P21cipl/wafl基因在C57BL/6N系小鼠腭突发育中对细胞增殖周期的调控作用
作者：李 鑫 金 岩 董绍忠 朱萧玲
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：腭裂；细胞周期；P21cipl/wafl基因；程序性细胞死亡
实用口腔医学杂志990122 〔摘要〕 目的：探讨腭裂形成过程中腭突间充质细胞的增殖周期的变化及其调节基因P21cipl/wafl基因表达的意义。方法：用原位杂交、TUNEL染色检测两组小鼠腭突间充质细胞增殖周期调控基因P21cipl/wafl基因的表达及细胞程序性死亡的发生。结果：在腭突发育的垂直生长期、上抬期，实验组中TUNEL阳性指数明显高于对照组(P<0.01)。同时，P21cipl/wafl基因mRNA的转录水平也比同期对照组腭突间质细胞中P21cipl/wafl基因的表达增高(P<0.05)。结论：在腭突发育时期，实验组小鼠腭突间充质未分化细胞增殖周期抑制。P21cipl/wafl基因表达升高提示可能参与了细胞增殖周期抑制过程。
, 百拇医药
The regulation of P21cipl/wafl gene on the mesenchymal cell proliferation cycle during palatal process development in C57BL/6N strain mouse
Li Xin, Jin Yan, Dong Shaozhong, et al.
Departmental of Oral Pathology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032
〔Abstract〕 Objective: To study the cell cycle in palatal mesenchymal cells during formation of cleft palate and to observe the expression of P21cipl/wafl gene. Methods: TUNEL staining was used to detect the programmed cell death and in situ hybridization in palatal mesenchyme was applied to study the expression of P21cipl/wafl gene in the fetus mice with all trans retinoic acid induced cleft palate (experimental group) and in those with normal palate(the control).Results: TUNEL index was higher in the experimental group than in the control in vertical and raising stage of palate development(P<0.01), the level of mRNA transcription of P21cipl/wafl gene was also heiger in experimental group than in the control (P<0.05). Conclusion: Cell cycle inhibition of mesenchymal cells in palatine process may result in cleft palate and P21cipl/wafl overexpression may play an important role in the inhibition.
, 百拇医药
Key words Ceft palate; Cell cycle; P21cipl/wafl gene; Programmed cell death
胚胎时期细胞的增殖多于细胞死亡，机体处于一个生大于死的动态平衡中，发育的个体才得已迅速成长。因此，胚胎早期，细胞的增殖及其增殖周期的调控是否正常对胚胎的发育尤其重要。近年来的研究发现众多的细胞周期负调控基因表达在细胞周期时相的变迁中起重要调节[1]。本研究采用维甲酸诱导建立的C57BL/6N近交系小鼠腭裂模型，用原位杂交方法检测了细胞周期蛋白激酶抑制物基因P21cipl/wafi基因在小鼠腭突正常发育及腭裂形成过程中的表达变化，以期了解P21cipl/wafl基因对胚胎时期腭突间充质细胞增殖周期的调控作用。
1 材料和方法
1.1实验动物及标本制备 将妊娠10d孕鼠随机分为实验组和对照组。按小鼠体重计算给药剂量，实验组小鼠管饲全反式维甲酸80mg/kg(上海第六制药厂)，溶于0.2ml植物油中。对照组管饲等体积的植物油。分布于妊娠第13d14h(略写为GD1314以下类同)、GD1322、GD148、GD1414、GD1422、GD158、GD15227个时间点脱颈处死孕鼠各1只，GD168处死孕鼠各3只，剖宫取胚鼠。体积分数为10%中性甲醛固定2h，常规组织处理后，仔细切除躯干部，小鼠喙部朝下，常规石蜡包埋。5μm连续切片，68℃烤箱烘干。168的标本切片先做HE染色。
, 百拇医药
1.2TUNEL染色方法 见文献[2]。
1.3原位杂交染色方法 见文献[3]。
1.4TUNEL阳性细胞及P21阳性表达细胞指数 TUNEL阳性信号为细胞核蓝色着色。P21原位杂交阳性信号为胞浆的蓝色颗粒。按腭突垂直生长期(GD1314～GD148)、上抬期(GD1414～GD158)、融合期(GD1522～GD168)，用网格(10×10〕测试法，每例计数4个高倍镜视野(40×〕腭突中间充质细胞总数以及阳性细胞数，每个时间点选2例标本。由此，可获得TUNEL及P21基因阳性细胞指数TI、PI。
TI＝TUNEL阳性细胞数/(阴性细胞+阳性细胞)×100%。
PI＝P21基因阳性细胞数/(阴性细胞+阳性细胞)×100%。
, 百拇医药
1.5统计学分析 χ2 检验。
2 结 果
2.1腭裂模型的建立 实验组、对照组分别获胚鼠61只、69只。对照组GD168的20个标本中，HE染色结果观察，两侧腭突之间已经牢固结合。而实验组GD168的17个标本中两侧腭突之间均未互相融合，口腔、鼻腔仍相通。2.2阳性细胞率的比较 按腭突垂直生长期,上抬期,接触融合期分别观察，并对每个发育时期中的两组阳性细胞指数进行比较分析。PCD阳性细胞计数及分布观察：腭突发育至垂直生长期和水平上抬期实验组中阳性细胞数量明显多于对照组(P<0.01)(图1、2)。在垂直生长期阳性细胞集中于腭突的顶端，至上抬期水平向腭突的下1/3处见散在的阳性细胞分布。至接触融合期两组中PCD阳性细胞数量无明显差异(P>0.05)。P21阳性细胞数量及分布观察：在腭突垂直生长期及上抬期，实验组腭间充质中P21mRNA的转录水平明显高于对照组(P<0.01)，阳性细胞多见于腭突顶端边缘(图3、4)。腭突发育至接触融合期，实验组中P21基因表达水平也高于对照组(P<0.05)，阳性细胞散在分布于腭突间质中。如表1所示。
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图1 实验组GD1322，腭突垂直生长、PCD阳性细胞多并集中于腭突顶端及边缘
图2 对照组GD1322，垂直生长的腭突中PCD阳性细胞明显少于同期实验组，呈散在分布
图3 实验组GD1322，P21基因表达阳性细胞多于对照组，阳性细胞集中在腭突下部
图4 对照组GD1322，P21基因表达阳性细胞数减少，阳性细胞多位于腭突的舌侧缘
表1 2组小鼠腭突中P21基因阳性细胞表达指数 腭突发育时期
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n
PI
P值
实验组
对照组
垂直期
12
5%
1.6%
<0.01
上抬期
12
2.7%
, 百拇医药 0.9%
<0.01
融合期
8
3.0%
1.2%
<0.05
3 讨 论
维甲酸(RA)类物质是VitA的衍生物。它不是机体细胞分泌的小分子激素，而是来源于食物中的VitA。存在于体内的具有重要生理活性的VitA代谢产物有全反式维甲酸(ATRA)、3,4-双脱氢维甲酸等。目前研究认为，这些活性物质在生物体的胚胎发育、细胞分化及器官形成、维持正常的生理稳态起重要作用[4]。它作为化学防护及诱导分化剂已经得到大量实验证明，但其诱导细胞分化的分子生物学机理尚未完全明了。RA广泛的生理作用是以RA受体介导而实现的，其受体复合物可与特异的DNA区域结合，调节其邻近靶基因的表达。靶基因的编码产物可能是参与细胞、组织器官的结构蛋白或是参与代谢及调节的酶，也可能是调节下级基因表达的调控蛋白，发挥RA类物质的瀑布式调节功能[5]。
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P21cipl/wafl基因编码的蛋白是首先发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinaseinh ibitor CDI)家族成员。许多研究认为，CDI可能是通过以下3条途径实现其抑制细胞增殖功能：结合各种细胞周期蛋白依赖性激酶蛋白复合物，从而使这复合物的激酶活性丧失；抑制PCNA增殖细胞核抗原与DNA聚合酶δ形成复合物，使DNA全酶复合物不能在DNA单链上滑动干扰DNA复制；抑制应激激活蛋白激酶的活性，使C-jun基因不能发生磷酸化，AP-1不能激活，中断细胞应激状态时的信号传导系统，以上3种途径的激活都能使细胞停滞于G1期而不能进入S期，从而抑制了细胞的增殖[6]。P21基因作为细胞周期变迁的抑制剂，在细胞的增殖调控中起重要作用。本研究结果显示，对照组小鼠腭突从胚胎的GD1314～GD168，历时3d就完成两侧的融合发育过程。提示这段时期正是腭突间充质细胞大量增殖，腭突体积迅速增大的时期。而实验组孕鼠在妊娠第10d摄入大量外源性的RA后，在腭突的垂直生长、上抬期均发现间充质细胞出现超出生理范围的程序性死亡(P<0.01)，使腭突间充质中能够继续生长分化的细胞数量减少，腭突发育受阻，造成仔鼠的腭裂。同时实验组中P21基因的mRNA转录水平也明显升高(P<0.01)。提示实验组小鼠的腭突间充质细胞在短暂的腭突发育期，P21基因可能作为RA的靶基因受其诱导表达增高，其编码的蛋白与相应物质结合，干扰细胞正常的增殖周期，细胞增殖抑制。细胞停止增殖后，如果条件允许可能会进入分化，但与此时机体胚胎发育的调控系统相悖，故多数细胞进入程序性死亡以顺应外界的环境变化。其结果导致腭突发育迟缓，在腭突发育末期即妊娠16d，两侧腭突体积发育小不能相互接触融合而造成腭裂。
, 百拇医药
细胞增殖是胚胎发育、器官形成的重要基础。胚胎早期是未分化间充质细胞大量增殖时期。此时任何干扰细胞增殖周期的外界因素都能影响细胞的增殖，导致胚胎发育的异常和组织器官的发育畸形。P21基因作为一个调控细胞增殖周期的重要因素，日益受到重视。P21基因调控的深入细致研究或许能为预防机体的先天性畸形提供重要帮助。
参考文献
1 Shim J, Lee H, Park J, et al. A non-enzymatic P21 protein inhibitor of stress-activated protein quinces. Nature, 1996, 481(6585): 804
2 金岩，李鑫，董绍忠，等.细胞程序性死亡在颌面部细胞凝聚区形成中的作用. 实用口腔医学杂志，1999,15(1):42
3 李松，王惠云，金岩，等. Cyclin D1及P21cipl/wafl 基因在下颌骨髁状突软骨中的表达及其意义. 实用口腔医学杂志,1999；15(1):54
, http://www.100md.com
4 Helms JA, Kim CH, Hu D, et al. Sonic hedgehog participates in craniofacial morphogenesis and is down-regulated by teratogenic doses of retinoic acid. Dev Biol， 1997，187(1):25
5 Kakihara T, Fukuda, Kamishima T, et al. Resistance to apoptosis induced by serum depletion and all-trans retinoic acid in drug-resistant leukemic cell lines. Leuk Lymphoma, 1997, 26(34):369
6 Perlman H, Suzuki E, Simonson M, et al. GATA-6 induces P21(cipl) expression and G1 cell cycle arrest. J Biol Chem, 1998; 273(22): 13713
(收稿：1998-10-19), http://www.100md.com
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：腭裂；细胞周期；P21cipl/wafl基因；程序性细胞死亡
实用口腔医学杂志990122 〔摘要〕 目的：探讨腭裂形成过程中腭突间充质细胞的增殖周期的变化及其调节基因P21cipl/wafl基因表达的意义。方法：用原位杂交、TUNEL染色检测两组小鼠腭突间充质细胞增殖周期调控基因P21cipl/wafl基因的表达及细胞程序性死亡的发生。结果：在腭突发育的垂直生长期、上抬期，实验组中TUNEL阳性指数明显高于对照组(P<0.01)。同时，P21cipl/wafl基因mRNA的转录水平也比同期对照组腭突间质细胞中P21cipl/wafl基因的表达增高(P<0.05)。结论：在腭突发育时期，实验组小鼠腭突间充质未分化细胞增殖周期抑制。P21cipl/wafl基因表达升高提示可能参与了细胞增殖周期抑制过程。
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The regulation of P21cipl/wafl gene on the mesenchymal cell proliferation cycle during palatal process development in C57BL/6N strain mouse
Li Xin, Jin Yan, Dong Shaozhong, et al.
Departmental of Oral Pathology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032
〔Abstract〕 Objective: To study the cell cycle in palatal mesenchymal cells during formation of cleft palate and to observe the expression of P21cipl/wafl gene. Methods: TUNEL staining was used to detect the programmed cell death and in situ hybridization in palatal mesenchyme was applied to study the expression of P21cipl/wafl gene in the fetus mice with all trans retinoic acid induced cleft palate (experimental group) and in those with normal palate(the control).Results: TUNEL index was higher in the experimental group than in the control in vertical and raising stage of palate development(P<0.01), the level of mRNA transcription of P21cipl/wafl gene was also heiger in experimental group than in the control (P<0.05). Conclusion: Cell cycle inhibition of mesenchymal cells in palatine process may result in cleft palate and P21cipl/wafl overexpression may play an important role in the inhibition.
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Key words Ceft palate; Cell cycle; P21cipl/wafl gene; Programmed cell death
胚胎时期细胞的增殖多于细胞死亡，机体处于一个生大于死的动态平衡中，发育的个体才得已迅速成长。因此，胚胎早期，细胞的增殖及其增殖周期的调控是否正常对胚胎的发育尤其重要。近年来的研究发现众多的细胞周期负调控基因表达在细胞周期时相的变迁中起重要调节[1]。本研究采用维甲酸诱导建立的C57BL/6N近交系小鼠腭裂模型，用原位杂交方法检测了细胞周期蛋白激酶抑制物基因P21cipl/wafi基因在小鼠腭突正常发育及腭裂形成过程中的表达变化，以期了解P21cipl/wafl基因对胚胎时期腭突间充质细胞增殖周期的调控作用。
1 材料和方法
1.1实验动物及标本制备 将妊娠10d孕鼠随机分为实验组和对照组。按小鼠体重计算给药剂量，实验组小鼠管饲全反式维甲酸80mg/kg(上海第六制药厂)，溶于0.2ml植物油中。对照组管饲等体积的植物油。分布于妊娠第13d14h(略写为GD1314以下类同)、GD1322、GD148、GD1414、GD1422、GD158、GD15227个时间点脱颈处死孕鼠各1只，GD168处死孕鼠各3只，剖宫取胚鼠。体积分数为10%中性甲醛固定2h，常规组织处理后，仔细切除躯干部，小鼠喙部朝下，常规石蜡包埋。5μm连续切片，68℃烤箱烘干。168的标本切片先做HE染色。
, 百拇医药
1.2TUNEL染色方法 见文献[2]。
1.3原位杂交染色方法 见文献[3]。
1.4TUNEL阳性细胞及P21阳性表达细胞指数 TUNEL阳性信号为细胞核蓝色着色。P21原位杂交阳性信号为胞浆的蓝色颗粒。按腭突垂直生长期(GD1314～GD148)、上抬期(GD1414～GD158)、融合期(GD1522～GD168)，用网格(10×10〕测试法，每例计数4个高倍镜视野(40×〕腭突中间充质细胞总数以及阳性细胞数，每个时间点选2例标本。由此，可获得TUNEL及P21基因阳性细胞指数TI、PI。
TI＝TUNEL阳性细胞数/(阴性细胞+阳性细胞)×100%。
PI＝P21基因阳性细胞数/(阴性细胞+阳性细胞)×100%。
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1.5统计学分析 χ2 检验。
2 结 果
2.1腭裂模型的建立 实验组、对照组分别获胚鼠61只、69只。对照组GD168的20个标本中，HE染色结果观察，两侧腭突之间已经牢固结合。而实验组GD168的17个标本中两侧腭突之间均未互相融合，口腔、鼻腔仍相通。2.2阳性细胞率的比较 按腭突垂直生长期,上抬期,接触融合期分别观察，并对每个发育时期中的两组阳性细胞指数进行比较分析。PCD阳性细胞计数及分布观察：腭突发育至垂直生长期和水平上抬期实验组中阳性细胞数量明显多于对照组(P<0.01)(图1、2)。在垂直生长期阳性细胞集中于腭突的顶端，至上抬期水平向腭突的下1/3处见散在的阳性细胞分布。至接触融合期两组中PCD阳性细胞数量无明显差异(P>0.05)。P21阳性细胞数量及分布观察：在腭突垂直生长期及上抬期，实验组腭间充质中P21mRNA的转录水平明显高于对照组(P<0.01)，阳性细胞多见于腭突顶端边缘(图3、4)。腭突发育至接触融合期，实验组中P21基因表达水平也高于对照组(P<0.05)，阳性细胞散在分布于腭突间质中。如表1所示。
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图1 实验组GD1322，腭突垂直生长、PCD阳性细胞多并集中于腭突顶端及边缘
图2 对照组GD1322，垂直生长的腭突中PCD阳性细胞明显少于同期实验组，呈散在分布
图3 实验组GD1322，P21基因表达阳性细胞多于对照组，阳性细胞集中在腭突下部
图4 对照组GD1322，P21基因表达阳性细胞数减少，阳性细胞多位于腭突的舌侧缘
表1 2组小鼠腭突中P21基因阳性细胞表达指数 腭突发育时期
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n
PI
P值
实验组
对照组
垂直期
12
5%
1.6%
<0.01
上抬期
12
2.7%
, 百拇医药 0.9%
<0.01
融合期
8
3.0%
1.2%
<0.05
3 讨 论
维甲酸(RA)类物质是VitA的衍生物。它不是机体细胞分泌的小分子激素，而是来源于食物中的VitA。存在于体内的具有重要生理活性的VitA代谢产物有全反式维甲酸(ATRA)、3,4-双脱氢维甲酸等。目前研究认为，这些活性物质在生物体的胚胎发育、细胞分化及器官形成、维持正常的生理稳态起重要作用[4]。它作为化学防护及诱导分化剂已经得到大量实验证明，但其诱导细胞分化的分子生物学机理尚未完全明了。RA广泛的生理作用是以RA受体介导而实现的，其受体复合物可与特异的DNA区域结合，调节其邻近靶基因的表达。靶基因的编码产物可能是参与细胞、组织器官的结构蛋白或是参与代谢及调节的酶，也可能是调节下级基因表达的调控蛋白，发挥RA类物质的瀑布式调节功能[5]。
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P21cipl/wafl基因编码的蛋白是首先发现的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinaseinh ibitor CDI)家族成员。许多研究认为，CDI可能是通过以下3条途径实现其抑制细胞增殖功能：结合各种细胞周期蛋白依赖性激酶蛋白复合物，从而使这复合物的激酶活性丧失；抑制PCNA增殖细胞核抗原与DNA聚合酶δ形成复合物，使DNA全酶复合物不能在DNA单链上滑动干扰DNA复制；抑制应激激活蛋白激酶的活性，使C-jun基因不能发生磷酸化，AP-1不能激活，中断细胞应激状态时的信号传导系统，以上3种途径的激活都能使细胞停滞于G1期而不能进入S期，从而抑制了细胞的增殖[6]。P21基因作为细胞周期变迁的抑制剂，在细胞的增殖调控中起重要作用。本研究结果显示，对照组小鼠腭突从胚胎的GD1314～GD168，历时3d就完成两侧的融合发育过程。提示这段时期正是腭突间充质细胞大量增殖，腭突体积迅速增大的时期。而实验组孕鼠在妊娠第10d摄入大量外源性的RA后，在腭突的垂直生长、上抬期均发现间充质细胞出现超出生理范围的程序性死亡(P<0.01)，使腭突间充质中能够继续生长分化的细胞数量减少，腭突发育受阻，造成仔鼠的腭裂。同时实验组中P21基因的mRNA转录水平也明显升高(P<0.01)。提示实验组小鼠的腭突间充质细胞在短暂的腭突发育期，P21基因可能作为RA的靶基因受其诱导表达增高，其编码的蛋白与相应物质结合，干扰细胞正常的增殖周期，细胞增殖抑制。细胞停止增殖后，如果条件允许可能会进入分化，但与此时机体胚胎发育的调控系统相悖，故多数细胞进入程序性死亡以顺应外界的环境变化。其结果导致腭突发育迟缓，在腭突发育末期即妊娠16d，两侧腭突体积发育小不能相互接触融合而造成腭裂。
, 百拇医药
细胞增殖是胚胎发育、器官形成的重要基础。胚胎早期是未分化间充质细胞大量增殖时期。此时任何干扰细胞增殖周期的外界因素都能影响细胞的增殖，导致胚胎发育的异常和组织器官的发育畸形。P21基因作为一个调控细胞增殖周期的重要因素，日益受到重视。P21基因调控的深入细致研究或许能为预防机体的先天性畸形提供重要帮助。
参考文献
1 Shim J, Lee H, Park J, et al. A non-enzymatic P21 protein inhibitor of stress-activated protein quinces. Nature, 1996, 481(6585): 804
2 金岩，李鑫，董绍忠，等.细胞程序性死亡在颌面部细胞凝聚区形成中的作用. 实用口腔医学杂志，1999,15(1):42
3 李松，王惠云，金岩，等. Cyclin D1及P21cipl/wafl 基因在下颌骨髁状突软骨中的表达及其意义. 实用口腔医学杂志,1999；15(1):54
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4 Helms JA, Kim CH, Hu D, et al. Sonic hedgehog participates in craniofacial morphogenesis and is down-regulated by teratogenic doses of retinoic acid. Dev Biol， 1997，187(1):25
5 Kakihara T, Fukuda, Kamishima T, et al. Resistance to apoptosis induced by serum depletion and all-trans retinoic acid in drug-resistant leukemic cell lines. Leuk Lymphoma, 1997, 26(34):369
6 Perlman H, Suzuki E, Simonson M, et al. GATA-6 induces P21(cipl) expression and G1 cell cycle arrest. J Biol Chem, 1998; 273(22): 13713
(收稿：1998-10-19), http://www.100md.com