC培养液中PAI-1活性采用底物显色法进行测定。结果 终浓度为0.20、2.00和20.00 μg/L 水平的IL-1β、TNFα或TGF-β1诱导培养第三代HPMC 24 h后，均能显著增加HPMC培养液中的PAI-1活性,而且HPMC对TGF-β1的反应显著高于对IL-1β或TNFα的反应。结论 炎症细胞因子在体内可能调节HPMC释放PAI-1,由此影响纤维蛋白在胸膜腔内的沉积而向纤维化发展。
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Cytokine-induced release of plasminogen activator inhibitor-1 by human pleural mesothelial cells
MIN Rui, LI Shuyun,WANG Hong,et al.
Department of Pulmonology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of inflammatory cytokines on the production of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) by human pleural mesothelial cells (HPMC). Methods Six primary cultures of HPMC isolated from patients with exudative pleural effusion were incubated in DMEM/F12 medium to examine the effect of interleukin-1β(IL-1β), tumor necrosis factor-α(TNFα) or transforming growth factor-β1(TGF-β1) on the fibrinolytic properties of HPMC in vitro. The purity of the cell population was assessed by morphologic, ultrastructural and immunohistochemical characteristics. PAI-1 activity in the conditioned media of third passage HPMC was detected using chromogenic substrate method. Results As compared with the controls, PAI-1 activity in the conditioned media of HPMC increased significantly by stimulation with IL-1β,TNFα or TGF-β1 for 24 hours at the level of 0.20 μg/L(IL-1β:q=3.38,P<0.05; TNFα:q=4.41,P<0.05;TGF-β1:q=22.03,P<0.01), 2.00 μg/L(IL-1β:q=12.28,P<0.01; TNFα:q=16.60,P<0.01; TGF-β1:q=19.23,P<0.01) and 20.00 μg/L(IL-1β:q=24.30,P<0.01; TNFα:q=25.00,P<0.01; TGF-β1: q=49.30,P<0.01). Furthermore, HPMC responses to TGF-β1 were significantly greater than those to IL-1β or TNFα. Conclusion These results suggest that inflammatory cytokines might mediate the release of PAI-1 by HPMC in vivo, affect the deposition of fibrin within the pleural cavity and favor fibrogenesis.
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【Key words】 Pleura； Mesothelial cells； Cytokines； Plasminogen activator inhibitor 1
各种原因引起的胸膜损伤其预后可能是痊愈,重建胸膜单层间皮细胞，或是出现纤维化,胸膜增厚形成纤维包膜,决定发生胸膜纤维化的调控机制至今尚未完全阐明。国外近年研究显示，纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)在胸膜腔纤溶/促凝(fibrinolytic / procoagulation)平衡调节中起重要作用,并影响胸膜纤维化进程[1,2]。由于腹膜也涉及浆膜纤维化问题,如普外科术后腹膜粘连、肾科长期腹膜透析出现的腹膜纤维化等,目前针对腹膜间皮细胞的研究在方法和观点上趋于成熟,已证实前炎症细胞因子脂多糖、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子α(TNFα)和转化生长因子(TGF)-β1可诱导腹膜间皮细胞合成PAI-1[3],鉴于胸膜和腹膜在组织学上均系间皮细胞,起源于中胚层体腔膜，互相具有借鉴意义,为此我们分离培养了人胸膜间皮细胞( HPMC),并对细胞因子诱导HPMC释放PAI-1效应进行研究。
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材料和方法
一、材料
1.研究对象：胸膜腔积液标本取自我院呼吸内科住院及门诊14例有胸膜腔积液的患者,分离后经HPMC细胞纯度鉴定有6例患者的胸膜腔积液标本达到实验要求，其中男4例，女2例, 平均年龄(41.3±8.0)岁。
2.主要试剂和设备：DMEM/F12细胞培养液(1∶1，Hyclone公司)，转铁蛋白(Sigma公司)，新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，胰蛋白酶(Sigma公司)，重组人细胞因子IL-1β、TNFα、TGF-β1(Promega公司)，抗细胞角蛋白、抗波形蛋白、抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原的鼠抗人单克隆抗体(DAKO公司)，ABC kit (DAKO公司)，PAI-1活性测定试剂盒(上海医科大学分子学遗传室提供)。33365/N型细胞培养箱(Forma Scientific公司);DIAPHOTTMO型倒置相差显微镜(Nikon公司); EM-400Philips透射电镜;SX-40型扫描电镜等。
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二、方法
1.HPMC的分离和体外培养：在无菌条件下经胸穿分别抽取胸膜腔积液200～300 ml,参照Griffith等[4]的方法分离HPMC后加入DMEM/F12培养液(内含青霉素100 kU/L,链霉素100 mg/L,转铁蛋白0.5 mg/L,胰岛素10 U/L,氢化可的松1 mg/L,15%新生牛血清), 以1×104/ml细胞浓度接种于培养瓶内,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
2.HPMC细胞纯度的鉴定：(1)细胞学形态观察:使用盖片细胞培养技术将第二代HPMC进行HE染色,光镜下观察细胞形态。(2)细胞表面标志鉴定:以ABC 法分别用抗细胞角蛋白、抗波形蛋白、抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原的鼠抗人单克隆抗体做免疫细胞化学染色,实验中均设置阳性和阴性对照。(3)细胞超微结构观察：透射电子显微镜观察时先取足量HPMC细胞悬液,离心后戊二醛固定,经醋酸铀染色，丙酮梯度脱水，包埋后超薄切片,上支持膜电镜观察; 扫描电子显微镜时先用盖片培养技术将HPMC分别经戊二醛和四氧化锇固定，丙酮/醋酸异戊脂脱水，临界点干燥，喷金后电镜观察。
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3.PAI-1活性检测：将第二代培养的HPMC用胰蛋白酶消化,用不含新生牛血清的DMEM/F12将第三代HPMC调成浓度为2×105/ml细胞悬液,在96孔细胞培养板中每孔加100 μl,同时分别加入细胞因子IL-1β、TNFα、TGF-β1,使其终浓度分别为0.02 μg/L、0.20 μg/L、2.00 μg/L及20.00 μg/L, 并设空白对照(不加任何细胞因子,单纯DMEM/F12培养),孵育24 h后吸取上清,参照张欣平等[5]的方法用PAI-1活性测定试剂盒检测其中PAI-1的活性。
三、统计学方法
数据以
±s表示,采用多组资料方差分析(ANOVA)F检验,若有组间差异用两样本均数间q检验(Newman-Keuls法),P<0.05为差异有显著性。, http://www.100md.com
结果
一、HPMC纯度鉴定
在相差显微镜下可见贴壁生长的HPMC为单层扁平细胞，呈多边形,类似鹅卵石,在生长至汇合状态时尤为典型(图1); HPMC经HE染色后胞浆薄染成淡粉红色，中央为一深蓝色扁圆形核,处于增殖期者双核清晰可见(图2);HPMC经免疫细胞化学染色后抗细胞角蛋白和抗波形蛋白阳性(图3,4),抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原阴性(图5,6);在透射电子显微镜下可见HPMC细胞表面有微绒毛,细胞内有丰富的细胞浆囊泡以及分化成熟的内质网、线粒体(图7)；在扫描电子显微镜下可见HPMC表面大量微绒毛密集排列成丛状,局部放大时可见微绒毛主干上有许多次级微绒毛(图8)。
二、PAI-1的活性变化
采用直线回归法得出标准曲线方程为y=0.899-0.145x，r=-0.996, HPMC经不同浓度的细胞因子诱导培养24h后培养液的结果显示: 三种细胞因子在终浓度分别为0.02 μg/L、0.20μg/L、 2.00 μg/L及20.00 μg/L时均可使HPMC释放PAI-1显著增加，而终浓度为0.02 μg/L时则没有这一显著效应(F=0.27,P>0.05)，见表1。q检验显示，TGF-β1对HPMC释放PAI-1的诱导作用显著高于IL-1β或TNFα(表2)。
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讨论
不少全身性疾病或肺部疾病会波及胸膜，导致胸膜发生炎症反应和病理损伤,胸膜间皮细胞作为胸膜的主要细胞群体必然受到影响。近年的研究表明，HPMC的作用不仅仅是超滤胸膜腔积液和作为分子转运的屏障, 而且主动参与胸膜腔的抗感染和免疫应答反应[6]。研究胸膜纤维化机制的临床意义主要在两个方面： (1) 首先是在感染性胸膜炎,如肺炎旁渗出液、脓胸、结核性胸膜炎等,在使用有效抗生素和充分引流后仍不能完全避免胸膜的粘连、纤维化和胸膜增厚,重者可能形成纤维胸,导致肺膨缩受限、呼吸功能减退。此外，在结核性胸膜炎的治疗方案上,目前国外已有学者否定在化疗基础上加用糖皮质类固醇激素可防治胸膜粘连、纤维化的传统观点[7]。(2)对恶性胸膜腔积液(MPE)、反复自发性气胸施行的胸膜粘连术,是一种人为形成的胸膜粘连、纤维化,却有积极的临床意义,如遏止MPE无限增加或气胸反复发生、减轻MPE的呼吸压迫症状和避免蛋白大量丢失,但对其治疗机制的认识仍不统一。总之,亟待对胸膜纤维化机制进行深入研究, 有助于临床治疗，即按病情需要选择抑制或促进胸膜纤维化进程。
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表1 HPMC经不同浓度细胞因子诱导24 h后培养液中PAI-1的活性变化(×103 IU/L，
±s)PAI-1
PAI-1
终浓度为0.02μg/L
终浓度为2.00μg/L
空白对照
1.91±0.76
空白对照
2.56±0.44
IL-1β
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2.01±0.62
IL-1β
9.07±2.46
TNFα
2.37±0.92
TNFα
11.36±0.61
TGF-β1
2.65±0.71
TGF-β1
13.33±0.56
F值
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0.27
F值
76.89
P值
>0.05
P值
<0.01
终浓度为0.20μg/L
终浓度为20.00μg/L
空白对照
2.33±1.18
空白对照
2.60±0.27
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IL-1β
3.55±0.42
IL-1β
10.62±1.35
TNFα
3.92±0.56
TNFα
10.85±0.57
TGF-β1
10.26±1.13
TGF-β1
18.87±0.63
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F值
96.04
F值
401
P值
<0.01
P值
<0.01
注：*P<0.05，**P<0.01表2 不同浓度下各细胞因子对HPMC释放PAI-1作用的均数q检验
0.20μg/L
2.00μg/L
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20.00μg/L
IL-1β
TNFα
TGF-β1
IL-1β
TNFα
TGF-β1
IL-1β
TNFα
TGF-β1
空白对照
3.38*
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4.41*
22.03**
12.28**
16.60**
19.23**
24.30**
25.00**
49.30**
IL-1β
1.02
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18.64**
3.32
8.04**
0.69
25.00**
TNFα
17.61**
3.72**
24.30**
PAI是组织型纤溶酶原激活物(t-PA)与尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)的特异性快速抑制剂,PAI-1是血浆和组织中主要的PAI,作用远强于PAI-2,在纤溶系统中起着关键作用,以此调控纤维蛋白在胸膜腔和腹膜腔的沉积。在渗出性胸膜腔积液中PAI-1含量是血浆中的80～4 000倍, PAI-1可能来自毛细血管炎性渗出或胸膜腔内细胞的合成[1]。已证实PAI-1广泛分布于成纤维细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞, Idell等[8]采用Northern blot印迹法观察体外培养的HPMC能合成PAI-1和PAI-2,这一过程可被放线菌素与环乙酰胺所阻断,作者认为鉴于HPMC能大量合成和释放PAI-1,可能是胸膜腔积液中高水平PAI-1的主要来源。
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HPMC和其他炎症细胞大量合成与释放PAI-1, 必将影响胸膜损伤后的再生修复,并促使胸膜纤维化。近年来的基础研究显示至少有以下两种机制：首先是在细胞表面存在波状蛋白受体(αvβ3 vitronectin receptor, VNr)与尿激酶受体(urokinase plasminogen activator receptor, uPAr),这两种受体都各有位点可与细胞外基质(ECM)中的波状蛋白结合,这一结合决定着HPMC对ECM的黏附以及移行生长,而PAI-1不但能与t-PA或u-PA结合, 还能结合在波状蛋白的氨基端促生长因子B区或羧基端364～380肽段区, 过量的PAI-1将干扰波状蛋白与HPMC上的VNr或uPAr结合, 使HPMC无法与ECM黏附,因此抑制HPMC的移行生长,可影响胸膜的修复和再生[2,9]。 其次，PAI-1对纤溶酶活性的抑制也影响着ECM重建, 不仅在于纤溶酶能直接降解数种ECM成分,而且基质金属蛋白酶( MMP)的激活也依赖纤溶酶的参与。MMP可降解至少一种ECM成分,纤溶酶与MMP的协同作用能够降解几乎所有的ECM成分, PAI-1对纤溶酶活性的抑制必将从另一个方面影响ECM的重建[10]。
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本实验不仅观察到IL-1β、TNFα对HPMC释放PAI-1的诱导作用,而且观察和比较了TGF-β1的诱导作用。因为，既往的研究显示，TGF-β1是一种重要的促纤维化细胞因子,具有促进成纤维细胞在炎症部位的聚集和ECM合成增加等功能。本实验中TGF-β1对HPMC释放PAI-1的诱导作用要显著高于IL-1β、TNFα，与Tietze等[3]对腹膜间皮细胞研究的结果类似。总之, 对细胞因子诱导HPMC释放PAI-1进行深入研究有助于进一步揭示胸膜纤维化的机制。
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图1 人胸膜间皮细胞(HPMC)生长至汇合状态,呈多边形 倒置相差显微镜 ×200 图2 HPMC胞浆薄染成淡粉红色，中央为一深蓝色扁圆形核,处于增殖期者可见双核 HE ×200 图3 HPMC抗细胞角蛋白阳性 ABC ×100 图4 HPMC抗波形蛋白阳性 ABC ×100 图5 抗第Ⅷ因子相关抗原阴性 ABC ×100 图6 抗CD45抗原阴性 ABC ×100
图7 人胸膜间皮细胞(HPMC)细胞表面有微绒毛,细胞内有丰富的细胞浆囊泡以及分化成熟的内质网、线粒体 透射电子显微镜 × 3 000 图8 HPMC表面大量微绒毛密集排列成丛状 扫描电子显微镜 ×3 500
志谢 南京医科大学呼吸内科教研室殷凯生教授、黄茂副教授等以及附院中心实验室张寄南教授、丁小健老师等给予本研究鼎力协助和支持
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参考文献
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(收稿日期：2000-05-15), 百拇医药