单抗MGb1的噬菌体呈现型ScFv片段的制备
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中华内科杂志 2000年第9期第39卷
作者：何凤田 陈宝军 聂勇战 韩者艺 乔太东 樊代明
单位：何凤田(710032 西安，第四军医大学西京医院消化病研究所 现在第三军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，重庆，400038)；陈宝军 聂勇战 韩者艺 乔太东 樊代明(710032 西安，第四军医大学西京医院消化病研究所)
关键词：胃肿瘤；抗体，单克隆；噬菌体呈现技术
中华内科杂志000903 【摘要】 目的 制备胃癌单抗MGb1的噬菌体呈现型单链可变区片段(ScFv)，为获得用于胃癌体内诊疗研究的靶向载体分子奠定基础。方法 从杂交瘤细胞分离mRNA，扩增抗体重、轻链可变区(VH和VL)cDNA，经linker DNA连接形成ScFv DNA。将ScFv DNA与pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1，经M13KO7感染后，获得重组噬菌体抗体ScFv。经亲和筛选和ELISA检测获得呈现MGb1 ScFv的噬菌体单克隆。结果 VH、VL和ScFv DNA分别约为340 bp、320 bp和750 bp。经筛选得到17个呈现MGb1 ScFv的噬菌体单克隆，其中结合抗原能力强的克隆有4个。结论 获得了单抗MGb1的噬菌体呈现ScFv，为拓展抗体的应用范围创造了条件。
, 百拇医药
Production of phage-displayed single chain variable fragments of monoclonal antibody MGb1
HE Fengtian, CHEN Baojun, NIE Yongzhan, et al.
Institute of Digestive Disease, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China
【Abstract】 Objective To lay a foundation for obtaining a tumor-targeting vehicle for in vivo study on diagnosis and treatment of gastric carcinoma by generating single chain variable fragments(ScFv) of monoclonal antibody MGb1 directed against the cancer. Methods mRNA was isolated from MGb1-producing mouse hybridoma cell line, and the variable regions of heavy and light chain cDNAs were amplified separately and assembled into ScFv DNAs with a specially constructed linker DNA by PCR. The ScFv DNAs were ligated into the phagemid vector pCANTAB5E and the ligated sample was transformed into competent E.coli TG1. The transformed cells were infected with M13KO7 helper phage to yield recombinant phage,which disply ScFv fragments as a fusion with gene 3 protein on the tips of the phage M13. After two rounds of panning with gastric carcinoma cell line KATOⅢ highly expressing MGb1-binding antigen, the phage clones displayed ScFv fragments of the antibody were selected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) from the enriched phages. The affinity of the positive phage clones was detected by competition ELISA. Results The VH,VL and ScFv DNAs were about 340 bp, 320 bp and 750 bp respectively. 17 phage clones displayed ScFv of MGb1 were selected from 40 enriched phage clones. 4 out of the 17 phage clones could strongly compete with the original hybridoma antibody MGb1 for binding to the antigen expressed on KATOⅢ cells. Conclusion The phage-displayed ScFv fragments of monoclonal antibody MGb1 are successfully produced by phage antibody technology, which may be useful to widen the range of application of the antibody.
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【Key words】 Stomach neoplasms; Antibodies， monoclonal; Phage display technology
将异源性抗体小型化可显著降低抗体用于在体研究时所引起的抗-抗体反应。在使抗体小型化的方法中，以噬菌体呈现技术最具优势[1]。胃癌是一种消化道常见恶性肿瘤，我们针对此肿瘤制备的抗胃癌单抗MGb1的特异性好[2]，有可能用于在体研究。为克服全抗体分子用于在体研究时的缺陷和获得抗体稳定的遗传背景，我们借助噬菌体呈现技术，以产MGb1的鼠杂交瘤为材料，制备了抗体的噬菌体呈现型单链可变区片段(single chain variable fragment, ScFv)，为进一步拓宽该抗体的应用范围奠定了基础。
材料与方法
一、主要材料
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鼠抗人胃癌单抗MGb1杂交瘤细胞株由本所制备[2]；鼠ScFv构建、表达及检测试剂盒均为Pharmacia公司产品；mRNA分离试剂盒、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶均为Promega产品；KATOⅢ细胞株由日本东京国立癌症中心引进；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为华美公司产品。
二、实验方法
1. 单抗MGb1的制备：按常规方法将杂交瘤细胞接种于8周龄雌性Balb/c小鼠腹腔制备含单抗MGb1的腹水，以饱和硫酸铵沉淀并透析后，经DEAE52纤维素柱进行梯度洗脱纯化。
2. 杂交瘤细胞mRNA的分离：收集对数期杂交瘤细胞，经一步酚法提取总RNA[3]，按mRNA分离试剂盒说明分离mRNA。
3. ScFv DNA的构建及扩增：按ScFv构建试剂盒说明进行。利用mRNA反转录合成cDNA第一链， 以第一链为模板，按程序1(30个循环：94℃×1 min，55℃×2 min，72℃×2 min)进行PCR，扩增VH和VL cDNA。经程序2(7个循环：94℃× 1 min，63℃×4 min)进行聚合和填充反应，使VH和VL籍linker DNA连接到一起，形成ScFv DNA。继而再经程序1进行PCR，使聚合的ScFv DNA得到扩增并在5′端引入SfiⅠ位点，3′端引入NotⅠ限制酶切位点。
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4. 重组噬菌体抗体ScFv的制备与筛选：按ScFv表达试剂盒进行。先后用SfiⅠ和NotⅠ切割ScFv DNA，纯化后连入噬粒载体pCANTAB5E，连接产物转化于大肠杆菌TG1。将转化产物涂于SOBAG[含氨苄青霉素(A)和葡萄糖(G)的SOB]琼脂平板上，30℃培养至长出克隆。刮下细菌，取2 ml，用2×YT-AG稀释至A600=0.3，37℃摇1h，加入辅助噬菌体M13KO7，再摇1 h，离心弃上清，沉淀用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素的2×YT)培养基重悬后，37℃摇过夜，离心取上清，加入0.2体积的20%PEG8000/2.5 mol NaCl沉淀噬菌体，将沉淀溶解后过滤除菌。
取KATOⅢ细胞，按约1×107/孔离心贴于6孔板底。板干燥后，用0.25%的戊二醛室温固定10 min，PBS洗3次，然后加满10%脱脂奶粉(封阻液)，室温作用2h，同前洗涤。将上述过滤除菌的噬菌体与封阻液按8:7混合，室温作用15 min后，加入6孔板，于37℃孵育2h。先后用PBS和含0.1%吐温20的PBS(PBST)各洗20次，再用PBS洗5次后，加入对数期的大肠杆菌TG1，37℃缓摇1 h，取培养液入三角烧瓶中，加入氨苄青霉素、葡萄糖及M13KO7，同上摇1 h。离心弃上清，沉淀用2×YT-AK重悬后，快速摇过夜。离心取上清，经PEG/NaCl沉淀噬菌体，将沉淀溶解后过滤除菌。此时完成了1轮筛选和富集。如此进行2轮筛选和富集。当行第二轮筛选时，在加入对数期大肠杆菌TG1并振摇1h后，取部分培养液按不同稀释度涂于SOBAG平板上，30℃培养至长出单克隆。
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5. 细胞ELISA筛选呈现MGb1 ScFv的噬菌体单克隆：按ScFv检测试剂盒说明进行。从2轮筛选后涂布的SOBAG平板上挑取单克隆, 接种于不同的含0.4 ml 2×YT-AG的试管中，30℃ 摇过夜。从各管中取40 μl培养物到0.4 ml含有M13KO7的2×YT-AG中，于37℃摇2 h。离心后用0.4 ml 2×YT-AK重悬细菌，于37℃摇过夜。离心取上清，经封阻后，取100 μl加入包被有KATOⅢ细胞(5×105细胞/孔)并行封阻的96孔酶标板中，室温作用1.5 h，洗涤后加入100 μl HRP标记的抗M13噬菌体VIII蛋白的抗体，室温作用1 h，洗涤后用ABTS[2′, 2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) dia-mmonium salt]显色, 于450 nm测定各孔吸光度(A)值。实验设2个平行孔，以M13KO7为阴性对照，以大于阴性对照A值2倍以上为阳性。
6. 竞争ELISA检测各阳性噬菌体克隆与抗原的亲和力：同前包被KATOⅢ细胞于96孔酶标板，行封阻后，加入上述阳性克隆的噬菌体上清，100 μl/孔，以加入M13KO7者作对照。室温作用1 h，弃上清，加入MGb1单抗(100 μg/ ml，50 μl/孔)，室温作用1 h，用PBST洗涤5次后，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀释，50 μl/孔)，同前作用并洗涤后，用TMB(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine)显色，450 nm测A值。实验设2个平行孔，按下式计算ScFv抑制MGb1结合抗原的情况：抑制率(%)=1-(实验孔A值/对照孔A值)×100%。
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结果
1.ScFv DNA的构建及噬菌体呈现型MGb1 ScFv的筛选：扩增得到的VH和VL cDNA分别约为340 bp和320 bp。所构建的ScFv DNA约为750 bp。以KATOⅢ细胞对重组噬菌体抗体ScFv进行2轮筛选后，经ELISA检测呈现MGb1 ScFv的噬菌体单克隆，结果在随机挑选的40个克隆中，有17个为阳性，阳性率为42.5%。
2.竞争ELISA筛选呈现高亲和力MGb1 ScFv的噬菌体克隆：经检测，各阳性克隆均能不同程度地抑制MGb1与KATOⅢ细胞的结合，其中抑制率在25%以上的有4个克隆，抑制率分别为25.0%、27.2%、33. 9%及40.2%。
讨论
以基因工程方法获得的小型化抗肿瘤抗体具有如下优点[ 4-8]：(1)在制备过程中，不再需要动物和大规模细胞培养，从而使制备更为快速、经济。(2)可提供稳定的遗传背景，使遗传不稳定的杂交瘤得以挽救和保存，还可避免因液氮遗漏等原因造成的杂交瘤丢失。(3)容易进行基因水平上的控制和操作，包括对抗体基因进行测序、突变甚至可以对编码抗体分子可变区的基因进行重排以使抗体对抗原的特异性和亲和力增强。同时，也容易实现抗体基因与其他分子(如毒素)基因的融合。(4)对异源性抗体而言，因抗体分子小，用于在体研究时不易产生抗-抗体反应及过敏反应。(5)穿透力增强，容易进入肿瘤周围的微循环。(6)血循环及全身廓清快，半衰期短，肾脏蓄积少。(7)无Fc段，不与具有Fc受体的非靶细胞结合，利于影像学诊断。
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我们利用噬菌体呈现技术，以本所已有的鼠抗人胃癌细胞单抗MGb1杂交瘤为材料，成功地制备了单抗的噬菌体呈现型ScFv，从而使之具备了上述小型化抗体的优点，为拓宽该抗体的应用范围创造了条件。由于MGb1单抗是以KATOⅢ细胞为免疫原制备的，加之目前尚无相应抗原纯品可供利用，因此，我们选用此细胞系代替抗原来筛选MGb1的噬菌体呈现型ScFv。呈现于噬菌体表面的ScFv因构象的差异，导致抗体亲和力不同。我们通过竞争ELISA，在所获阳性克隆中筛选出4个能明显抑制MGb1与靶抗原结合的克隆，表明它们所呈现的ScFv与抗原的亲和力较高。
基于噬粒载体pCANTAB5E的特性，当宿主菌为抑制型菌株TG1时，ScFv与噬菌体基因Ⅲ编码的蛋白融合，共同呈现于噬菌体表面。在换用非抑制性菌株HB2151时，所表达的ScFv为可溶性。下一步，我们拟利用此原理制备MGb1的可溶性 ScFv，进而为获得用于胃癌体内外诊疗研究的靶向载体分子奠定基础。
基金项目：国家杰出青年基金(39525020)和国家“863”课题资助项目(102-10-01-06)
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通讯作者：樊代明，第四军医大学西京医院消化病研究所，西安，710032 Email：fandaim@fmmu.edu.cn
参考文献
1，Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, et al. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol,1994, 12:433-435.
2，樊代明，张学庸，陈希陶，等. 抗胃印戒细胞癌株KATOⅢ单克隆抗体MGb1和MGb2的建立及免疫组化初步鉴定. 中华消化杂志，1988,8:285-287.
3，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156-159.
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4，McCall AM, Adams GP, Amoroso AR, et al. Isolation and characterization of an anti-CD16 single-chain Fv fragment and construction of an anti-HER2/neu/anti-CD16 bispecific ScFv that triggers CD16-dependent tumor cytolysis. Mol Immunol, 1999,36:433-445.
5，Chowdhury PS, Pastan I. Improving antibody affinity by mimicking somatic hypermutation in vitro. Nat Biotechnol, 1999,17:568-572.
6，Klimka A, Barth S, Matthey B, et al. An anti-CD30 single-chain Fv selected by phage display and fused to Pseudomonas exotoxin A (Ki-4(scFv)-ETA′) is a potent immunotoxin against a Hodgkin-derived cell line.Br J Cancer， 1999 ,80:1214-1222.
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7，Chowdhury PS, Viner JL, Beers R, et al. Isolation of a high-affinity stable single-chain Fv specific for mesothelin from DNA-immunized mice by phage display and construction of a recombinant immunotoxin with anti-tumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998,95:669-674.
8，Schmidt M, Maurer-Gebhard M, Groner B, et al. Suppression of metastasis formation by a recombinant single chain antibody-toxin targeted to full-length and oncogenic variant EGF receptors. Oncogene, 1999, 18:1711-1721.
(收稿日期：2000-02-12), 百拇医药
单位：何凤田(710032 西安，第四军医大学西京医院消化病研究所 现在第三军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室，重庆，400038)；陈宝军 聂勇战 韩者艺 乔太东 樊代明(710032 西安，第四军医大学西京医院消化病研究所)
关键词：胃肿瘤；抗体，单克隆；噬菌体呈现技术
中华内科杂志000903 【摘要】 目的 制备胃癌单抗MGb1的噬菌体呈现型单链可变区片段(ScFv)，为获得用于胃癌体内诊疗研究的靶向载体分子奠定基础。方法 从杂交瘤细胞分离mRNA，扩增抗体重、轻链可变区(VH和VL)cDNA，经linker DNA连接形成ScFv DNA。将ScFv DNA与pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1，经M13KO7感染后，获得重组噬菌体抗体ScFv。经亲和筛选和ELISA检测获得呈现MGb1 ScFv的噬菌体单克隆。结果 VH、VL和ScFv DNA分别约为340 bp、320 bp和750 bp。经筛选得到17个呈现MGb1 ScFv的噬菌体单克隆，其中结合抗原能力强的克隆有4个。结论 获得了单抗MGb1的噬菌体呈现ScFv，为拓展抗体的应用范围创造了条件。
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Production of phage-displayed single chain variable fragments of monoclonal antibody MGb1
HE Fengtian, CHEN Baojun, NIE Yongzhan, et al.
Institute of Digestive Disease, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, China
【Abstract】 Objective To lay a foundation for obtaining a tumor-targeting vehicle for in vivo study on diagnosis and treatment of gastric carcinoma by generating single chain variable fragments(ScFv) of monoclonal antibody MGb1 directed against the cancer. Methods mRNA was isolated from MGb1-producing mouse hybridoma cell line, and the variable regions of heavy and light chain cDNAs were amplified separately and assembled into ScFv DNAs with a specially constructed linker DNA by PCR. The ScFv DNAs were ligated into the phagemid vector pCANTAB5E and the ligated sample was transformed into competent E.coli TG1. The transformed cells were infected with M13KO7 helper phage to yield recombinant phage,which disply ScFv fragments as a fusion with gene 3 protein on the tips of the phage M13. After two rounds of panning with gastric carcinoma cell line KATOⅢ highly expressing MGb1-binding antigen, the phage clones displayed ScFv fragments of the antibody were selected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) from the enriched phages. The affinity of the positive phage clones was detected by competition ELISA. Results The VH,VL and ScFv DNAs were about 340 bp, 320 bp and 750 bp respectively. 17 phage clones displayed ScFv of MGb1 were selected from 40 enriched phage clones. 4 out of the 17 phage clones could strongly compete with the original hybridoma antibody MGb1 for binding to the antigen expressed on KATOⅢ cells. Conclusion The phage-displayed ScFv fragments of monoclonal antibody MGb1 are successfully produced by phage antibody technology, which may be useful to widen the range of application of the antibody.
, 百拇医药
【Key words】 Stomach neoplasms; Antibodies， monoclonal; Phage display technology
将异源性抗体小型化可显著降低抗体用于在体研究时所引起的抗-抗体反应。在使抗体小型化的方法中，以噬菌体呈现技术最具优势[1]。胃癌是一种消化道常见恶性肿瘤，我们针对此肿瘤制备的抗胃癌单抗MGb1的特异性好[2]，有可能用于在体研究。为克服全抗体分子用于在体研究时的缺陷和获得抗体稳定的遗传背景，我们借助噬菌体呈现技术，以产MGb1的鼠杂交瘤为材料，制备了抗体的噬菌体呈现型单链可变区片段(single chain variable fragment, ScFv)，为进一步拓宽该抗体的应用范围奠定了基础。
材料与方法
一、主要材料
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鼠抗人胃癌单抗MGb1杂交瘤细胞株由本所制备[2]；鼠ScFv构建、表达及检测试剂盒均为Pharmacia公司产品；mRNA分离试剂盒、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶均为Promega产品；KATOⅢ细胞株由日本东京国立癌症中心引进；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为华美公司产品。
二、实验方法
1. 单抗MGb1的制备：按常规方法将杂交瘤细胞接种于8周龄雌性Balb/c小鼠腹腔制备含单抗MGb1的腹水，以饱和硫酸铵沉淀并透析后，经DEAE52纤维素柱进行梯度洗脱纯化。
2. 杂交瘤细胞mRNA的分离：收集对数期杂交瘤细胞，经一步酚法提取总RNA[3]，按mRNA分离试剂盒说明分离mRNA。
3. ScFv DNA的构建及扩增：按ScFv构建试剂盒说明进行。利用mRNA反转录合成cDNA第一链， 以第一链为模板，按程序1(30个循环：94℃×1 min，55℃×2 min，72℃×2 min)进行PCR，扩增VH和VL cDNA。经程序2(7个循环：94℃× 1 min，63℃×4 min)进行聚合和填充反应，使VH和VL籍linker DNA连接到一起，形成ScFv DNA。继而再经程序1进行PCR，使聚合的ScFv DNA得到扩增并在5′端引入SfiⅠ位点，3′端引入NotⅠ限制酶切位点。
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4. 重组噬菌体抗体ScFv的制备与筛选：按ScFv表达试剂盒进行。先后用SfiⅠ和NotⅠ切割ScFv DNA，纯化后连入噬粒载体pCANTAB5E，连接产物转化于大肠杆菌TG1。将转化产物涂于SOBAG[含氨苄青霉素(A)和葡萄糖(G)的SOB]琼脂平板上，30℃培养至长出克隆。刮下细菌，取2 ml，用2×YT-AG稀释至A600=0.3，37℃摇1h，加入辅助噬菌体M13KO7，再摇1 h，离心弃上清，沉淀用2×YT-AK(含氨苄青霉素和卡那霉素的2×YT)培养基重悬后，37℃摇过夜，离心取上清，加入0.2体积的20%PEG8000/2.5 mol NaCl沉淀噬菌体，将沉淀溶解后过滤除菌。
取KATOⅢ细胞，按约1×107/孔离心贴于6孔板底。板干燥后，用0.25%的戊二醛室温固定10 min，PBS洗3次，然后加满10%脱脂奶粉(封阻液)，室温作用2h，同前洗涤。将上述过滤除菌的噬菌体与封阻液按8:7混合，室温作用15 min后，加入6孔板，于37℃孵育2h。先后用PBS和含0.1%吐温20的PBS(PBST)各洗20次，再用PBS洗5次后，加入对数期的大肠杆菌TG1，37℃缓摇1 h，取培养液入三角烧瓶中，加入氨苄青霉素、葡萄糖及M13KO7，同上摇1 h。离心弃上清，沉淀用2×YT-AK重悬后，快速摇过夜。离心取上清，经PEG/NaCl沉淀噬菌体，将沉淀溶解后过滤除菌。此时完成了1轮筛选和富集。如此进行2轮筛选和富集。当行第二轮筛选时，在加入对数期大肠杆菌TG1并振摇1h后，取部分培养液按不同稀释度涂于SOBAG平板上，30℃培养至长出单克隆。
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5. 细胞ELISA筛选呈现MGb1 ScFv的噬菌体单克隆：按ScFv检测试剂盒说明进行。从2轮筛选后涂布的SOBAG平板上挑取单克隆, 接种于不同的含0.4 ml 2×YT-AG的试管中，30℃ 摇过夜。从各管中取40 μl培养物到0.4 ml含有M13KO7的2×YT-AG中，于37℃摇2 h。离心后用0.4 ml 2×YT-AK重悬细菌，于37℃摇过夜。离心取上清，经封阻后，取100 μl加入包被有KATOⅢ细胞(5×105细胞/孔)并行封阻的96孔酶标板中，室温作用1.5 h，洗涤后加入100 μl HRP标记的抗M13噬菌体VIII蛋白的抗体，室温作用1 h，洗涤后用ABTS[2′, 2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) dia-mmonium salt]显色, 于450 nm测定各孔吸光度(A)值。实验设2个平行孔，以M13KO7为阴性对照，以大于阴性对照A值2倍以上为阳性。
6. 竞争ELISA检测各阳性噬菌体克隆与抗原的亲和力：同前包被KATOⅢ细胞于96孔酶标板，行封阻后，加入上述阳性克隆的噬菌体上清，100 μl/孔，以加入M13KO7者作对照。室温作用1 h，弃上清，加入MGb1单抗(100 μg/ ml，50 μl/孔)，室温作用1 h，用PBST洗涤5次后，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀释，50 μl/孔)，同前作用并洗涤后，用TMB(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine)显色，450 nm测A值。实验设2个平行孔，按下式计算ScFv抑制MGb1结合抗原的情况：抑制率(%)=1-(实验孔A值/对照孔A值)×100%。
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结果
1.ScFv DNA的构建及噬菌体呈现型MGb1 ScFv的筛选：扩增得到的VH和VL cDNA分别约为340 bp和320 bp。所构建的ScFv DNA约为750 bp。以KATOⅢ细胞对重组噬菌体抗体ScFv进行2轮筛选后，经ELISA检测呈现MGb1 ScFv的噬菌体单克隆，结果在随机挑选的40个克隆中，有17个为阳性，阳性率为42.5%。
2.竞争ELISA筛选呈现高亲和力MGb1 ScFv的噬菌体克隆：经检测，各阳性克隆均能不同程度地抑制MGb1与KATOⅢ细胞的结合，其中抑制率在25%以上的有4个克隆，抑制率分别为25.0%、27.2%、33. 9%及40.2%。
讨论
以基因工程方法获得的小型化抗肿瘤抗体具有如下优点[ 4-8]：(1)在制备过程中，不再需要动物和大规模细胞培养，从而使制备更为快速、经济。(2)可提供稳定的遗传背景，使遗传不稳定的杂交瘤得以挽救和保存，还可避免因液氮遗漏等原因造成的杂交瘤丢失。(3)容易进行基因水平上的控制和操作，包括对抗体基因进行测序、突变甚至可以对编码抗体分子可变区的基因进行重排以使抗体对抗原的特异性和亲和力增强。同时，也容易实现抗体基因与其他分子(如毒素)基因的融合。(4)对异源性抗体而言，因抗体分子小，用于在体研究时不易产生抗-抗体反应及过敏反应。(5)穿透力增强，容易进入肿瘤周围的微循环。(6)血循环及全身廓清快，半衰期短，肾脏蓄积少。(7)无Fc段，不与具有Fc受体的非靶细胞结合，利于影像学诊断。
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我们利用噬菌体呈现技术，以本所已有的鼠抗人胃癌细胞单抗MGb1杂交瘤为材料，成功地制备了单抗的噬菌体呈现型ScFv，从而使之具备了上述小型化抗体的优点，为拓宽该抗体的应用范围创造了条件。由于MGb1单抗是以KATOⅢ细胞为免疫原制备的，加之目前尚无相应抗原纯品可供利用，因此，我们选用此细胞系代替抗原来筛选MGb1的噬菌体呈现型ScFv。呈现于噬菌体表面的ScFv因构象的差异，导致抗体亲和力不同。我们通过竞争ELISA，在所获阳性克隆中筛选出4个能明显抑制MGb1与靶抗原结合的克隆，表明它们所呈现的ScFv与抗原的亲和力较高。
基于噬粒载体pCANTAB5E的特性，当宿主菌为抑制型菌株TG1时，ScFv与噬菌体基因Ⅲ编码的蛋白融合，共同呈现于噬菌体表面。在换用非抑制性菌株HB2151时，所表达的ScFv为可溶性。下一步，我们拟利用此原理制备MGb1的可溶性 ScFv，进而为获得用于胃癌体内外诊疗研究的靶向载体分子奠定基础。
基金项目：国家杰出青年基金(39525020)和国家“863”课题资助项目(102-10-01-06)
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通讯作者：樊代明，第四军医大学西京医院消化病研究所，西安，710032 Email：fandaim@fmmu.edu.cn
参考文献
1，Winter G, Griffiths AD, Hawkins RE, et al. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol,1994, 12:433-435.
2，樊代明，张学庸，陈希陶，等. 抗胃印戒细胞癌株KATOⅢ单克隆抗体MGb1和MGb2的建立及免疫组化初步鉴定. 中华消化杂志，1988,8:285-287.
3，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162:156-159.
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4，McCall AM, Adams GP, Amoroso AR, et al. Isolation and characterization of an anti-CD16 single-chain Fv fragment and construction of an anti-HER2/neu/anti-CD16 bispecific ScFv that triggers CD16-dependent tumor cytolysis. Mol Immunol, 1999,36:433-445.
5，Chowdhury PS, Pastan I. Improving antibody affinity by mimicking somatic hypermutation in vitro. Nat Biotechnol, 1999,17:568-572.
6，Klimka A, Barth S, Matthey B, et al. An anti-CD30 single-chain Fv selected by phage display and fused to Pseudomonas exotoxin A (Ki-4(scFv)-ETA′) is a potent immunotoxin against a Hodgkin-derived cell line.Br J Cancer， 1999 ,80:1214-1222.
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7，Chowdhury PS, Viner JL, Beers R, et al. Isolation of a high-affinity stable single-chain Fv specific for mesothelin from DNA-immunized mice by phage display and construction of a recombinant immunotoxin with anti-tumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998,95:669-674.
8，Schmidt M, Maurer-Gebhard M, Groner B, et al. Suppression of metastasis formation by a recombinant single chain antibody-toxin targeted to full-length and oncogenic variant EGF receptors. Oncogene, 1999, 18:1711-1721.
(收稿日期：2000-02-12), 百拇医药