血管紧张素Ⅱ及其1型受体拮抗剂对猪肾小管上皮细胞株LLC-PK1细胞转分化的作用
作者：孙阳 郑法雷 刘彦信 郑德先 毕增祺
单位：孙阳(中国协和医科大学、中国医学科学院北京协和医院肾内科 100730)；郑法雷(中国协和医科大学、中国医学科学院北京协和医院肾内科 100730)；毕增祺(中国协和医科大学、中国医学科学院北京协和医院肾内科 100730)；刘彦信(基础医学研究所)；郑德先(基础医学研究所)
关键词：
中华内科杂志001018 近年来研究发现，血管紧张素Ⅱ(AⅡ)可以通过非血流动力学机制直接导致肾间质纤维化(RIF)。有人给大鼠静脉输入AⅡ后，出现了肾小管萎缩、肾间质单核/巨噬细胞浸润和RIF，同时肾间质有大量肌成纤维细胞(myofibroblasts，MF)聚积。MF是一种独特的成纤维样细胞，其胞浆内具有与平滑肌细胞胞浆内的肌动蛋白微丝束相似的细胞骨架系统。正常的肾组织中没有MF，但是在RIF时，肾间质出现大量MF，且其出现在时间和空间上与RIF的程度一致。现认为，MF在RIF发病机制中起重要作用。关于MF的来源，有人认为来自肾间质固有的成纤维细胞，也有学者认为其由肾小管上皮细胞(RTE)转分化(transdifferentiation)而来。本研究的目的在于观察AⅡ对猪肾小管上皮细胞株LLC-PK1细胞向MF转分化的促进作用，并探讨AⅡ的1型受体拮抗剂(AT1Ra)对这一作用的抑制情况。
, 百拇医药
一、材料与方法
采用体外研究的方法，应用间接免疫荧光技术，观察无血清培养的猪肾小管上皮细胞株LLC-PK1细胞在AⅡ和AT1Ra作用下，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及波形蛋白(Vim)的表达，以探讨AⅡ和AT1Ra对LLC-PK1细胞向MF转分化的作用。
1.将盖玻片预先置于6孔板内，然后将LLC-PK1细胞以105/孔接种于6孔板，以10%小牛血清PRIM 1640培养基(Gibco)培养24 h(37 ℃、5%CO2)。
2.24 h后换为无血清PRIM 1640培养基。分为三组，第1组为对照组；第2组为AⅡ(Sigma公司，浓度分别为10-8和10-6 mol/L)刺激组；第3组为AT1Ra组，同时加AⅡ(浓度同前)及AT1Ra(缬沙坦，诺华公司，浓度为10-6 mol/L)。
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3.培养48和72 h 后，将玻片取出检测 α-SMA和Vim。
4.先将玻片置于丙酮溶液内固定3 min，然后用PBS冲洗。分别加入抗α-SMA MoAb (Sigma公司，1∶200) 及抗Vim MoAb(Sigma公司，1∶20 )，室温孵育1 h。
5.用PBS冲洗后加羊抗鼠IgG荧光抗体 (军事医学科学院微生物研究所，1∶20)，37 ℃孵育30 min。
6.用PBS冲洗后加甘油封片，荧光显微镜下观察并照像。
7. 为了对荧光值进行半定量测定，在激光共聚焦显微镜(Meridian，USA)下随机选取5个视野，测定单位面积平均荧光值。
8.实验结果以每组平均荧光值±标准差(
±s)表示，以非配对t检验比较组间差异，以P<0.05为差异有显著性。
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二、结果
1. AⅡ和缬沙坦对LLC-PK1细胞Vim表达的作用：48 h 对照组LLC-PK1细胞已经有较强的Vim表达，72 h 无明显增加; 对照组与AⅡ(10-8、10-6 mol/L)刺激组和AT1Ra组则无明显差异。
2. AⅡ及缬沙坦对LLC-PK1细胞α-SMA表达的作用：48 h 对照组LLC-PK1细胞抗α-SMA荧光染色呈阳性，72 h 时无明显变化。与对照组相比，AⅡ(10-8、10-6 mol/L)刺激48和72 h 后，LLC-PK1细胞抗α-SMA荧光值显著增高(表1)。
表1 5株激光共聚焦显微镜测定LIC-PK1细胞α-SMA表达的单位面积平均荧光值(±s) 时间
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(h)
对照组
AⅡ刺激组
10-8mol/L
10-6 mol/L
48
862.2±150.2
1 326.6±120.7
2 018.1±154.9△
72
907.7±103.9
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2 877.9±223.5
3 637.6±250.3△
注：与对照组相比，P<0.05;与10-8 mol/L的AⅡ刺激组相比，△P<0.05 当同时加入缬沙坦(10-6 mol/L)作用后，LLC-PK1细胞抗α-SMA间接荧光强度较单独加AⅡ(10-8、10-6 mol/L)刺激组减弱(P<0.05)，48 h 分别为702.8±64.9(AⅡ10-8 mol/L)和974.1±96.8(AⅡ10-6 mol/L)，72 h 则分别为1 108.3±143.4和812.7±79.6，与对照组水平相似。
讨论 研究发现，RIF时肾间质出现的大量MF是合成细胞外基质和分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)的主要细胞，其数量与肾间质纤维化密切相关，是肾脏疾病不良预后的重要指标之一[1]。有报道[2]，TGF-β1、表皮生长因子可以诱导小鼠RTE表达α-SMA、Vim和成纤维细胞特异性蛋白-1，并丢失原有的上皮细胞标记。象这样一种分化完全的细胞丢失其原有的表型而转变为其他类型细胞的现象称为转分化。另有人[3]也发现，TGF-β1可以刺激体外培养的大鼠肾脏上皮细胞株NRKE52向MF转分化。晚近有人[4]报告在肾间质纤维化时，其肾小管基底膜损伤部位的RTE表达α-SMA。
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LLC-PK1为猪肾小管上皮细胞株，具有近端RTE的特点。Vim和α-SMA 为肌细胞骨架的主要组成，在生理情况下RTE不表达上述两种蛋白。我们在实验中发现，体外培养的LLC-PK1细胞已经有Vim和α-SMA的基础表达 ，表明LLC-PK1细胞由RTE转分化为MF，其原因可能与细胞在体外培养过程中的环境改变有关；虽然LLC-PK1细胞在体外培养的过程中已经发生表型改变，但AⅡ可以进一步刺激α-SMA的表达，提示AⅡ可以促进RTE向MF转分化。这一作用可以被AT1Ra(缬沙坦)所阻断。表明AT1Ra改善肾间质纤维化、减少肾间质MF的作用，部分系通过抑制RTE向MF转分化实现的。上述体外培养实验结果表明，MF可由RTE转分化而来，AⅡ促进RTE向MF转分化是RIF的重要发病机制之一。AⅡ对RTE向MF转分化的促进作用可以被AT1Ra所阻断，从而为用其防治肾间质纤维化提供了理论依据。
参考文献
1，Muchaneta-Kubara EC，el Nahas AM.Myofibroblast phenotypes expression in experimental renal scarring. Nephrol Dial Transplant，1997，12：904-915.
, 百拇医药
2，Okada H，Danoff TM，Kalluri R, et al. Early role of Fsp1 in epithelial-mesenchymal transformation.Am J Physiol，1997，273 (4 Pt 2)：F563-574.
3，Fan JM, Ng YY, Hill PA, et al. Transforming growth factor-beta regulates tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro. Kidney Int, 1999 , 56 :1455-1467.
4，Ng YY， Huang TP， Yang WC, et al. Tubular epithelial-Myofibroblast transdifferentiation in progressive tubulointerstitial fibrosis in 5/6 nephrectomized rats. Kidney Int ，1998，54:864-876.
收稿日期：1999-10-29, 百拇医药
单位：孙阳(中国协和医科大学、中国医学科学院北京协和医院肾内科 100730)；郑法雷(中国协和医科大学、中国医学科学院北京协和医院肾内科 100730)；毕增祺(中国协和医科大学、中国医学科学院北京协和医院肾内科 100730)；刘彦信(基础医学研究所)；郑德先(基础医学研究所)
关键词：
中华内科杂志001018 近年来研究发现，血管紧张素Ⅱ(AⅡ)可以通过非血流动力学机制直接导致肾间质纤维化(RIF)。有人给大鼠静脉输入AⅡ后，出现了肾小管萎缩、肾间质单核/巨噬细胞浸润和RIF，同时肾间质有大量肌成纤维细胞(myofibroblasts，MF)聚积。MF是一种独特的成纤维样细胞，其胞浆内具有与平滑肌细胞胞浆内的肌动蛋白微丝束相似的细胞骨架系统。正常的肾组织中没有MF，但是在RIF时，肾间质出现大量MF，且其出现在时间和空间上与RIF的程度一致。现认为，MF在RIF发病机制中起重要作用。关于MF的来源，有人认为来自肾间质固有的成纤维细胞，也有学者认为其由肾小管上皮细胞(RTE)转分化(transdifferentiation)而来。本研究的目的在于观察AⅡ对猪肾小管上皮细胞株LLC-PK1细胞向MF转分化的促进作用，并探讨AⅡ的1型受体拮抗剂(AT1Ra)对这一作用的抑制情况。
, 百拇医药
一、材料与方法
采用体外研究的方法，应用间接免疫荧光技术，观察无血清培养的猪肾小管上皮细胞株LLC-PK1细胞在AⅡ和AT1Ra作用下，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及波形蛋白(Vim)的表达，以探讨AⅡ和AT1Ra对LLC-PK1细胞向MF转分化的作用。
1.将盖玻片预先置于6孔板内，然后将LLC-PK1细胞以105/孔接种于6孔板，以10%小牛血清PRIM 1640培养基(Gibco)培养24 h(37 ℃、5%CO2)。
2.24 h后换为无血清PRIM 1640培养基。分为三组，第1组为对照组；第2组为AⅡ(Sigma公司，浓度分别为10-8和10-6 mol/L)刺激组；第3组为AT1Ra组，同时加AⅡ(浓度同前)及AT1Ra(缬沙坦，诺华公司，浓度为10-6 mol/L)。
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3.培养48和72 h 后，将玻片取出检测 α-SMA和Vim。
4.先将玻片置于丙酮溶液内固定3 min，然后用PBS冲洗。分别加入抗α-SMA MoAb (Sigma公司，1∶200) 及抗Vim MoAb(Sigma公司，1∶20 )，室温孵育1 h。
5.用PBS冲洗后加羊抗鼠IgG荧光抗体 (军事医学科学院微生物研究所，1∶20)，37 ℃孵育30 min。
6.用PBS冲洗后加甘油封片，荧光显微镜下观察并照像。
7. 为了对荧光值进行半定量测定，在激光共聚焦显微镜(Meridian，USA)下随机选取5个视野，测定单位面积平均荧光值。
8.实验结果以每组平均荧光值±标准差(
±s)表示，以非配对t检验比较组间差异，以P<0.05为差异有显著性。, http://www.100md.com
二、结果
1. AⅡ和缬沙坦对LLC-PK1细胞Vim表达的作用：48 h 对照组LLC-PK1细胞已经有较强的Vim表达，72 h 无明显增加; 对照组与AⅡ(10-8、10-6 mol/L)刺激组和AT1Ra组则无明显差异。
2. AⅡ及缬沙坦对LLC-PK1细胞α-SMA表达的作用：48 h 对照组LLC-PK1细胞抗α-SMA荧光染色呈阳性，72 h 时无明显变化。与对照组相比，AⅡ(10-8、10-6 mol/L)刺激48和72 h 后，LLC-PK1细胞抗α-SMA荧光值显著增高(表1)。
表1 5株激光共聚焦显微镜测定LIC-PK1细胞α-SMA表达的单位面积平均荧光值(
±s) 时间, 百拇医药
(h)
对照组
AⅡ刺激组
10-8mol/L
10-6 mol/L
48
862.2±150.2
1 326.6±120.7
2 018.1±154.9△
72
907.7±103.9
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2 877.9±223.5
3 637.6±250.3△
注：与对照组相比，P<0.05;与10-8 mol/L的AⅡ刺激组相比，△P<0.05 当同时加入缬沙坦(10-6 mol/L)作用后，LLC-PK1细胞抗α-SMA间接荧光强度较单独加AⅡ(10-8、10-6 mol/L)刺激组减弱(P<0.05)，48 h 分别为702.8±64.9(AⅡ10-8 mol/L)和974.1±96.8(AⅡ10-6 mol/L)，72 h 则分别为1 108.3±143.4和812.7±79.6，与对照组水平相似。
讨论 研究发现，RIF时肾间质出现的大量MF是合成细胞外基质和分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)的主要细胞，其数量与肾间质纤维化密切相关，是肾脏疾病不良预后的重要指标之一[1]。有报道[2]，TGF-β1、表皮生长因子可以诱导小鼠RTE表达α-SMA、Vim和成纤维细胞特异性蛋白-1，并丢失原有的上皮细胞标记。象这样一种分化完全的细胞丢失其原有的表型而转变为其他类型细胞的现象称为转分化。另有人[3]也发现，TGF-β1可以刺激体外培养的大鼠肾脏上皮细胞株NRKE52向MF转分化。晚近有人[4]报告在肾间质纤维化时，其肾小管基底膜损伤部位的RTE表达α-SMA。
, http://www.100md.com
LLC-PK1为猪肾小管上皮细胞株，具有近端RTE的特点。Vim和α-SMA 为肌细胞骨架的主要组成，在生理情况下RTE不表达上述两种蛋白。我们在实验中发现，体外培养的LLC-PK1细胞已经有Vim和α-SMA的基础表达 ，表明LLC-PK1细胞由RTE转分化为MF，其原因可能与细胞在体外培养过程中的环境改变有关；虽然LLC-PK1细胞在体外培养的过程中已经发生表型改变，但AⅡ可以进一步刺激α-SMA的表达，提示AⅡ可以促进RTE向MF转分化。这一作用可以被AT1Ra(缬沙坦)所阻断。表明AT1Ra改善肾间质纤维化、减少肾间质MF的作用，部分系通过抑制RTE向MF转分化实现的。上述体外培养实验结果表明，MF可由RTE转分化而来，AⅡ促进RTE向MF转分化是RIF的重要发病机制之一。AⅡ对RTE向MF转分化的促进作用可以被AT1Ra所阻断，从而为用其防治肾间质纤维化提供了理论依据。
参考文献
1，Muchaneta-Kubara EC，el Nahas AM.Myofibroblast phenotypes expression in experimental renal scarring. Nephrol Dial Transplant，1997，12：904-915.
, 百拇医药
2，Okada H，Danoff TM，Kalluri R, et al. Early role of Fsp1 in epithelial-mesenchymal transformation.Am J Physiol，1997，273 (4 Pt 2)：F563-574.
3，Fan JM, Ng YY, Hill PA, et al. Transforming growth factor-beta regulates tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro. Kidney Int, 1999 , 56 :1455-1467.
4，Ng YY， Huang TP， Yang WC, et al. Tubular epithelial-Myofibroblast transdifferentiation in progressive tubulointerstitial fibrosis in 5/6 nephrectomized rats. Kidney Int ，1998，54:864-876.
收稿日期：1999-10-29, 百拇医药