银染mRNA差异显示法分离黄芪与当归肾脏保护作用相关基因
作者：余凌 王海燕 吕有勇 李惊子
单位：余凌(北京大学第一医院肾内科、肾脏病研究所 100034)；王海燕(北京大学第一医院肾内科、肾脏病研究所 100034)；李惊子(北京大学第一医院肾内科、肾脏病研究所 100034)；吕有勇(北京肿瘤分子生物学实验室)
关键词：肾脏；基因表达；黄芪；当归；差异显示
中华内科杂志001009 【摘要】 目的 分离与肾脏疾病慢性进展相关的基因，以及黄芪、当归药物防治肾硬化相关的基因。方法 以银染mRNA差异显示法对比正常肾脏、肾病综合征后硬化肾脏以及黄芪、当归治疗组的肾脏基因表达，并分离疾病状态下表达发生改变且能被黄芪、当归治疗纠正的基因。结果 分离、克隆了26个黄芪、当归对肾脏具有保护作用的相关基因片段，随机选取8个进行Northern杂交验证，其一被证实在肾硬化过程中表达下调；黄芪、当归治疗组其表达恢复。测序后同源性比较显示为一新基因。结论 银染mRNA差异显示法是简便快捷的分离差异基因的方法，本实验分离的新基因可能参与了肾脏疾病的慢性进展，并与黄芪、当归的治疗作用有关。
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Isolation of genes associated with renoprotective effects of astragalus and angelica by silver staining mRNA differential display
YU Ling WANG Haiyan LÜ Youyong
(Renal Division,The First Teaching Hospital and Institute of Nephrology, Peiking University, Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To isolate genes associated with chronic progression of renal diseases and renoprotective effects of Astragalus and Angelica(A & A). Methods Chronic puromycin nephropathy, which is characterized by massive proteinuria and progressive glomerular sclerosis and tubulointerstitial fibrosis, was induced in SD rats by repeated peritoneal injections of puromycin.Rats were randomly divided into three groups: (1) normal control (n=7), (2) puromycin nephropathy without A&A treatment (n=7), (3) puromycin nephropathy A & A treatment (3 ml/d, n=7). After 12 weeks, serum, urine and renal tissue were collected for study. The technique of silver staining mRNA differential display (DD) was used to investigate the changes of gene expression in kidneys of normal and nephropathy with and without A&A treatment rats. Genes expressing differently during the progression of renal diseases were isolated and the progression could be normalized by A&A. Results Twenty-six candidate cDNA fragments were isolated with DD. Northern blot analysis of eight randomly chosen candidate cDNA fragments demonstrated one exhibiting reduced mRNA expression in the fibrogenic process but upregulated by A&A treatment. Besides kidney, the gene was also expressed in lung, heart, liver and spleen. Whether it takes part in fibrogenic processes of these organs needs further study. Homology analysis through BLAST revealed that this gene was a novel one. Conclusion Silver staining mRNA differential display is a simple and quick technique for isolating differently expressed genes. The downregulated expression of the isolated new gene may contribute significantly to the fibrogenic process and be associated with A&A′s protective effects.
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【Key words】 Kidney； Gene expression； Astragalus； Angelica； Differential display
黄芪、当归合剂(A-A)治疗肾病综合征，已在我研究所的系列实验研究和长期临床实践中得到证实。其主要作用表现在调整蛋白和脂肪代谢紊乱以及保护肾功能[1, 2], 通过比较单味当归、单味黄芪、黄芪多糖I、黄芪多糖Ⅱ、黄芪皂甙和A-A，证实A-A具有最佳的疗效[1]。我所近年研究还发现，A-A能够有效地延缓肾脏疾病的慢性进展，并可恢复相应的形态学损伤[3]；这一效果可能部分是通过减少单核/巨噬细胞浸润、抑制间质成纤维细胞活化及下调TGFβ1表达而实现的[4]。但仅从有限的已知因子入手的研究，还不能全面阐明A-A的作用机制。事实上疾病的发生、发展以及在药物治疗过程中，会出现多种mRNA表达水平的改变。尽可能全面地分析这些表达发生改变的基因，有助于揭示疾病病理生理过程的分子机制。近年来随着mRNA差异显示(DD)、代表性差异分析(RDA)和抑制性差减杂交(SSH)等技术的产生和成熟，一些新的肾脏疾病相关基因被相继克隆[5-7]，有力地推动了肾脏疾病的防治研究。本实验用mRNA差异显示法分离和克隆了与黄芪、当归肾脏保护作用相关的基因。
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材料和方法
1.药物和试剂：A-A(自制)，称取等量黄芪(内蒙产)、当归(甘肃产)生药，水煎，浓缩成每ml 相当于黄芪、当归生药各0.7 g；嘌呤霉素氨基核苷(Sigma公司)；TRIZOL试剂(Gibco BRL公司)，DD-PCR引物(GenHunter公司)，MMLV逆转录酶(Gibco BRL公司)，Ampli Taq酶(Perkin-Elmer公司)，32PdCTP购自Dupont公司， pGEM-T easy克隆载体、随机引物标记试剂盒和其余分子生物学试剂购自Promega公司。
2.动物模型：选取雄性SD大鼠，体重 (138±26) g (北京大学医学部动物中心提供)，两次尿蛋白定性实验阴性。用嘌呤霉素100 mg/kg体重给予大鼠腹腔注射，其后每隔2周给25 mg/kg，共5次，正常对照组(7只)腹腔注射等量生理盐水。选取首次给药后2周尿蛋白>150 mg/24 h大鼠，随机分为肾病综合征对照组(7只)和A-A治疗组(7只)，自首次注射嘌呤霉素后2周，各组均经灌胃给药，中药组每天灌A-A 3 ml(相当于黄芪、当归生药各2.1 g)，正常对照组和肾病综合征对照组每天给清水3 ml，共用药10周。12周末实验结束时，留取血、尿及肾组织进行生化和病理学检测。
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3.肾组织总RNA的提取和DNA酶消化：实验结束时取肾皮质，迅速液氮冷冻，-70 ℃保存。1个月内提取RNA，使用TRIZOL试剂，方法按试剂盒说明书进行。将50 μg RNA样品稀释至48 μl，加10×缓冲液6 μl，1U/μl DNase I 5 μl，40 U/μl RNasin 1 μl，37 ℃ 30 min。消化完毕后酚、氯仿抽提1次，乙醇沉淀。沉淀溶解后取部分样品测定OD260和OD280，并于1.2 %甲醛变性凝胶电泳，计算RNA含量并估计纯度。
4.逆转录合成cDNA的第1链： 将3种锚定引物T12AG、T12CG、T12GG以等摩尔比混合为dT12MG，终浓度为3.3 μmol/L each(同法配得T12MC、T12MT、T12MA)。反应体系：5×RT缓冲液4 μl，250 μmol/L dNTP 1.6 μl，100 mmol/L DTT 2 μl，40 U/μl Rnasin 1 μl，dT12MG引物2 μl，0.1 μg/μl RNA 2 μl，加水使总体积为19 μl。65 ℃ 5 min，37 ℃ 60 min(10 min时加200 U/μl MMLV 1 μl)，95 ℃ 5 min结束反应。
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5.DD-PCR： 反应体系20 μl，其中10×PCR缓冲液2 μl，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μl，10 μmol/L T12MG引物0.4 μl， 2 μmol/L AP引物2 μl，5 U/μl Taq酶0.5 μl，逆转录混合物0.4 μl，加水13.1 μl。94 ℃ 预变性150 s；94 ℃ 30 s，40 ℃ 2 min，72 ℃ 30 s，循环40次；最后72 ℃ 10 min延伸。
6.走胶、银染： 取PCR产物5 μl与15 μl加样缓冲液混合，80 ℃ 沙浴2 min，立刻插干冰后上样；8%变性聚丙烯酰胺凝胶(8 mol/L尿素)，厚1 mm，横流5 mA，电泳16 h。取出凝胶后，10%乙醇固定10 min，1%硝酸还原7 min，0.012 mol/L硝酸银(含1/1000 体积37%甲醛)染色30 min，0.28 mol/L预冷碳酸钠(含1/2000 体积37%甲醛)显色至条带清晰，立刻10%醋酸终止反应。
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7.差异显示条带的回收和再扩增： 用干净手术刀从凝胶上切下差异显示DNA条带放入离心管中，加0.1×TE 100 μl浸泡数分钟，煮沸15 min。离心后吸取上清至另一离心管中加1/10体积3 mol/L醋酸钠、1/20体积糖元(10 mg/ml)和4.5体积无水乙醇，-20 ℃过夜。离心回收沉淀，溶于10 μl去离子水中。取2 μl用于PCR再扩增，反应体系和循环参数同DD-PCR。反应产物走2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
8.差异显示条带的克隆： 2×连接缓冲液5 μl, T4 DNA 连接酶1 μl, pGEM-T easy 载体50 ng/μl 1 μl, PCR产物1～3 μl(使载体与PCR片段的摩尔比为1∶1)，加水补足10 μl, 4 ℃连接过夜。制备新鲜JM109感受态细菌100 μl，加入连接混合物5 μl进行转化。全部转化菌铺LB/Amp+/IPTG/X-Gal盘。培养过夜，挑菌、摇菌、小提质粒。EcoR I酶切鉴定，电泳照相。
9.Northern杂交： 20 μg RNA变性后，于1.2%甲醛变性凝胶(含EB)电泳、照相。毛细管法转移RNA至HybondTM-N+尼龙膜。EcoR I酶切质粒，酚冻融法回收插入的基因片段，随机引物法标记探针。杂交体系为1 mmol/L EDTA、0.25 mol/L Na2HPO4(pH 7.2)、7%SDS，65 ℃ 杂交24 h。1 mmol/L EDTA、40 mmol/L Na2HPO4(pH 7.2)、5% SDS，65 ℃洗膜2次(1次60 min)后，-70 ℃暴光1周。经激光密度扫描仪测出杂交斑点吸收值，以18 S rRNA校正RNA加样量。
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10.序列分析和同源性比较： 使用OpengeneTM Ultra VGA 1280自动序列分析仪双脱氧核苷酸链终
表1 各组生化指标及损伤指数比较(
±s) 组别
只数
尿蛋白(mg/24 h)
血白蛋白(g/L)
BUN(mmol/L)
肾小球损伤指数
肾小管间质损伤指数
正常对照组
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7
45± 17
28.7±0.67
9.3± 0.5
1.04±0.35
0.93±0.34
肾病对照组
7
1167±107
20.33±0.8
37.4±15.0
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6.54±3.25
11.35±2.03
A-A治疗组
7
712±136△
27.9±2.1△
13.2± 1.8△
3.12±1.16△
3.90±1.07△
注：与正常组比较，P<0.05；与肾病综合征对照组比较，△P<0.05止法测序。通过联机BLAST程序将所得序列与基因数据库中已有序列进行同源性比较。 11.统计学处理：结果用均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用F 检验。
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结果
肾病综合征对照组大鼠尿蛋白持续增多，实验结束时已有严重的低白蛋白血症和高脂血症；A-A在实验后期有一定降低尿蛋白的作用，并维持了正常的血浆蛋白水平。A-A治疗组大鼠肾功能正常，而未经A-A治疗的大鼠出现氮质血症。肾病综合征对照组病理显示多数肾小球中、重度细胞增生，细胞外基质明显增多，局灶节段硬化；肾小管多灶状萎缩，肾间质多灶性单个核细胞浸润，间质纤维化和水肿。A-A治疗组仅见少数肾小球系膜细胞和基质中度节段性增多，肾小管灶状上皮细胞空泡变性，无萎缩，未见间质水肿和间质纤维化。半定量分析显示治疗组肾小球损伤指数和肾小管间质损伤指数均明显低于肾病综合征对照组(P<0.05)，见表1。
从正常组、肾病综合征对照组和A-A治疗组大鼠肾皮质提取RNA后经鉴定无降解，随即逆转录合成cDNA第一链。用4种T12MN锚定引物与14种10聚体随机引物(AP引物)进行组合，共进行了56种PCR扩增反应，初步筛选得到26条差异显示条带，见图1。经过回收和PCR再扩增，部分再扩增产物在琼脂糖胶上呈现非单一条带，或无条带。分别通过降低dNTP浓度或二轮PCR，一部分还可获得成功，仍无效者属再扩增失败。将条带单一、大小正确的再扩增产物进行TA克隆。挑选单一白色菌落，扩增后提取质粒，酶切电泳，证实均为重组质粒且插入片段与目的片段大小一致，见图2。经Northern blot验证，8个差异片段中仅1个得到证实，其余表现为无差异或无杂交信号。为进一步明确该基因(C4-1)组织表达分布特点，我们提取了正常大鼠心肌、肝、脾、胃、小肠、肺组织的RNA，进行Northern杂交。结果显示除肾脏外该基因在脾脏高表达，在肝、肺和心肌也有一定表达，见图3。该基因片段约450个核苷酸，测序后经因特网到Genebank、EMBL (european molecular biology laboratory)、DDBJ (DNA data bank of Japan) 检索表明，至1999年12月，在已登录的基因资料中，未见与本片段同源序列大于100个核苷酸，匹配率大于90%的基因，提示该基因可能为一未知基因。
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图1 逆转录PCR后，8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染结果
图2 TA克隆后EcoRI酶切鉴定结果
图3 侯选cDNA片段C4-1 Northern 杂交结果
讨论
终末期肾脏疾患(ESRD)的防治一直是肾脏病界的重大课题。临床观察表明，许多肾脏疾病发展到一定阶段后，无论原发疾患还是否存在，肾脏损伤都会不断进展，直至肾小球硬化和(或)肾小管间质纤维化。因此，延缓和阻断肾脏损害的慢性进展是防治ESRD的关键。近年来已有大规模的临床研究证明，严格的血压控制和降低尿蛋白排出量能够在一定程度上延缓肾脏损害的进展。规律地使用血管紧张素转换酶抑制剂，在上述两方面均有肯定的治疗作用[8]。我所在动物模型中既往的研究证实，A-A能够减轻慢性嘌呤霉素肾病的肾小球硬化和肾小管间质纤维化，且其肾脏保护作用与肾素-血管紧张素系统无明确关系；降低血压和减少尿蛋白也不是其主要作用机制，从而提示A-A对ESRD的防治尚有其他作用环节[3]。因而深入研究A-A的作用机制，对于我们认识肾脏疾病慢性进展的实质和防治ESRD具有重要意义。
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A-A治疗肾脏疾病的作用机制是复杂而多方面的。早在蛋白质和脂质代谢的研究中就发现，A-A能够促进肝细胞白蛋白基因的转录[1]，增强脂蛋白酯酶与卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性，并上调LDL受体mRNA的表达[2]；近年来在用其防治肾脏纤维化的研究中，亦证实A-A能够减少单核/巨噬细胞浸润、抑制间质成纤维细胞活化及下调TGFβ1的表达[4]。但是，对于这种多基因参与的疾病及其治疗，仅从有限的已知因子入手往往很难揭示其全貌，也难以中断其“瀑布”反应。因此寻找新的相关基因，应是我们认识肾脏疾病慢性进展发生机制的主要突破口。近10年来，DD、RDA和SSH等技术相继产生并迅速取代了既往繁琐、昂贵的研究方法，使得基因研究得以广泛地与临床工作相结合。肾脏病界在这方面也取得了一些初步的成果，例如多个糖尿病肾病相关基因已被分离和克隆[5]；Narita等[6]在慢性肾小球肾炎模型、张宏等[7]在肾大部切除模型中均初步探讨了肾纤维化相关基因，目前正在力争获得基因全长并对其进行功能研究。
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作为寻找差异表达基因的方法之一，DD由于其效率高和费用相对较低，已经成功地运用于许多领域[9]。本实验采用的银染法DD较传统的核素DD，不需要特殊防护和处理，工作量小，实验周期明显缩短；尤其在回收差异片段时可直视进行，简便、准确。但DD也存在一些缺点，如假阳性率高，对稀有基因敏感性低以及重复性差等[10]。假阳性条带一直是困扰实验者的主要问题，发生率可高达70%～90%[5]。因此，对DD分离出的差异片段必须经过其他方法验证，而Northern杂交是经典验证方法。本实验中也注意到类似现象：即尽管我们对实验条件、实验耗材、试剂的质量进行了严格控制，在防止RNA降解、残留DNA污染、PCR非特异扩增、差异片段回收误差等常见导致假阳性的原因方面采取了相应措施，但最终在8个差异片段中，仅1个被证实为在不同组大鼠肾组织中的表达确有差异。目前，已有许多研究者从不同角度探讨了造成假阳性条带的可能原因，并就方法学本身提出了一些改进措施[11，12]。我们认为，在实验中设立重复对照是简便有效的降低假阳性条带的方法。
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本实验于再次证实A-A具有肾脏保护作用的基础上，采用银染mRNA差异显示技术，比较了正常大鼠、肾纤维化大鼠和A-A治疗后的大鼠肾皮质基因表达的异同。筛选了基因表达在正常大鼠与肾纤维化大鼠间存在差异，并且能够被A-A治疗所逆转的差异显示基因片段作了进一步研究。此法所得到的疾病相关基因，更有可能是直接参与疾病发生发展过程的致病基因或保护基因。经过测序，发现该基因片段C4-1与目前已知基因无明显同源性，可能为一未知基因。Northern杂交以18 S rRNA作为内参照校正RNA含量，以排除因肾脏病变不同而导致组织细胞数目不一对结果的干扰，证实了C4-1的差异表达。此项实验结果提示，其蛋白产物可能有一定肾脏保护作用，黄芪、当归合剂的作用机制可能与其上调该基因表达有关。该基因在心、肺、肝等脏器也有表达，是否也参与这些脏器疾病状态下的纤维化过程还有待更多的研究证实。因此，继续通过筛选cDNA文库和RACE等方法获取该基因cDNA全长序列，进而研究对应蛋白质的结构和功能具有实际意义。
总之，银染mRNA差异显示法是一种分离和克隆疾病相关基因的有效方法。本实验所获得的基因可能参与了肾脏损伤的慢性进展，而且和黄芪、当归对肾脏的保护作用有关。对本基因相关蛋白及其功能的研究还有待进一步深入。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970929)
参考文献
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2，俞雷，李惊子，洪健美，等. 黄芪当归合剂降低肾病综合征大鼠血脂机制的探讨. 中华肾脏病杂 志,1999，15：337-339.
3，鲁盈，李惊子，郑欣，等. 黄芪当归合剂对肾病综合征血清脂谱和肾小球硬化的影响. 中国中西医结合杂志，1997, 8：478-480.
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4，丁伟，李惊子，邹万忠，等. 黄芪当归合剂对肾病综合征鼠肾转化生长因子β1的影响. 中华肾脏病杂志,1998,14：229-232.
5，Holmes DI, Abdel Wahab N , Mason RM. Identification of glucose-regulated genes in human mensangial cells by mRNA differential display. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 238: 179-184.
6，Narita I, Nakayama H, Goto S, et al. Identification of genes specifically expressed in chronic and progressive glomerulosclerosis. Kidney Int Suppl,1997, 63 : S215-S217.
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收稿日期：2000-02-01, 百拇医药
单位：余凌(北京大学第一医院肾内科、肾脏病研究所 100034)；王海燕(北京大学第一医院肾内科、肾脏病研究所 100034)；李惊子(北京大学第一医院肾内科、肾脏病研究所 100034)；吕有勇(北京肿瘤分子生物学实验室)
关键词：肾脏；基因表达；黄芪；当归；差异显示
中华内科杂志001009 【摘要】 目的 分离与肾脏疾病慢性进展相关的基因，以及黄芪、当归药物防治肾硬化相关的基因。方法 以银染mRNA差异显示法对比正常肾脏、肾病综合征后硬化肾脏以及黄芪、当归治疗组的肾脏基因表达，并分离疾病状态下表达发生改变且能被黄芪、当归治疗纠正的基因。结果 分离、克隆了26个黄芪、当归对肾脏具有保护作用的相关基因片段，随机选取8个进行Northern杂交验证，其一被证实在肾硬化过程中表达下调；黄芪、当归治疗组其表达恢复。测序后同源性比较显示为一新基因。结论 银染mRNA差异显示法是简便快捷的分离差异基因的方法，本实验分离的新基因可能参与了肾脏疾病的慢性进展，并与黄芪、当归的治疗作用有关。
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Isolation of genes associated with renoprotective effects of astragalus and angelica by silver staining mRNA differential display
YU Ling WANG Haiyan LÜ Youyong
(Renal Division,The First Teaching Hospital and Institute of Nephrology, Peiking University, Beijing 100034, China)
【Abstract】 Objective To isolate genes associated with chronic progression of renal diseases and renoprotective effects of Astragalus and Angelica(A & A). Methods Chronic puromycin nephropathy, which is characterized by massive proteinuria and progressive glomerular sclerosis and tubulointerstitial fibrosis, was induced in SD rats by repeated peritoneal injections of puromycin.Rats were randomly divided into three groups: (1) normal control (n=7), (2) puromycin nephropathy without A&A treatment (n=7), (3) puromycin nephropathy A & A treatment (3 ml/d, n=7). After 12 weeks, serum, urine and renal tissue were collected for study. The technique of silver staining mRNA differential display (DD) was used to investigate the changes of gene expression in kidneys of normal and nephropathy with and without A&A treatment rats. Genes expressing differently during the progression of renal diseases were isolated and the progression could be normalized by A&A. Results Twenty-six candidate cDNA fragments were isolated with DD. Northern blot analysis of eight randomly chosen candidate cDNA fragments demonstrated one exhibiting reduced mRNA expression in the fibrogenic process but upregulated by A&A treatment. Besides kidney, the gene was also expressed in lung, heart, liver and spleen. Whether it takes part in fibrogenic processes of these organs needs further study. Homology analysis through BLAST revealed that this gene was a novel one. Conclusion Silver staining mRNA differential display is a simple and quick technique for isolating differently expressed genes. The downregulated expression of the isolated new gene may contribute significantly to the fibrogenic process and be associated with A&A′s protective effects.
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【Key words】 Kidney； Gene expression； Astragalus； Angelica； Differential display
黄芪、当归合剂(A-A)治疗肾病综合征，已在我研究所的系列实验研究和长期临床实践中得到证实。其主要作用表现在调整蛋白和脂肪代谢紊乱以及保护肾功能[1, 2], 通过比较单味当归、单味黄芪、黄芪多糖I、黄芪多糖Ⅱ、黄芪皂甙和A-A，证实A-A具有最佳的疗效[1]。我所近年研究还发现，A-A能够有效地延缓肾脏疾病的慢性进展，并可恢复相应的形态学损伤[3]；这一效果可能部分是通过减少单核/巨噬细胞浸润、抑制间质成纤维细胞活化及下调TGFβ1表达而实现的[4]。但仅从有限的已知因子入手的研究，还不能全面阐明A-A的作用机制。事实上疾病的发生、发展以及在药物治疗过程中，会出现多种mRNA表达水平的改变。尽可能全面地分析这些表达发生改变的基因，有助于揭示疾病病理生理过程的分子机制。近年来随着mRNA差异显示(DD)、代表性差异分析(RDA)和抑制性差减杂交(SSH)等技术的产生和成熟，一些新的肾脏疾病相关基因被相继克隆[5-7]，有力地推动了肾脏疾病的防治研究。本实验用mRNA差异显示法分离和克隆了与黄芪、当归肾脏保护作用相关的基因。
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材料和方法
1.药物和试剂：A-A(自制)，称取等量黄芪(内蒙产)、当归(甘肃产)生药，水煎，浓缩成每ml 相当于黄芪、当归生药各0.7 g；嘌呤霉素氨基核苷(Sigma公司)；TRIZOL试剂(Gibco BRL公司)，DD-PCR引物(GenHunter公司)，MMLV逆转录酶(Gibco BRL公司)，Ampli Taq酶(Perkin-Elmer公司)，32PdCTP购自Dupont公司， pGEM-T easy克隆载体、随机引物标记试剂盒和其余分子生物学试剂购自Promega公司。
2.动物模型：选取雄性SD大鼠，体重 (138±26) g (北京大学医学部动物中心提供)，两次尿蛋白定性实验阴性。用嘌呤霉素100 mg/kg体重给予大鼠腹腔注射，其后每隔2周给25 mg/kg，共5次，正常对照组(7只)腹腔注射等量生理盐水。选取首次给药后2周尿蛋白>150 mg/24 h大鼠，随机分为肾病综合征对照组(7只)和A-A治疗组(7只)，自首次注射嘌呤霉素后2周，各组均经灌胃给药，中药组每天灌A-A 3 ml(相当于黄芪、当归生药各2.1 g)，正常对照组和肾病综合征对照组每天给清水3 ml，共用药10周。12周末实验结束时，留取血、尿及肾组织进行生化和病理学检测。
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3.肾组织总RNA的提取和DNA酶消化：实验结束时取肾皮质，迅速液氮冷冻，-70 ℃保存。1个月内提取RNA，使用TRIZOL试剂，方法按试剂盒说明书进行。将50 μg RNA样品稀释至48 μl，加10×缓冲液6 μl，1U/μl DNase I 5 μl，40 U/μl RNasin 1 μl，37 ℃ 30 min。消化完毕后酚、氯仿抽提1次，乙醇沉淀。沉淀溶解后取部分样品测定OD260和OD280，并于1.2 %甲醛变性凝胶电泳，计算RNA含量并估计纯度。
4.逆转录合成cDNA的第1链： 将3种锚定引物T12AG、T12CG、T12GG以等摩尔比混合为dT12MG，终浓度为3.3 μmol/L each(同法配得T12MC、T12MT、T12MA)。反应体系：5×RT缓冲液4 μl，250 μmol/L dNTP 1.6 μl，100 mmol/L DTT 2 μl，40 U/μl Rnasin 1 μl，dT12MG引物2 μl，0.1 μg/μl RNA 2 μl，加水使总体积为19 μl。65 ℃ 5 min，37 ℃ 60 min(10 min时加200 U/μl MMLV 1 μl)，95 ℃ 5 min结束反应。
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5.DD-PCR： 反应体系20 μl，其中10×PCR缓冲液2 μl，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μl，10 μmol/L T12MG引物0.4 μl， 2 μmol/L AP引物2 μl，5 U/μl Taq酶0.5 μl，逆转录混合物0.4 μl，加水13.1 μl。94 ℃ 预变性150 s；94 ℃ 30 s，40 ℃ 2 min，72 ℃ 30 s，循环40次；最后72 ℃ 10 min延伸。
6.走胶、银染： 取PCR产物5 μl与15 μl加样缓冲液混合，80 ℃ 沙浴2 min，立刻插干冰后上样；8%变性聚丙烯酰胺凝胶(8 mol/L尿素)，厚1 mm，横流5 mA，电泳16 h。取出凝胶后，10%乙醇固定10 min，1%硝酸还原7 min，0.012 mol/L硝酸银(含1/1000 体积37%甲醛)染色30 min，0.28 mol/L预冷碳酸钠(含1/2000 体积37%甲醛)显色至条带清晰，立刻10%醋酸终止反应。
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7.差异显示条带的回收和再扩增： 用干净手术刀从凝胶上切下差异显示DNA条带放入离心管中，加0.1×TE 100 μl浸泡数分钟，煮沸15 min。离心后吸取上清至另一离心管中加1/10体积3 mol/L醋酸钠、1/20体积糖元(10 mg/ml)和4.5体积无水乙醇，-20 ℃过夜。离心回收沉淀，溶于10 μl去离子水中。取2 μl用于PCR再扩增，反应体系和循环参数同DD-PCR。反应产物走2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
8.差异显示条带的克隆： 2×连接缓冲液5 μl, T4 DNA 连接酶1 μl, pGEM-T easy 载体50 ng/μl 1 μl, PCR产物1～3 μl(使载体与PCR片段的摩尔比为1∶1)，加水补足10 μl, 4 ℃连接过夜。制备新鲜JM109感受态细菌100 μl，加入连接混合物5 μl进行转化。全部转化菌铺LB/Amp+/IPTG/X-Gal盘。培养过夜，挑菌、摇菌、小提质粒。EcoR I酶切鉴定，电泳照相。
9.Northern杂交： 20 μg RNA变性后，于1.2%甲醛变性凝胶(含EB)电泳、照相。毛细管法转移RNA至HybondTM-N+尼龙膜。EcoR I酶切质粒，酚冻融法回收插入的基因片段，随机引物法标记探针。杂交体系为1 mmol/L EDTA、0.25 mol/L Na2HPO4(pH 7.2)、7%SDS，65 ℃ 杂交24 h。1 mmol/L EDTA、40 mmol/L Na2HPO4(pH 7.2)、5% SDS，65 ℃洗膜2次(1次60 min)后，-70 ℃暴光1周。经激光密度扫描仪测出杂交斑点吸收值，以18 S rRNA校正RNA加样量。
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10.序列分析和同源性比较： 使用OpengeneTM Ultra VGA 1280自动序列分析仪双脱氧核苷酸链终
表1 各组生化指标及损伤指数比较(
±s) 组别只数
尿蛋白(mg/24 h)
血白蛋白(g/L)
BUN(mmol/L)
肾小球损伤指数
肾小管间质损伤指数
正常对照组
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7
45± 17
28.7±0.67
9.3± 0.5
1.04±0.35
0.93±0.34
肾病对照组
7
1167±107
20.33±0.8
37.4±15.0
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6.54±3.25
11.35±2.03
A-A治疗组
7
712±136△
27.9±2.1△
13.2± 1.8△
3.12±1.16△
3.90±1.07△
注：与正常组比较，P<0.05；与肾病综合征对照组比较，△P<0.05止法测序。通过联机BLAST程序将所得序列与基因数据库中已有序列进行同源性比较。 11.统计学处理：结果用均数±标准差(
±s)表示，多组间比较采用F 检验。, http://www.100md.com
结果
肾病综合征对照组大鼠尿蛋白持续增多，实验结束时已有严重的低白蛋白血症和高脂血症；A-A在实验后期有一定降低尿蛋白的作用，并维持了正常的血浆蛋白水平。A-A治疗组大鼠肾功能正常，而未经A-A治疗的大鼠出现氮质血症。肾病综合征对照组病理显示多数肾小球中、重度细胞增生，细胞外基质明显增多，局灶节段硬化；肾小管多灶状萎缩，肾间质多灶性单个核细胞浸润，间质纤维化和水肿。A-A治疗组仅见少数肾小球系膜细胞和基质中度节段性增多，肾小管灶状上皮细胞空泡变性，无萎缩，未见间质水肿和间质纤维化。半定量分析显示治疗组肾小球损伤指数和肾小管间质损伤指数均明显低于肾病综合征对照组(P<0.05)，见表1。
从正常组、肾病综合征对照组和A-A治疗组大鼠肾皮质提取RNA后经鉴定无降解，随即逆转录合成cDNA第一链。用4种T12MN锚定引物与14种10聚体随机引物(AP引物)进行组合，共进行了56种PCR扩增反应，初步筛选得到26条差异显示条带，见图1。经过回收和PCR再扩增，部分再扩增产物在琼脂糖胶上呈现非单一条带，或无条带。分别通过降低dNTP浓度或二轮PCR，一部分还可获得成功，仍无效者属再扩增失败。将条带单一、大小正确的再扩增产物进行TA克隆。挑选单一白色菌落，扩增后提取质粒，酶切电泳，证实均为重组质粒且插入片段与目的片段大小一致，见图2。经Northern blot验证，8个差异片段中仅1个得到证实，其余表现为无差异或无杂交信号。为进一步明确该基因(C4-1)组织表达分布特点，我们提取了正常大鼠心肌、肝、脾、胃、小肠、肺组织的RNA，进行Northern杂交。结果显示除肾脏外该基因在脾脏高表达，在肝、肺和心肌也有一定表达，见图3。该基因片段约450个核苷酸，测序后经因特网到Genebank、EMBL (european molecular biology laboratory)、DDBJ (DNA data bank of Japan) 检索表明，至1999年12月，在已登录的基因资料中，未见与本片段同源序列大于100个核苷酸，匹配率大于90%的基因，提示该基因可能为一未知基因。
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图1 逆转录PCR后，8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染结果
图2 TA克隆后EcoRI酶切鉴定结果
图3 侯选cDNA片段C4-1 Northern 杂交结果
讨论
终末期肾脏疾患(ESRD)的防治一直是肾脏病界的重大课题。临床观察表明，许多肾脏疾病发展到一定阶段后，无论原发疾患还是否存在，肾脏损伤都会不断进展，直至肾小球硬化和(或)肾小管间质纤维化。因此，延缓和阻断肾脏损害的慢性进展是防治ESRD的关键。近年来已有大规模的临床研究证明，严格的血压控制和降低尿蛋白排出量能够在一定程度上延缓肾脏损害的进展。规律地使用血管紧张素转换酶抑制剂，在上述两方面均有肯定的治疗作用[8]。我所在动物模型中既往的研究证实，A-A能够减轻慢性嘌呤霉素肾病的肾小球硬化和肾小管间质纤维化，且其肾脏保护作用与肾素-血管紧张素系统无明确关系；降低血压和减少尿蛋白也不是其主要作用机制，从而提示A-A对ESRD的防治尚有其他作用环节[3]。因而深入研究A-A的作用机制，对于我们认识肾脏疾病慢性进展的实质和防治ESRD具有重要意义。
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A-A治疗肾脏疾病的作用机制是复杂而多方面的。早在蛋白质和脂质代谢的研究中就发现，A-A能够促进肝细胞白蛋白基因的转录[1]，增强脂蛋白酯酶与卵磷脂胆固醇酰基转移酶活性，并上调LDL受体mRNA的表达[2]；近年来在用其防治肾脏纤维化的研究中，亦证实A-A能够减少单核/巨噬细胞浸润、抑制间质成纤维细胞活化及下调TGFβ1的表达[4]。但是，对于这种多基因参与的疾病及其治疗，仅从有限的已知因子入手往往很难揭示其全貌，也难以中断其“瀑布”反应。因此寻找新的相关基因，应是我们认识肾脏疾病慢性进展发生机制的主要突破口。近10年来，DD、RDA和SSH等技术相继产生并迅速取代了既往繁琐、昂贵的研究方法，使得基因研究得以广泛地与临床工作相结合。肾脏病界在这方面也取得了一些初步的成果，例如多个糖尿病肾病相关基因已被分离和克隆[5]；Narita等[6]在慢性肾小球肾炎模型、张宏等[7]在肾大部切除模型中均初步探讨了肾纤维化相关基因，目前正在力争获得基因全长并对其进行功能研究。
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作为寻找差异表达基因的方法之一，DD由于其效率高和费用相对较低，已经成功地运用于许多领域[9]。本实验采用的银染法DD较传统的核素DD，不需要特殊防护和处理，工作量小，实验周期明显缩短；尤其在回收差异片段时可直视进行，简便、准确。但DD也存在一些缺点，如假阳性率高，对稀有基因敏感性低以及重复性差等[10]。假阳性条带一直是困扰实验者的主要问题，发生率可高达70%～90%[5]。因此，对DD分离出的差异片段必须经过其他方法验证，而Northern杂交是经典验证方法。本实验中也注意到类似现象：即尽管我们对实验条件、实验耗材、试剂的质量进行了严格控制，在防止RNA降解、残留DNA污染、PCR非特异扩增、差异片段回收误差等常见导致假阳性的原因方面采取了相应措施，但最终在8个差异片段中，仅1个被证实为在不同组大鼠肾组织中的表达确有差异。目前，已有许多研究者从不同角度探讨了造成假阳性条带的可能原因，并就方法学本身提出了一些改进措施[11，12]。我们认为，在实验中设立重复对照是简便有效的降低假阳性条带的方法。
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本实验于再次证实A-A具有肾脏保护作用的基础上，采用银染mRNA差异显示技术，比较了正常大鼠、肾纤维化大鼠和A-A治疗后的大鼠肾皮质基因表达的异同。筛选了基因表达在正常大鼠与肾纤维化大鼠间存在差异，并且能够被A-A治疗所逆转的差异显示基因片段作了进一步研究。此法所得到的疾病相关基因，更有可能是直接参与疾病发生发展过程的致病基因或保护基因。经过测序，发现该基因片段C4-1与目前已知基因无明显同源性，可能为一未知基因。Northern杂交以18 S rRNA作为内参照校正RNA含量，以排除因肾脏病变不同而导致组织细胞数目不一对结果的干扰，证实了C4-1的差异表达。此项实验结果提示，其蛋白产物可能有一定肾脏保护作用，黄芪、当归合剂的作用机制可能与其上调该基因表达有关。该基因在心、肺、肝等脏器也有表达，是否也参与这些脏器疾病状态下的纤维化过程还有待更多的研究证实。因此，继续通过筛选cDNA文库和RACE等方法获取该基因cDNA全长序列，进而研究对应蛋白质的结构和功能具有实际意义。
总之，银染mRNA差异显示法是一种分离和克隆疾病相关基因的有效方法。本实验所获得的基因可能参与了肾脏损伤的慢性进展，而且和黄芪、当归对肾脏的保护作用有关。对本基因相关蛋白及其功能的研究还有待进一步深入。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970929)
参考文献
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收稿日期：2000-02-01, 百拇医药