重症肌无力患者糖皮质激素受体的观察
作者：张星虎 许贤豪 王红 王秀云 黄煜敏 刘广志
单位：北京医院神经内科 100730
关键词：重症肌无力；受体，糖皮质激素；白细胞，单核
中华内科杂志001013 【摘要】 目的 旨在观察重症肌无力(MG)患者外周血单个核细胞(PBMC)糖皮质激素受体(GR)的变化及其变化机制。方法 193例MG患者、10例其他神经免疫性疾病患者、66例脑血管病患者及35例正常对照；采用3H-氟美松放射配体法测定PBMC GR数目及亲和力，狭缝印迹法测定PBMC GRmRNA含量。 结果 MG患者PBMC 的GR数及其mRNA均显著降低(P<0.01)， 而且GRmRNA的含量与GR数目密切相关(r=0.89)。但GR亲和力无明显异常。 MG患者及正常人的PBMC分别在正常及患者血浆中短期培养后GR数无明显改变。 结论 MG患者的GR数是低的，其降低可能是由于其mRNA转录水平有障碍。
, 百拇医药
The investigation of glucocorticoid receptor in peripheral blood mononuclear cells from patients with myasthenia gravis
ZHANG Xinghu XU Xianhao WANG Hong
(Department of Neurology, Beijing Hospital, Beijing 100730,China)
【Abstract】 Objective To investigate the alteration of glucocorticoid receptor(GR) in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) from patients with myasthenia gravis(MG) and to explore its mechanism. Methods 3H-dexamethansone binding assay and Scatchard analysis were used to measure the number of GR and dissociation constant in PBMC from 193 MG patients, 10 patients with other neuroimmunological disorders, 66 with cerebral vascular disorders (CVD) and 35 healthy donors. Slot blot hybridization was used to detect GRmRNA. Results GR numbers in MG patients were much lower than those in healthy controls (P<0.01), but GR affinity between these two groups was not remarkably different (P>0.05). GR numbers of PBMC from MG patients after culture in normal plasma were not significantly different from those before culture. No obvious change was observed in GR numbers of PBMC from healthy donors after the cells were incubated with MG plasma. GRmRNA of PBMC in MG patients was significantly lower than that in healthy donors, and was well correlated with GR numbers (r=0.89, P<0.01). Conclusion GR numbers are low in MG patients. The decrease of GR numbers may be related to the decrease of GRmRNA transcription.
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【Key words】 Myasthenia gravis; Receptor glucocorticoid; Leukocyte mononuclear
重症肌无力是主要累及神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体(AChR)、主要由AChR抗体(Ab)介导、细胞免疫依赖性、补体参与的自身免疫性疾病[1] 。糖皮质激素(GC)已广泛应用于MG及其他自身免疫性疾病的治疗。临床上不同个体对GC治疗的反应不同，显效所需时间各异，用药后部分MG患者还会出现一过性加重[2]。由于GC的作用通过GR介导[3]，本研究试图从蛋白及mRNA水平了解MG患者的GR，以期对临床提供有价值的信息。
资料及方法
一、一般资料
MG组：193例，男91例，女102例，年龄1～78 (38.7±21.6) 岁，Osserman分型：Ⅰ型30例，ⅡA型83例，ⅡB型54例，Ⅲ型12例，Ⅳ型14例。病程2周至11年(中位数2.5个月)。脑血管病(CVD)组：脑梗塞58例，脑出血8例，其中男4例，女22例，年龄：43～84 (75.6±13.7) 岁。其他神经免疫性疾病(ONID)组：10例，男4例，女6例，年龄20～64(39.4±18.2) 岁。其中多发性硬化7例，格林巴利综合征1例，慢性炎性脱髓鞘性多神经病1例，多发性肌炎1例。对照组为神经系统查体正常的健康人35名，男19例，女16例，年龄28～43 (37.3±14.1) 岁。上述各组患者入组前未用GC，无其他伴发疾病。
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二、外周血单个核细胞(PBMC)的分离
所有患者及正常对照者均在早晨8∶00～10∶00间抽取外周静脉血10～20 ml，肝素抗凝，立即梯度离心法分离细胞。
三、 PBMC GR测定
3H-DEX放射配体法[4] ：将细胞悬液以RPMI 1640调成1×106 cells/ml。37℃水浴摇床孵育30 min去除内源性激素。离心后再以RPMI 1640重悬细胞，调成1×107 cells/ml。取100 μl加入50 μl 3 H-DEX(Amersham, 85Ci/mmol，单点法分析时为160 nmol/L, 作Scatchard图分析时于5～160 nmol/L之间作6个浓度点)，总反应体积为200 μl。复管测定,置37℃水浴摇床孵育60 min。再加入1 ml预冷的PBS终止反应，4℃，17 000×g离心5 min。用1 ml冷PBS将沉淀物洗3遍。最后将沉淀物连同微量离心管重悬于8 ml闪烁液中，置12 h后，用LS6500型液闪仪计数(cpm)，计数效率为60%，换算为计数率(dpm)，所得dpm为总结合，用加相同浓度3H-DEX和再加1 000倍未标记DEX(160 μmol/L)的平行测定管的dpm为非特异结合，总结合dpm减去非特异结合dpm即为特异结合dpm。根据Crabtree[4]提出的公式结合具体系数计算GR数：
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GR＝dpm×(1/细胞数)×(6.023×1014/2.22×106)×(1/85)×(1+10-8/F)(位点/细胞)
注： F为游离配体的浓度(mol/L)，2.22×106为由μCi到dpm的换算系数，6.023×1014为由Avogadro常数推算的1 nmol分子数，85为3H-DEX的比活性85Ci/mmol。
四、PBMC体外培养
随机抽取6例MG患者及6名正常人的外周血20 ml, 肝素抗凝，无菌分离PBMC。以RPMI1640将细胞悬液浓度调至1×107/ml。MG患者的PBMC 100 μl分别在MG患者血浆、正常对照者血浆、RPMI 1640 900 μl中培养，正常对照者PBMC 100 μl分别在正常对照者血浆、MG患者血浆、RPMI 1640 900 μl中培养，置37℃，5%CO2孵育48 h。分别测定培养前后MG患者和正常对照者PBMC的GR数目。
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五、GRmRNA检测
1.GRcDNA质粒在大肠杆菌中的扩增[5]: GR cDNA质粒由上海第二军医大学病理生理教研室徐仁宝、刘宇建老师馈赠，载体为pSP64(3.0 kb)，在BamH1酶切位点插入GRcDNA(2.8 kb)。宿主菌为JM109大肠杆菌。
2.探针的制备和标记：分别用XbaI和SmaI从GR cDNA质粒上切下GR cDNA。用0.5%Agarose凝胶分离酶切产物，回收2800bp的GR cDNA条带，并透析纯化。使用德国Boehringer Mannheim公司生产的地高辛标记和检测试剂盒进行探针标记。
3.PBMC总RNA的提取：用Gibco公司生产的Trizol RNA提取试剂盒提取35例MG患者及10例正常对照者PBMC的总RNA。利用紫外分光光度计确定RNA浓度(μg/μl)。
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4.GRmRNA体外合成[6]：将GRcDNA质粒用SmaI酶切，成为线状质粒DNA。以此DNA为模板，以rNTPs 为底物，在SP6 RNA多聚酶催化下体外合成GRmRNA。利用紫外分光光度计确定GR mRNA浓度 (μg/μl)，再换算成摩尔浓度(amol/μl)。
5.RNA与DNA探针的杂交：狭缝印迹法[5]，以硝酸纤维素膜为载体，杂交产物照相记录，并以激光密度扫描仪测定结果。将体外合成的系列稀释的GRmRNA与GRcDNA探针杂交，以反应产物密度值对GRmRNA量绘制标准曲线。根据样本RNA与GRcDNA探针杂交后的反应产物密度值，参照标准曲线获得样本总RNA中GRmRNA的量。再根据杂交所用的样本总RNA量, 换算成每 μg总RNA 所含的GRmRNA量(amol/μg total RNA)。
六、统计学处理
数据以均数±标准差表示(
±s)，均数比较采用 t 检验。
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结果
一、GR测定的实验条件选择
在20例正常对照，单点法(单一3H-DEX浓度)与多点法(不同3H-DEX浓度)测定GR数目[前者：(5 516.0±1 123.6)位点/细胞；后者：(5 630.0±1 012.6)位点/细胞]的结果结果基本相似(t=1.341, P>0.05)。且前者用血量少，操作简便，故以后检测中用单点法测定GR数目，多点法仅用于测定GR亲和力。预实验发现, 当3H-DEX在反应体系中的终浓度达到40 nmol/L时，结合趋于饱和，故在单点法测定GR数目时，3H- DEX在反应体系中的终浓度选择为40 nmol/L。
二、MG患者与正常对照者GR亲和力的比较
10例MG患者GR亲和力与10例正常对照者相近，分别为(5.26±2.04)及(5.01±0.99) nmol/L，两组间差别无显著性 (t=1.872, P>0.05)。
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三、各疾病组间GR数比较(表1)
经F检验，F=13.8, P<0.01, 提示各组间至少有两组的GR有显著差别；进一步用q检验，发现MG、ONID、CVD组患者的GR明显低于正常对照组(P值均<0.01)， 但疾病组间差别不显著(P值均>0.05)。
表1 各组患者间GR水平 组别
例数
GR(位点/细胞)
对照组
35
5 563.0±1 232.6
MG组
193
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3 628.0±1 078.9
ONID组
10
3 219.0±1 311.3
CVD组
66
3 875.0±1 342.4
四、MG各型GR数的比较(表2)
MG各型间GR数差异无显著性(P>0.05)，F=1.98。表2 MG不同分型的GR数目 Osserman 分型
例数
GR(位点/细胞)
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Ⅰ 型
30
3 517.0±1 238.7
ⅡA型
83
3 672.0±1 431.5
ⅡB型
54
3 746.0±1 125.5
Ⅲ型
12
3 325.0±1 251.4
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Ⅳ 型
14
3 408.0±1 194.3
五、胸腺摘除前、后GR的比较
16例MG患者于胸腺摘除前、后(1周)PBMC GR分别(为3 582.0±1 231.6)、(3 476.0±1 198.3)位点/细胞，差异无显著性 (t=2.010, P>0.05)。
六、MG患者及正常对照者PBMC在不同介质中培养前、后GR数目(表3)
随机分组F检验分析，MG组PBMC GR数在不同介质中培养后无显著变化(F=2.45, P>0.05)；同样，正常对照组PBMC GR数在不同介质中培养后无显著变化(F=1.73，P>0.05)。
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表3 MG患者及对照组PBMC培养前、后的GR数比较 组别
例
数
培养前
(位点/细胞)
培养后 (位点/细胞)
正常血浆中
MG患者
血浆中
RPMI1640
培养液中
MG组
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6
2 294±1 442
2 319±1 438
1 819±1 100
2 048±1 135
对照组
6
4 707±1 164
4 470±1 066
4 235±1 028
4 407± 967
七、MG患者及正常对照组PBMC GRmRNA含量
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35例 MG患者的PBMC GRmRNA(30.6±11.1)amol/μl显著低于正常对照组10例(46.2±12.9)amol/μl (t=2.73，P<0.01)。直线相关分析发现，GR数目与GRmRNA呈正相关关系(r=0.89，P<0.01)。
讨论
GR是一种转录调节蛋白，与GC结合后被激活并向胞核内转移，直接激活或抑制靶基因的表达，最终导致细胞表型的变化[7]。GR有三个既相互独立又相互联系的功能区：中间的碱性区为DNA结合区，一个大的C末端区为激素结合区，N末端被称为未知功能区(或称为C区，主要是免疫决定区)。在不用激素的情况下，GR存在于胞浆的胞液部分，应用激素后，即可在核内发现它。非激活的受体为一个9S，分子量 310 000的复合物，激活的GR为3.2S，90 000。
本组研究发现，MG患者PBMC GR明显低于正常对照组(P<0.01)，而GR亲和力正常。ONID患者GR数也有明显降低，但与MG患者相比，差别无显著性(P>0.05)。MG患者的性别、年龄、临床分型、胸腺切除对GR无显著影响(P>0.05)。蒋建明等[8]应用完整细胞与3H-DEX结合测定法检测70例MG患者WBC GR，结果患者GR含量[(2 990±1 435)位点/细胞 ]明显降低于正常人[(5 273±963)位点/细胞 ](P<0.01)，其中Ⅲ型患者含量最低，与本研究结果相似。但文献中也有不同的报道， Brentani 等[9]报道测定了39例MG患者PBMC GR的亲和力及受体数目，未接受糖皮质激素治疗和胸腺切除者其PBMC GR平均值明显高于正常对照组，GR亲和力正常。刘敏等[10]报道43例MG患者其外周血白细胞的GR位点数[(6 799±2 055)位点/细胞]较正常人高[(2 839±1 787)位点/细胞]。
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GR的合成涉及到 GRmRNA转录、 转录后调节、 GR蛋白翻译、 翻译后修饰。上述任何一步障碍均可致GR异常。我们发现MG患者的GRmRNA水平明显低于正常对照者，而且与测得的GR位点数密切相关, 提示MG患者有GR的mRNA转录过程异常。 GR的功能也可受到其他因素的影响。为了解是否MG患者血浆中存在抑制GR的因子，在体外短期培养MG患者及正常对照者 的PBMC，于培养前后测定GR数。结果发现，MG患者PMBC GR数在正常对照血浆中培养后无升高，正常对照PBMC GR数在MG患者血浆中培养无降低，提示MG患者血浆中似乎没有影响PBMC GR数的抑制因子存在。
基金项目：卫生部研究基金资助项目(94-1-091)
参考文献
1，许贤豪. 重症肌无力. 见:许贤豪,主编. 神经免疫学. 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社， 1992.113-150.
, 百拇医药
2，郭采青, 许贤豪, 顾文英,等. 肾上腺皮质激素对重症肌无力的疗效及其疗程中病情加重的观察. 中国神经免疫学和神经病学杂志, 1995,2:4-7.
3，Burnstein KL, Cidlowski JA. The down side of glucocorticoid receptor regulation. Mol Cell Endocrinol, 1992 ,83:C1-8.
4，Crabtree GR, Smith KA, Munck A. Glucocorticoid receptors. In: Catovsky D, ed. Methods in Hematology. Vol.2. The leukemic cell. New York: Churchill Livingstone, 1981. 252-269.
5，卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京:高等教育出版社, 1993.105-118；198-238.
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6，Melton DA, Krieg PA, Rebagliati MR, et al. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. Nucleic Acids Res, 1984, 12:7035-7056.
7，Yamamoto KR. Steroid receptor regulated transcription of specific genes and gene networks. Annu Rev Genet, 1985,19:209-252.
8，蒋建明，涂来慧，张仁琴. 重症肌无力患者白细胞糖皮质激素受体检测及其临床意义. 中华神经精神科杂志, 1993，26:341-343.
9，Brentani MM, Marchiori PE, Martins VR. Glucocorticoid receptors of mononuclear leukocytes from myasthenia gravis patients. Acta Neurol Scand, 1985, 72:188-192.
10，刘敏, 从志强, 申黎青. 重症肌无力患者外周血白细胞糖皮质激素受体的检测. 中国神经免疫学和神经病学杂志, 1999, 6:73-75.
收稿日期：2000-04-10, 百拇医药
单位：北京医院神经内科 100730
关键词：重症肌无力；受体，糖皮质激素；白细胞，单核
中华内科杂志001013 【摘要】 目的 旨在观察重症肌无力(MG)患者外周血单个核细胞(PBMC)糖皮质激素受体(GR)的变化及其变化机制。方法 193例MG患者、10例其他神经免疫性疾病患者、66例脑血管病患者及35例正常对照；采用3H-氟美松放射配体法测定PBMC GR数目及亲和力，狭缝印迹法测定PBMC GRmRNA含量。 结果 MG患者PBMC 的GR数及其mRNA均显著降低(P<0.01)， 而且GRmRNA的含量与GR数目密切相关(r=0.89)。但GR亲和力无明显异常。 MG患者及正常人的PBMC分别在正常及患者血浆中短期培养后GR数无明显改变。 结论 MG患者的GR数是低的，其降低可能是由于其mRNA转录水平有障碍。
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The investigation of glucocorticoid receptor in peripheral blood mononuclear cells from patients with myasthenia gravis
ZHANG Xinghu XU Xianhao WANG Hong
(Department of Neurology, Beijing Hospital, Beijing 100730,China)
【Abstract】 Objective To investigate the alteration of glucocorticoid receptor(GR) in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) from patients with myasthenia gravis(MG) and to explore its mechanism. Methods 3H-dexamethansone binding assay and Scatchard analysis were used to measure the number of GR and dissociation constant in PBMC from 193 MG patients, 10 patients with other neuroimmunological disorders, 66 with cerebral vascular disorders (CVD) and 35 healthy donors. Slot blot hybridization was used to detect GRmRNA. Results GR numbers in MG patients were much lower than those in healthy controls (P<0.01), but GR affinity between these two groups was not remarkably different (P>0.05). GR numbers of PBMC from MG patients after culture in normal plasma were not significantly different from those before culture. No obvious change was observed in GR numbers of PBMC from healthy donors after the cells were incubated with MG plasma. GRmRNA of PBMC in MG patients was significantly lower than that in healthy donors, and was well correlated with GR numbers (r=0.89, P<0.01). Conclusion GR numbers are low in MG patients. The decrease of GR numbers may be related to the decrease of GRmRNA transcription.
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【Key words】 Myasthenia gravis; Receptor glucocorticoid; Leukocyte mononuclear
重症肌无力是主要累及神经肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体(AChR)、主要由AChR抗体(Ab)介导、细胞免疫依赖性、补体参与的自身免疫性疾病[1] 。糖皮质激素(GC)已广泛应用于MG及其他自身免疫性疾病的治疗。临床上不同个体对GC治疗的反应不同，显效所需时间各异，用药后部分MG患者还会出现一过性加重[2]。由于GC的作用通过GR介导[3]，本研究试图从蛋白及mRNA水平了解MG患者的GR，以期对临床提供有价值的信息。
资料及方法
一、一般资料
MG组：193例，男91例，女102例，年龄1～78 (38.7±21.6) 岁，Osserman分型：Ⅰ型30例，ⅡA型83例，ⅡB型54例，Ⅲ型12例，Ⅳ型14例。病程2周至11年(中位数2.5个月)。脑血管病(CVD)组：脑梗塞58例，脑出血8例，其中男4例，女22例，年龄：43～84 (75.6±13.7) 岁。其他神经免疫性疾病(ONID)组：10例，男4例，女6例，年龄20～64(39.4±18.2) 岁。其中多发性硬化7例，格林巴利综合征1例，慢性炎性脱髓鞘性多神经病1例，多发性肌炎1例。对照组为神经系统查体正常的健康人35名，男19例，女16例，年龄28～43 (37.3±14.1) 岁。上述各组患者入组前未用GC，无其他伴发疾病。
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二、外周血单个核细胞(PBMC)的分离
所有患者及正常对照者均在早晨8∶00～10∶00间抽取外周静脉血10～20 ml，肝素抗凝，立即梯度离心法分离细胞。
三、 PBMC GR测定
3H-DEX放射配体法[4] ：将细胞悬液以RPMI 1640调成1×106 cells/ml。37℃水浴摇床孵育30 min去除内源性激素。离心后再以RPMI 1640重悬细胞，调成1×107 cells/ml。取100 μl加入50 μl 3 H-DEX(Amersham, 85Ci/mmol，单点法分析时为160 nmol/L, 作Scatchard图分析时于5～160 nmol/L之间作6个浓度点)，总反应体积为200 μl。复管测定,置37℃水浴摇床孵育60 min。再加入1 ml预冷的PBS终止反应，4℃，17 000×g离心5 min。用1 ml冷PBS将沉淀物洗3遍。最后将沉淀物连同微量离心管重悬于8 ml闪烁液中，置12 h后，用LS6500型液闪仪计数(cpm)，计数效率为60%，换算为计数率(dpm)，所得dpm为总结合，用加相同浓度3H-DEX和再加1 000倍未标记DEX(160 μmol/L)的平行测定管的dpm为非特异结合，总结合dpm减去非特异结合dpm即为特异结合dpm。根据Crabtree[4]提出的公式结合具体系数计算GR数：
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GR＝dpm×(1/细胞数)×(6.023×1014/2.22×106)×(1/85)×(1+10-8/F)(位点/细胞)
注： F为游离配体的浓度(mol/L)，2.22×106为由μCi到dpm的换算系数，6.023×1014为由Avogadro常数推算的1 nmol分子数，85为3H-DEX的比活性85Ci/mmol。
四、PBMC体外培养
随机抽取6例MG患者及6名正常人的外周血20 ml, 肝素抗凝，无菌分离PBMC。以RPMI1640将细胞悬液浓度调至1×107/ml。MG患者的PBMC 100 μl分别在MG患者血浆、正常对照者血浆、RPMI 1640 900 μl中培养，正常对照者PBMC 100 μl分别在正常对照者血浆、MG患者血浆、RPMI 1640 900 μl中培养，置37℃，5%CO2孵育48 h。分别测定培养前后MG患者和正常对照者PBMC的GR数目。
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五、GRmRNA检测
1.GRcDNA质粒在大肠杆菌中的扩增[5]: GR cDNA质粒由上海第二军医大学病理生理教研室徐仁宝、刘宇建老师馈赠，载体为pSP64(3.0 kb)，在BamH1酶切位点插入GRcDNA(2.8 kb)。宿主菌为JM109大肠杆菌。
2.探针的制备和标记：分别用XbaI和SmaI从GR cDNA质粒上切下GR cDNA。用0.5%Agarose凝胶分离酶切产物，回收2800bp的GR cDNA条带，并透析纯化。使用德国Boehringer Mannheim公司生产的地高辛标记和检测试剂盒进行探针标记。
3.PBMC总RNA的提取：用Gibco公司生产的Trizol RNA提取试剂盒提取35例MG患者及10例正常对照者PBMC的总RNA。利用紫外分光光度计确定RNA浓度(μg/μl)。
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4.GRmRNA体外合成[6]：将GRcDNA质粒用SmaI酶切，成为线状质粒DNA。以此DNA为模板，以rNTPs 为底物，在SP6 RNA多聚酶催化下体外合成GRmRNA。利用紫外分光光度计确定GR mRNA浓度 (μg/μl)，再换算成摩尔浓度(amol/μl)。
5.RNA与DNA探针的杂交：狭缝印迹法[5]，以硝酸纤维素膜为载体，杂交产物照相记录，并以激光密度扫描仪测定结果。将体外合成的系列稀释的GRmRNA与GRcDNA探针杂交，以反应产物密度值对GRmRNA量绘制标准曲线。根据样本RNA与GRcDNA探针杂交后的反应产物密度值，参照标准曲线获得样本总RNA中GRmRNA的量。再根据杂交所用的样本总RNA量, 换算成每 μg总RNA 所含的GRmRNA量(amol/μg total RNA)。
六、统计学处理
数据以均数±标准差表示(
±s)，均数比较采用 t 检验。, 百拇医药
结果
一、GR测定的实验条件选择
在20例正常对照，单点法(单一3H-DEX浓度)与多点法(不同3H-DEX浓度)测定GR数目[前者：(5 516.0±1 123.6)位点/细胞；后者：(5 630.0±1 012.6)位点/细胞]的结果结果基本相似(t=1.341, P>0.05)。且前者用血量少，操作简便，故以后检测中用单点法测定GR数目，多点法仅用于测定GR亲和力。预实验发现, 当3H-DEX在反应体系中的终浓度达到40 nmol/L时，结合趋于饱和，故在单点法测定GR数目时，3H- DEX在反应体系中的终浓度选择为40 nmol/L。
二、MG患者与正常对照者GR亲和力的比较
10例MG患者GR亲和力与10例正常对照者相近，分别为(5.26±2.04)及(5.01±0.99) nmol/L，两组间差别无显著性 (t=1.872, P>0.05)。
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三、各疾病组间GR数比较(表1)
经F检验，F=13.8, P<0.01, 提示各组间至少有两组的GR有显著差别；进一步用q检验，发现MG、ONID、CVD组患者的GR明显低于正常对照组(P值均<0.01)， 但疾病组间差别不显著(P值均>0.05)。
表1 各组患者间GR水平 组别
例数
GR(位点/细胞)
对照组
35
5 563.0±1 232.6
MG组
193
, 百拇医药
3 628.0±1 078.9
ONID组
10
3 219.0±1 311.3
CVD组
66
3 875.0±1 342.4
四、MG各型GR数的比较(表2)
MG各型间GR数差异无显著性(P>0.05)，F=1.98。表2 MG不同分型的GR数目 Osserman 分型
例数
GR(位点/细胞)
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Ⅰ 型
30
3 517.0±1 238.7
ⅡA型
83
3 672.0±1 431.5
ⅡB型
54
3 746.0±1 125.5
Ⅲ型
12
3 325.0±1 251.4
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Ⅳ 型
14
3 408.0±1 194.3
五、胸腺摘除前、后GR的比较
16例MG患者于胸腺摘除前、后(1周)PBMC GR分别(为3 582.0±1 231.6)、(3 476.0±1 198.3)位点/细胞，差异无显著性 (t=2.010, P>0.05)。
六、MG患者及正常对照者PBMC在不同介质中培养前、后GR数目(表3)
随机分组F检验分析，MG组PBMC GR数在不同介质中培养后无显著变化(F=2.45, P>0.05)；同样，正常对照组PBMC GR数在不同介质中培养后无显著变化(F=1.73，P>0.05)。
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表3 MG患者及对照组PBMC培养前、后的GR数比较 组别
例
数
培养前
(位点/细胞)
培养后 (位点/细胞)
正常血浆中
MG患者
血浆中
RPMI1640
培养液中
MG组
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6
2 294±1 442
2 319±1 438
1 819±1 100
2 048±1 135
对照组
6
4 707±1 164
4 470±1 066
4 235±1 028
4 407± 967
七、MG患者及正常对照组PBMC GRmRNA含量
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35例 MG患者的PBMC GRmRNA(30.6±11.1)amol/μl显著低于正常对照组10例(46.2±12.9)amol/μl (t=2.73，P<0.01)。直线相关分析发现，GR数目与GRmRNA呈正相关关系(r=0.89，P<0.01)。
讨论
GR是一种转录调节蛋白，与GC结合后被激活并向胞核内转移，直接激活或抑制靶基因的表达，最终导致细胞表型的变化[7]。GR有三个既相互独立又相互联系的功能区：中间的碱性区为DNA结合区，一个大的C末端区为激素结合区，N末端被称为未知功能区(或称为C区，主要是免疫决定区)。在不用激素的情况下，GR存在于胞浆的胞液部分，应用激素后，即可在核内发现它。非激活的受体为一个9S，分子量 310 000的复合物，激活的GR为3.2S，90 000。
本组研究发现，MG患者PBMC GR明显低于正常对照组(P<0.01)，而GR亲和力正常。ONID患者GR数也有明显降低，但与MG患者相比，差别无显著性(P>0.05)。MG患者的性别、年龄、临床分型、胸腺切除对GR无显著影响(P>0.05)。蒋建明等[8]应用完整细胞与3H-DEX结合测定法检测70例MG患者WBC GR，结果患者GR含量[(2 990±1 435)位点/细胞 ]明显降低于正常人[(5 273±963)位点/细胞 ](P<0.01)，其中Ⅲ型患者含量最低，与本研究结果相似。但文献中也有不同的报道， Brentani 等[9]报道测定了39例MG患者PBMC GR的亲和力及受体数目，未接受糖皮质激素治疗和胸腺切除者其PBMC GR平均值明显高于正常对照组，GR亲和力正常。刘敏等[10]报道43例MG患者其外周血白细胞的GR位点数[(6 799±2 055)位点/细胞]较正常人高[(2 839±1 787)位点/细胞]。
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GR的合成涉及到 GRmRNA转录、 转录后调节、 GR蛋白翻译、 翻译后修饰。上述任何一步障碍均可致GR异常。我们发现MG患者的GRmRNA水平明显低于正常对照者，而且与测得的GR位点数密切相关, 提示MG患者有GR的mRNA转录过程异常。 GR的功能也可受到其他因素的影响。为了解是否MG患者血浆中存在抑制GR的因子，在体外短期培养MG患者及正常对照者 的PBMC，于培养前后测定GR数。结果发现，MG患者PMBC GR数在正常对照血浆中培养后无升高，正常对照PBMC GR数在MG患者血浆中培养无降低，提示MG患者血浆中似乎没有影响PBMC GR数的抑制因子存在。
基金项目：卫生部研究基金资助项目(94-1-091)
参考文献
1，许贤豪. 重症肌无力. 见:许贤豪,主编. 神经免疫学. 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社， 1992.113-150.
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2，郭采青, 许贤豪, 顾文英,等. 肾上腺皮质激素对重症肌无力的疗效及其疗程中病情加重的观察. 中国神经免疫学和神经病学杂志, 1995,2:4-7.
3，Burnstein KL, Cidlowski JA. The down side of glucocorticoid receptor regulation. Mol Cell Endocrinol, 1992 ,83:C1-8.
4，Crabtree GR, Smith KA, Munck A. Glucocorticoid receptors. In: Catovsky D, ed. Methods in Hematology. Vol.2. The leukemic cell. New York: Churchill Livingstone, 1981. 252-269.
5，卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京:高等教育出版社, 1993.105-118；198-238.
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6，Melton DA, Krieg PA, Rebagliati MR, et al. Efficient in vitro synthesis of biologically active RNA and RNA hybridization probes from plasmids containing a bacteriophage SP6 promoter. Nucleic Acids Res, 1984, 12:7035-7056.
7，Yamamoto KR. Steroid receptor regulated transcription of specific genes and gene networks. Annu Rev Genet, 1985,19:209-252.
8，蒋建明，涂来慧，张仁琴. 重症肌无力患者白细胞糖皮质激素受体检测及其临床意义. 中华神经精神科杂志, 1993，26:341-343.
9，Brentani MM, Marchiori PE, Martins VR. Glucocorticoid receptors of mononuclear leukocytes from myasthenia gravis patients. Acta Neurol Scand, 1985, 72:188-192.
10，刘敏, 从志强, 申黎青. 重症肌无力患者外周血白细胞糖皮质激素受体的检测. 中国神经免疫学和神经病学杂志, 1999, 6:73-75.
收稿日期：2000-04-10, 百拇医药