缺氧及一氧化碳对大鼠血管平滑肌细胞的作用
作者：王关嵩 钱桂生 毛宝龄 肖桃元 李淑平 陈维中
单位：王关嵩 钱桂生 毛宝龄 李淑平 陈维中(重庆，第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所 400037)；肖桃元(中心实验室)
关键词：一氧化碳；平滑肌细胞；钙；环AMP；环GMP
中华内科杂志001010 【摘要】 目的 探讨缺氧及低浓度一氧化碳(CO)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的作用机制。方法 应用改良的Lowry法测VSMC蛋白质含量，Fura-2荧光指示剂测VSMC内的钙浓度([Ca2+])，放射免疫环腺苷酸(cAMP)、环一磷酸鸟苷(cGMP)药盒测cAMP、cGMP浓度。结果 (1)缺氧组VSMC内质网扩张，胞浆内出现髓鞘样结构，线粒体肿胀、空泡化。低浓度 CO复合缺氧组VSMC的损害减轻，仅线粒体稍肿大，部分内质网有扩张。(2)缺氧组 VSMC内[Ca2+][4 h、8 h、12 h、24 h、36 h分别为(382.00±37.92) mmol/L、(456.00±53.76) mmol/L、(517.00±47.34) mmol/L、(608.00±35.92) mmol/L、(567.00±46.72) mmol/L]较常氧组[4 h为(319.00±47.45) mmol/L]明显升高(P<0.01)，低浓度 CO复合缺氧组 VSMC内[Ca2+]接近常氧组。(3)缺氧组 VSMC的cAMP均有升高趋势，cAMP先降后升，cGMP缓慢升高。低浓度 CO复合缺氧组VSMC的cGMP [2 h、8 h、12 h、24 h分别为(0.52±0.21) pmol/mg蛋白、(0.58±0.21)pmol/mg蛋白、(0.60±0.24)pmol/mg蛋白、(0.68±0.29) pmol/mg蛋白]与常氧组[分别为(0.48±0.08) pmol/mg蛋白、(0.46±0.06) pmol/mg蛋白、(0.57±0.11)pmol/mg蛋白、(0.58±0.14) pmol/mg 蛋白]比有所升高，但差异无显著性 (P>0.05)。在缺氧及复合 CO作用下cAMP均呈上升趋势，和常氧组比差异有显著性(P<0.01)。结论 缺氧可能通过第二信使系统促进 VSMC的增生，而低浓度 CO可以抑制缺氧的作用，可能 CO影响了Ca2+-cGMP系统或 E2F-1基因的表达。
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Effect of hypoxia and carbon monoxide on rat pulmonary arterial smooth muscle cell
WANG Guansong QIAN Guisheng MAO Baoling
(Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037，China)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of carbon monoxide on rat pulmonary arterial smooth muscle cell (VSMC). Methods Three groups were randomly devided, (1) Normoxia group(N)，(2) Hypoxia group(H)，(3)3% CO+1%O2group (CO+H), then tested by immunocytochemical analysis 3H-TdR in incorporation. Results (1)Hypoxia intiated the chang of VSMC from contractile phenotype to synthetic phenotype, the endoplasmic reticulum became dilated, the mitochondria became swollen and myelin figure appeared. α-actin and muscle fiber decreased. The form of VSMC in CO+H was similar to that in N. (2) Intracellular Ca2+ level of VSMC in H [4 h,8 h,12 h,24 h,36 h were(382.00±37.92)mmol/L,(456.00±53.76) mmol/L,(517.00±47.34) mmol/L,(608.00±35.92) mmol/L,(567.00±46.72) mmol/L,respectively] increased significantly(P<0.01) than in N[4 h was(319.00±47.45) mmol/L], but that in CO+H increased slightly. (3) cAMP and cGMP level of VSMC in H increased significantly, cAMP of VSMC in CO+H increased significanlty [2 h,8 h,12 h,24 h were (1.87±0.36) pmol/mg protein, (2.16±0.36) pmol/mg protein, (2.36±0.41) pmol/mg protein, (2.12±0.39) pmol/mg protein,respectively] but cGMP of VSMC in CO+H increased slightly[2 h,8 h,12 h,24 h were (0.52±0.21) pmol/mg protein, (0.58±0.21) pmol/mg protein, (0.60±0.24) pmol/mg protein, (0.68±0.29) pmol/mg protein,respectively]. Conclusion Hypoxia may promote the proliferation of VSMC by second messenger system and CO in low desities can depress the action of hypoxia partly by Ca2+-cGMP system or by the expression of E2F-1gene.
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【Key words】 Carbon monoxide； Smooth musele cell； Calcium； Cyclic AMP； Cyclic GMP
高血压、动脉粥样硬化等疾病虽经多年研究，目前仍然是临床常见的严重疾病，它们共同的病理进程是主动脉等血管壁结构改变，动脉中膜肌层增厚，平滑肌细胞由收缩型改变为合成型，并肥大增殖。既往的研究报告，通过利用一氧化氮(NO)来治疗临床疾病，显示出较好的应用前景[1]。近年来，人们已经注意到一氧化碳(CO) 既是一种新的信使分子，也是新的血管舒张因子，它不仅是血红素代谢相关的副产品，而且对血管系统具有重要的调节作用。本实验通过观察低浓度 CO对缺氧条件下大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)的作用，探讨其作用机制。
材料与方法
1.主要材料和试剂：培养基DMEM，胎牛血清(hyclone)，胰蛋白酶，已二醇四乙酸(EGTA，Sigma)，荧光剂Fura-2和Fura-2/AM(中国科学院药物研究所)，环腺苷酸(cAMP)、环一磷酸鸟苷(cGMP，上海中医学院),5% CO2+N2气体及3% CO+5% CO2+N2混合气体(重庆仪表九厂)， CO自动监测报警仪(中国煤炭科学院重庆分院)，紫外可见光分度仪(PE，USA)。
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2. VSMC培养及鉴定：Wistar大鼠3只(购于第三军医大学实验动物中心，有合格证号)，颈动脉放血处死后，剥取主动脉，采用复合胶原酶法(37℃消化切碎的动脉条30～40 min)培养VSMC，并用电镜鉴定[2]。
3.分组缺氧和低浓度 CO处理：用干燥器制成缺氧和低浓度 CO小室，通过连续3～4次抽气和充气，把小室内的空气换成缺氧气瓶(5% CO2+N2)和低浓度 CO气瓶(3% CO+ 5% CO2+N2)里的气体，再放至37℃干燥箱内处理。分为3组，A组为常氧组，放在 CO2孵箱内作为对照；B组为缺氧组(5% CO2+N2)；C组为低浓度 CO复合缺氧组(3% CO+5% CO2+N2) 。
4.生长特性和蛋白质含量的测定：选择传第4代生长良好的VSMC，胰蛋白酶消化后分散成1×104个/cm2，接种于6孔板，随机按上述三组进行培养，每组6板。每日定时各取2孔细胞观察生长情况，然后消化分散计数，用改良Lowry法测定蛋白质含量。
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5.胞内钙([Ca2+])浓度测定：取长满层的细胞，Hanks液冲洗3次，再用EDTA液温育6 min，最后用细胞培养液DMEM制成细胞悬液106个/ml，将Fura-2/AM(5 mmol/L)加入。37℃温育45 min。离心，弃上清，将细胞悬浮于D′Hank液(内含1 mmol/L EGTA)中测定。激发波长340 nm和380 nm，光栅5 nm，发射波长500 nm，光栅10 nm。自身荧光作对照，分别加入1% Triton和20 mmol/L EGTA测最大和最小荧光强度。
6. cAMP和cGMP的含量测定：取样时先吸弃培养液，再马上加入1 ml冰冷的0.24 mol/L高氯酸，刮取收集细胞，冰浴下超声破碎，离心取上清，以3 mol/L KOH中和至pH值为6.3左右，离心除去高氯酸钾沉淀，-20℃贮存备测。cGMP和cAMP的测定步骤按药盒说明进行。
7.统计学方法：采用多因素或单因素方差分析，结果以
±s表示，并做方差保护显著性检验。
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结果
1.缺氧和低浓度 CO对VSMC生长的影响：常氧条件下VSMC细胞呈长梭型，部分区域可重叠生长达多层，部分区域较稀疏，有典型的“峰一谷”样长势；电镜下可见细胞胞浆内含丰富的肌丝和致密斑，而细胞器较少。缺氧条件下VSMC细胞体积肥大，分布比较均匀；电镜下可见胞核较大，胞浆内含丰富的粗面内质网、线粒体等细胞器，而且线粒体固缩、空泡化、内质网扩张，胞浆内出现髓鞘样结构，核内可见膜性结构。低浓度 CO处理VSMC后，细胞仍出现较明显的“峰一谷”长势，胞浆内有少量细胞器，未见细胞器有明显改变，但胞浆里也出现髓鞘样结构。缺氧条件下VSMC生长较快，于第5天达最多数量，常氧和低浓度 CO条件下VSMC数量均于第7～8天达高峰。但是缺氧条件下蛋白质的含量却比其他两种条件下要低。
2.缺氧和低浓度 CO对VSMC内[Ca2+]的效应：缺氧2 h时VSMC的[Ca2+]开始升高(P<0.01)，随着缺氧时间的延长，[Ca2+]持续升高至608 mmol/L。低浓度吸入 CO 2 h时[Ca2+]未见变化。见表1。
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3.低浓度 CO对VSMC的cAMP和cGMP含量的影响：缺氧2 h VSMC的cAMP含量即明显升高(P<0.05)，12 h时更高(P<0.01)，24 h时有降低，但仍高于基础水平(P<0.05)；缺氧2 h VSMC的cGMP变化不明显，12 h时升高(P<0.05)，24 h时更高(P<0.01)。低浓度 CO处理VSMC的cAMP变化不明显，cGMP明显降低。见表2。
讨论
整体动物的VSMC的增殖受多种因素的影响，包括相邻的内皮细胞、成纤维细胞、周细胞[3]以及胶原，此外神经激素也有调节作用。既往的研究中，对缺氧状况下VSMC的形态和增生的变化尚有不同认识，有人认为缺氧主要通过影响内皮细胞进而对平滑肌细胞发挥作用。也有研究表明，缺氧可以促进新生小牛肺血管平滑肌细胞的增生。我们的研究结果证实，缺氧状态下肺微血管内皮细胞的培养液可以促进平滑肌细胞增生[4]，小动物如大鼠(缺氧敏感性中等)的VSMC也可直接增殖。缺氧可能通过激活VSMC使其释放血小板源性生长因子、内皮素等来直接促进VSMC的增殖。此外，本实验还证明，在低氧条件下 VSMC内的[Ca2+]、cAMP、cGMP均有上升趋势，说明缺氧还可通过第二信使系统发挥作用。
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表1 CO对平滑肌细胞[Ca2+]的影响(mmol/L,±s) 组别
2 h
4 h
8 h
12 h
24 h
36 h
A组
306.00±52.37
319.00±47.45
, http://www.100md.com 312.00±42.37
342.00±58.79
344.00±61.39
302.00±38.66
B组
312.00±47.95
382.00±37.92*
456.00±53.76**
517.00±47.34**
608.00±35.92**
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567.00±46.72**
C组
310.00±38.53
327.00±45.66
329.00±49.33
340.00±61.32
359.00±53.67
349.00±52.37
注：每组6板 与A组比较 ，*P<0.01，**P<0.001 表2 CO对VSMC的cAMP和cGMP含量的影响(pmol/mg蛋白，±s) 组别
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2 h
8 h
12 h
24 h
cAMP
A组
0.81±0.12
0.79±0.09
0.83±0.14
0.72±0.25
B组
1.46±0.34*
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1.87±0.12*
2.18±0.36**
1.89±0.42**
C组
1.87±0.36*
2.16±0.36*
2.36±0.41**
2.12±0.39**
cGMP
A组
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0.48±0.08
0.46±0.06
0.53±0.11
0.58±0.14
B组
0.59±0.13
0.71±0.12*
0.94±0.26**
1.02±0.32**
C组
0.52±0.21
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0.58±0.21*
0.60±0.24*
0.68±0.29
注：每组6板 与A组比较，*P<0.05，**P<0.01 CO是一种新的血管舒张因子和信使因子，在生物体内的作用方式和NO相似，主要是通过激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，调节 cGMP的合成，而 cGMP在许多组织特别是平滑肌中起重要的调节作用。我们的研究发现，低浓度 CO在缺氧条件下处理VSMC，其生长状况接近常氧情况，具有对抗缺氧的效应[5] 。但是实验表明， CO可使缺氧导致[Ca2+]的升高趋势降低，cGMP含量升高，对cAMP的影响不明显。所以，这种对抗效应只能是部分的。低浓度 CO通过第二信使系统只能部分地调节缺氧的效应。 我们的实验证明，外源性低浓度CO既可通过调节VSMC内cGMP的水平，也可以通过调节细胞内[Ca2+]水平来对VSMC发挥作用。
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有人研究了持续慢性缺氧条件下兔主动脉平滑肌细胞的变化，发现缺氧12 h时血红素氧合酶mRNA水平比常氧组细胞增加6倍。缺氧15 h血红素加氧酶(HO-1)的表达水平可达到最高值，在随后的24～48 h会逐渐降低至基础水平。但HO-1mRNA的半衰期保持不变，这表明缺氧条件下平滑肌细胞主要增加HO-1的转录速率，而不是增加mRNA的寿命。另外，在缺氧条件下，HO-1酶的活性变化与其mRNA的水平变化相平行，都有一个先增高然后恢复至基线水平的过程。在缺氧条件下，由于HO-1 mRNA表达水平及其酶活性增高，因而其产生的 CO增多， CO可激活sGC，产生第二信使物质cGMP，cGMP能够调节血管阻力，从而改善血液供给，一定程度上可以缓解缺氧对机体造成的损害[6] 。有人将血红素和亚砷酸盐分别与VSMC培养24 h，发现细胞内HO活性及cGMP浓度都有明显升高，而且锌原卟啉-9能够降低细胞内cGMP浓度，证明了HO的诱导剂似乎不可能直接作用于sGC。因此可以认为，HO通过调节平滑肌细胞内cGMP的水平，从而引起血管舒张，血流量增加。此外， CO能够逆转高钾或去甲肾上腺素引起的血管收缩，可能通过抑制Ca2+流入血管平滑肌细胞中，以降低细胞内游离[Ca2+]来松弛血管平滑肌和扩张血管[7]。
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E2F家族包括c-myc 、周期素(cyclin)和DNA聚合酶α，E2F-1是第一个被鉴定的成员，主要控制G1/S期转录。有报道， CO通过抑制 E2F-1基因表达及蛋白质产生来降低c-myc mRNA水平(c-myc是E2F-1作用的目标基因)，进而调节VSMC 对缺氧的应答。 CO合成抑制剂锡原卟啉可以促进VSMC对内皮素的应答，可使E2F-1mRNA水平升高4倍，而E2F-1是控制多种S期基因的关键因子，可以调节细胞应答生长因子的能力。实验还证实，缺氧时VSMC产生的 CO可以升高cGMP的水平，而E2F-1表达可以降低相应升高的部分。说明CO还通过cGMP依赖通道抑制E2F-1表达和对VSMC的促有丝分裂效应[8]。当然还存在其他机制，比如激活细胞上各种类型的K+通道，抑制细胞色素P450依赖的单氧酶系统[9]等，还有待深入研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700057)
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参考文献
1，Hayward CS, Rogers P, Keogh AM, et al. Inhaled nitric oxide in cardiac failure: vascular versus ventricular effects. J Cardiovasc Pharmacol, 1996, 27: 80-85.
2，王关嵩,钱桂生,杨晓静，等. 两种酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞生长特性的比较. 第三军医大学学报, 1999，21：765-767.
3，王林，熊密，车东媛，等.低氧对肺血管周细胞增殖及分化的影响.中华结核和呼吸杂志，1999，22：176-178.
4，王关嵩，钱桂生，杨晓静，等.低氧肺微血管内皮细胞培养液对肺动脉平滑肌细胞的作用.中国病理生理杂志，1999，15：933.
, 百拇医药
5，王关嵩，钱桂生，杨晓静，等.一氧化碳对缺氧大鼠血管平滑肌细胞低氧性增殖反应的作用.中国病理生理杂志，2000，16：117-119.
6，Morita T, Perrella MA,Lee ME， et al. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 28:1475-1479.
7，Sammut IA ,Foresti R, Clark JE, et al. Carbon monoxide is a major contributor to the regulation of vascular tone in aortas expressing high levels of haeme oxygenase-1. Br J Pharmacol, 1998，125: 1437-1444.
, 百拇医药
8，Morita T,Mitsialis SA, Koike H, et al.Carbon monoxide controls the proliferation of hypoxic vascular smooth muscle cells. J Biol Chem, 1997， 272:32804-32809.
9，Wang R. Resurgence of carbon monoxide:an endogenous gaseous vasorelaxing factor.Can J Physiol Pharmacol, 1998，76: 1-15.
收稿日期：2000-04-17, 百拇医药
单位：王关嵩 钱桂生 毛宝龄 李淑平 陈维中(重庆，第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所 400037)；肖桃元(中心实验室)
关键词：一氧化碳；平滑肌细胞；钙；环AMP；环GMP
中华内科杂志001010 【摘要】 目的 探讨缺氧及低浓度一氧化碳(CO)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的作用机制。方法 应用改良的Lowry法测VSMC蛋白质含量，Fura-2荧光指示剂测VSMC内的钙浓度([Ca2+])，放射免疫环腺苷酸(cAMP)、环一磷酸鸟苷(cGMP)药盒测cAMP、cGMP浓度。结果 (1)缺氧组VSMC内质网扩张，胞浆内出现髓鞘样结构，线粒体肿胀、空泡化。低浓度 CO复合缺氧组VSMC的损害减轻，仅线粒体稍肿大，部分内质网有扩张。(2)缺氧组 VSMC内[Ca2+][4 h、8 h、12 h、24 h、36 h分别为(382.00±37.92) mmol/L、(456.00±53.76) mmol/L、(517.00±47.34) mmol/L、(608.00±35.92) mmol/L、(567.00±46.72) mmol/L]较常氧组[4 h为(319.00±47.45) mmol/L]明显升高(P<0.01)，低浓度 CO复合缺氧组 VSMC内[Ca2+]接近常氧组。(3)缺氧组 VSMC的cAMP均有升高趋势，cAMP先降后升，cGMP缓慢升高。低浓度 CO复合缺氧组VSMC的cGMP [2 h、8 h、12 h、24 h分别为(0.52±0.21) pmol/mg蛋白、(0.58±0.21)pmol/mg蛋白、(0.60±0.24)pmol/mg蛋白、(0.68±0.29) pmol/mg蛋白]与常氧组[分别为(0.48±0.08) pmol/mg蛋白、(0.46±0.06) pmol/mg蛋白、(0.57±0.11)pmol/mg蛋白、(0.58±0.14) pmol/mg 蛋白]比有所升高，但差异无显著性 (P>0.05)。在缺氧及复合 CO作用下cAMP均呈上升趋势，和常氧组比差异有显著性(P<0.01)。结论 缺氧可能通过第二信使系统促进 VSMC的增生，而低浓度 CO可以抑制缺氧的作用，可能 CO影响了Ca2+-cGMP系统或 E2F-1基因的表达。
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Effect of hypoxia and carbon monoxide on rat pulmonary arterial smooth muscle cell
WANG Guansong QIAN Guisheng MAO Baoling
(Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037，China)
【Abstract】 Objective To investigate the effect of carbon monoxide on rat pulmonary arterial smooth muscle cell (VSMC). Methods Three groups were randomly devided, (1) Normoxia group(N)，(2) Hypoxia group(H)，(3)3% CO+1%O2group (CO+H), then tested by immunocytochemical analysis 3H-TdR in incorporation. Results (1)Hypoxia intiated the chang of VSMC from contractile phenotype to synthetic phenotype, the endoplasmic reticulum became dilated, the mitochondria became swollen and myelin figure appeared. α-actin and muscle fiber decreased. The form of VSMC in CO+H was similar to that in N. (2) Intracellular Ca2+ level of VSMC in H [4 h,8 h,12 h,24 h,36 h were(382.00±37.92)mmol/L,(456.00±53.76) mmol/L,(517.00±47.34) mmol/L,(608.00±35.92) mmol/L,(567.00±46.72) mmol/L,respectively] increased significantly(P<0.01) than in N[4 h was(319.00±47.45) mmol/L], but that in CO+H increased slightly. (3) cAMP and cGMP level of VSMC in H increased significantly, cAMP of VSMC in CO+H increased significanlty [2 h,8 h,12 h,24 h were (1.87±0.36) pmol/mg protein, (2.16±0.36) pmol/mg protein, (2.36±0.41) pmol/mg protein, (2.12±0.39) pmol/mg protein,respectively] but cGMP of VSMC in CO+H increased slightly[2 h,8 h,12 h,24 h were (0.52±0.21) pmol/mg protein, (0.58±0.21) pmol/mg protein, (0.60±0.24) pmol/mg protein, (0.68±0.29) pmol/mg protein,respectively]. Conclusion Hypoxia may promote the proliferation of VSMC by second messenger system and CO in low desities can depress the action of hypoxia partly by Ca2+-cGMP system or by the expression of E2F-1gene.
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【Key words】 Carbon monoxide； Smooth musele cell； Calcium； Cyclic AMP； Cyclic GMP
高血压、动脉粥样硬化等疾病虽经多年研究，目前仍然是临床常见的严重疾病，它们共同的病理进程是主动脉等血管壁结构改变，动脉中膜肌层增厚，平滑肌细胞由收缩型改变为合成型，并肥大增殖。既往的研究报告，通过利用一氧化氮(NO)来治疗临床疾病，显示出较好的应用前景[1]。近年来，人们已经注意到一氧化碳(CO) 既是一种新的信使分子，也是新的血管舒张因子，它不仅是血红素代谢相关的副产品，而且对血管系统具有重要的调节作用。本实验通过观察低浓度 CO对缺氧条件下大鼠血管平滑肌细胞 (VSMC)的作用，探讨其作用机制。
材料与方法
1.主要材料和试剂：培养基DMEM，胎牛血清(hyclone)，胰蛋白酶，已二醇四乙酸(EGTA，Sigma)，荧光剂Fura-2和Fura-2/AM(中国科学院药物研究所)，环腺苷酸(cAMP)、环一磷酸鸟苷(cGMP，上海中医学院),5% CO2+N2气体及3% CO+5% CO2+N2混合气体(重庆仪表九厂)， CO自动监测报警仪(中国煤炭科学院重庆分院)，紫外可见光分度仪(PE，USA)。
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2. VSMC培养及鉴定：Wistar大鼠3只(购于第三军医大学实验动物中心，有合格证号)，颈动脉放血处死后，剥取主动脉，采用复合胶原酶法(37℃消化切碎的动脉条30～40 min)培养VSMC，并用电镜鉴定[2]。
3.分组缺氧和低浓度 CO处理：用干燥器制成缺氧和低浓度 CO小室，通过连续3～4次抽气和充气，把小室内的空气换成缺氧气瓶(5% CO2+N2)和低浓度 CO气瓶(3% CO+ 5% CO2+N2)里的气体，再放至37℃干燥箱内处理。分为3组，A组为常氧组，放在 CO2孵箱内作为对照；B组为缺氧组(5% CO2+N2)；C组为低浓度 CO复合缺氧组(3% CO+5% CO2+N2) 。
4.生长特性和蛋白质含量的测定：选择传第4代生长良好的VSMC，胰蛋白酶消化后分散成1×104个/cm2，接种于6孔板，随机按上述三组进行培养，每组6板。每日定时各取2孔细胞观察生长情况，然后消化分散计数，用改良Lowry法测定蛋白质含量。
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5.胞内钙([Ca2+])浓度测定：取长满层的细胞，Hanks液冲洗3次，再用EDTA液温育6 min，最后用细胞培养液DMEM制成细胞悬液106个/ml，将Fura-2/AM(5 mmol/L)加入。37℃温育45 min。离心，弃上清，将细胞悬浮于D′Hank液(内含1 mmol/L EGTA)中测定。激发波长340 nm和380 nm，光栅5 nm，发射波长500 nm，光栅10 nm。自身荧光作对照，分别加入1% Triton和20 mmol/L EGTA测最大和最小荧光强度。
6. cAMP和cGMP的含量测定：取样时先吸弃培养液，再马上加入1 ml冰冷的0.24 mol/L高氯酸，刮取收集细胞，冰浴下超声破碎，离心取上清，以3 mol/L KOH中和至pH值为6.3左右，离心除去高氯酸钾沉淀，-20℃贮存备测。cGMP和cAMP的测定步骤按药盒说明进行。
7.统计学方法：采用多因素或单因素方差分析，结果以
±s表示，并做方差保护显著性检验。, 百拇医药
结果
1.缺氧和低浓度 CO对VSMC生长的影响：常氧条件下VSMC细胞呈长梭型，部分区域可重叠生长达多层，部分区域较稀疏，有典型的“峰一谷”样长势；电镜下可见细胞胞浆内含丰富的肌丝和致密斑，而细胞器较少。缺氧条件下VSMC细胞体积肥大，分布比较均匀；电镜下可见胞核较大，胞浆内含丰富的粗面内质网、线粒体等细胞器，而且线粒体固缩、空泡化、内质网扩张，胞浆内出现髓鞘样结构，核内可见膜性结构。低浓度 CO处理VSMC后，细胞仍出现较明显的“峰一谷”长势，胞浆内有少量细胞器，未见细胞器有明显改变，但胞浆里也出现髓鞘样结构。缺氧条件下VSMC生长较快，于第5天达最多数量，常氧和低浓度 CO条件下VSMC数量均于第7～8天达高峰。但是缺氧条件下蛋白质的含量却比其他两种条件下要低。
2.缺氧和低浓度 CO对VSMC内[Ca2+]的效应：缺氧2 h时VSMC的[Ca2+]开始升高(P<0.01)，随着缺氧时间的延长，[Ca2+]持续升高至608 mmol/L。低浓度吸入 CO 2 h时[Ca2+]未见变化。见表1。
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3.低浓度 CO对VSMC的cAMP和cGMP含量的影响：缺氧2 h VSMC的cAMP含量即明显升高(P<0.05)，12 h时更高(P<0.01)，24 h时有降低，但仍高于基础水平(P<0.05)；缺氧2 h VSMC的cGMP变化不明显，12 h时升高(P<0.05)，24 h时更高(P<0.01)。低浓度 CO处理VSMC的cAMP变化不明显，cGMP明显降低。见表2。
讨论
整体动物的VSMC的增殖受多种因素的影响，包括相邻的内皮细胞、成纤维细胞、周细胞[3]以及胶原，此外神经激素也有调节作用。既往的研究中，对缺氧状况下VSMC的形态和增生的变化尚有不同认识，有人认为缺氧主要通过影响内皮细胞进而对平滑肌细胞发挥作用。也有研究表明，缺氧可以促进新生小牛肺血管平滑肌细胞的增生。我们的研究结果证实，缺氧状态下肺微血管内皮细胞的培养液可以促进平滑肌细胞增生[4]，小动物如大鼠(缺氧敏感性中等)的VSMC也可直接增殖。缺氧可能通过激活VSMC使其释放血小板源性生长因子、内皮素等来直接促进VSMC的增殖。此外，本实验还证明，在低氧条件下 VSMC内的[Ca2+]、cAMP、cGMP均有上升趋势，说明缺氧还可通过第二信使系统发挥作用。
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表1 CO对平滑肌细胞[Ca2+]的影响(mmol/L,
±s) 组别2 h
4 h
8 h
12 h
24 h
36 h
A组
306.00±52.37
319.00±47.45
, http://www.100md.com 312.00±42.37
342.00±58.79
344.00±61.39
302.00±38.66
B组
312.00±47.95
382.00±37.92*
456.00±53.76**
517.00±47.34**
608.00±35.92**
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567.00±46.72**
C组
310.00±38.53
327.00±45.66
329.00±49.33
340.00±61.32
359.00±53.67
349.00±52.37
注：每组6板 与A组比较 ，*P<0.01，**P<0.001 表2 CO对VSMC的cAMP和cGMP含量的影响(pmol/mg蛋白，
±s) 组别, 百拇医药
2 h
8 h
12 h
24 h
cAMP
A组
0.81±0.12
0.79±0.09
0.83±0.14
0.72±0.25
B组
1.46±0.34*
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1.87±0.12*
2.18±0.36**
1.89±0.42**
C组
1.87±0.36*
2.16±0.36*
2.36±0.41**
2.12±0.39**
cGMP
A组
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0.48±0.08
0.46±0.06
0.53±0.11
0.58±0.14
B组
0.59±0.13
0.71±0.12*
0.94±0.26**
1.02±0.32**
C组
0.52±0.21
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0.58±0.21*
0.60±0.24*
0.68±0.29
注：每组6板 与A组比较，*P<0.05，**P<0.01 CO是一种新的血管舒张因子和信使因子，在生物体内的作用方式和NO相似，主要是通过激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，调节 cGMP的合成，而 cGMP在许多组织特别是平滑肌中起重要的调节作用。我们的研究发现，低浓度 CO在缺氧条件下处理VSMC，其生长状况接近常氧情况，具有对抗缺氧的效应[5] 。但是实验表明， CO可使缺氧导致[Ca2+]的升高趋势降低，cGMP含量升高，对cAMP的影响不明显。所以，这种对抗效应只能是部分的。低浓度 CO通过第二信使系统只能部分地调节缺氧的效应。 我们的实验证明，外源性低浓度CO既可通过调节VSMC内cGMP的水平，也可以通过调节细胞内[Ca2+]水平来对VSMC发挥作用。
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有人研究了持续慢性缺氧条件下兔主动脉平滑肌细胞的变化，发现缺氧12 h时血红素氧合酶mRNA水平比常氧组细胞增加6倍。缺氧15 h血红素加氧酶(HO-1)的表达水平可达到最高值，在随后的24～48 h会逐渐降低至基础水平。但HO-1mRNA的半衰期保持不变，这表明缺氧条件下平滑肌细胞主要增加HO-1的转录速率，而不是增加mRNA的寿命。另外，在缺氧条件下，HO-1酶的活性变化与其mRNA的水平变化相平行，都有一个先增高然后恢复至基线水平的过程。在缺氧条件下，由于HO-1 mRNA表达水平及其酶活性增高，因而其产生的 CO增多， CO可激活sGC，产生第二信使物质cGMP，cGMP能够调节血管阻力，从而改善血液供给，一定程度上可以缓解缺氧对机体造成的损害[6] 。有人将血红素和亚砷酸盐分别与VSMC培养24 h，发现细胞内HO活性及cGMP浓度都有明显升高，而且锌原卟啉-9能够降低细胞内cGMP浓度，证明了HO的诱导剂似乎不可能直接作用于sGC。因此可以认为，HO通过调节平滑肌细胞内cGMP的水平，从而引起血管舒张，血流量增加。此外， CO能够逆转高钾或去甲肾上腺素引起的血管收缩，可能通过抑制Ca2+流入血管平滑肌细胞中，以降低细胞内游离[Ca2+]来松弛血管平滑肌和扩张血管[7]。
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E2F家族包括c-myc 、周期素(cyclin)和DNA聚合酶α，E2F-1是第一个被鉴定的成员，主要控制G1/S期转录。有报道， CO通过抑制 E2F-1基因表达及蛋白质产生来降低c-myc mRNA水平(c-myc是E2F-1作用的目标基因)，进而调节VSMC 对缺氧的应答。 CO合成抑制剂锡原卟啉可以促进VSMC对内皮素的应答，可使E2F-1mRNA水平升高4倍，而E2F-1是控制多种S期基因的关键因子，可以调节细胞应答生长因子的能力。实验还证实，缺氧时VSMC产生的 CO可以升高cGMP的水平，而E2F-1表达可以降低相应升高的部分。说明CO还通过cGMP依赖通道抑制E2F-1表达和对VSMC的促有丝分裂效应[8]。当然还存在其他机制，比如激活细胞上各种类型的K+通道，抑制细胞色素P450依赖的单氧酶系统[9]等，还有待深入研究。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700057)
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参考文献
1，Hayward CS, Rogers P, Keogh AM, et al. Inhaled nitric oxide in cardiac failure: vascular versus ventricular effects. J Cardiovasc Pharmacol, 1996, 27: 80-85.
2，王关嵩,钱桂生,杨晓静，等. 两种酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞生长特性的比较. 第三军医大学学报, 1999，21：765-767.
3，王林，熊密，车东媛，等.低氧对肺血管周细胞增殖及分化的影响.中华结核和呼吸杂志，1999，22：176-178.
4，王关嵩，钱桂生，杨晓静，等.低氧肺微血管内皮细胞培养液对肺动脉平滑肌细胞的作用.中国病理生理杂志，1999，15：933.
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5，王关嵩，钱桂生，杨晓静，等.一氧化碳对缺氧大鼠血管平滑肌细胞低氧性增殖反应的作用.中国病理生理杂志，2000，16：117-119.
6，Morita T, Perrella MA,Lee ME， et al. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 28:1475-1479.
7，Sammut IA ,Foresti R, Clark JE, et al. Carbon monoxide is a major contributor to the regulation of vascular tone in aortas expressing high levels of haeme oxygenase-1. Br J Pharmacol, 1998，125: 1437-1444.
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8，Morita T,Mitsialis SA, Koike H, et al.Carbon monoxide controls the proliferation of hypoxic vascular smooth muscle cells. J Biol Chem, 1997， 272:32804-32809.
9，Wang R. Resurgence of carbon monoxide:an endogenous gaseous vasorelaxing factor.Can J Physiol Pharmacol, 1998，76: 1-15.
收稿日期：2000-04-17, 百拇医药