维甲酸处理未分化间充质细胞后细胞增殖与凋亡的变化
作者：吕红兵 金 岩 董绍忠 李 媛 赵 宇
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：维甲酸；凋亡；干细胞
实用口腔医学杂志990118 〔摘要〕 目的：研究维甲酸处理未分化外胚间充质细胞后，细胞增殖和细胞凋亡的变化，探讨细胞增殖、凋亡与维甲酸之间的关系。方法：用5μmol/L维甲酸处理未分化外胚间充质细胞，绘制维甲酸处理前后细胞的生长曲线，并用TUNEL法检测细胞凋亡数量的变化。结果：维甲酸处理未分化外胚间充质细胞后，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡数量显著增加。结论：维甲酸可明显抑制未分化外胚间充质细胞的增殖，这种抑制作用可能是由于启动了细胞凋亡而引发的。
The effects of retinoic acid on the proliferation and apoptosis of undifferentiated ectomesenchymal cells derived from facial primordia of mouse fetus
, http://www.100md.com
Lu Hongbing, Jin Yan, Dong Shaozhong,et al.
Department of Oral Pathology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕 objective: To study the effects of retinoic acid(RA) on the proliferation and apoptosis of undifferentiated ectomesenchymal cells derived from facial primordia of mouse fetus.Methods: Cultured undifferentiated ectomesenchymal cells were exposed to 5 μmol/L of RA, the growth and apoptosis of the cells were examined with cell counting and TUNEL. Results: The doubling time (h) of the RA-treated and the control cells were 47.34 and 29.04 respectively, the TUNEL positive ratio(%) 39.18 and 4.76(P<0.01). Conclusion: RA induces apoptosis and therefore inhibits the proliferation of undifferentiated ectomesenchymal cells.
, 百拇医药
Key words Tretinoin; Apoptosis; Stem cells
如果在鼠胚面突发育的早期给予维甲酸(retinoic acid,RA)，则会诱导胚鼠形成面部畸形，如唇裂、腭裂等[1]。在腭裂形成的实验中，我们已观察到RA处理妊娠12d的孕鼠后，胎鼠的腭突细胞生长受到抑制，所形成的腭突体积比正常的小，以致两侧的腭突不能发生融合，形成腭裂[2]。究竟是何种原因引起细胞生长抑制呢？
维生素A代谢产物RA在胚胎发育、细胞分化和成熟过程中均有重要的作用，现已发现RA胞内核受体(RAR和RXR)和相应配体RA结合后，可与靶基因特定的DNA序列结合，在AF-1和AF-2协同下激活靶基因mRNA转录，发挥其治疗作用[3]。全反式维甲酸诱导分化急性早幼粒细胞白血病(ALP)过程中，肿瘤细胞出现凋亡。
RA对细胞凋亡的诱导作用大多是从肿瘤细胞的研究中得出的，RA对于正常发育的胚胎细胞有没有这种作用呢？RA对正常的胚胎细胞的增殖抑制原因是什么还不清楚。为了明确RA对未分化间充质细胞增殖与凋亡的影响，我们用RA处理未分化外胚间充质细胞，并对处理前后细胞的增殖与凋亡进行了研究。
, http://www.100md.com
1 材料方法
1.1未分化外胚间充质细胞的培养及RA诱导
将妊娠12d的孕鼠脱颈处死，取胎鼠面突，2.5g/L胰酶消化上皮，分离上皮于间充质，用组织块法对上皮层下的外胚间充质细胞进行原代培养，培养液为DMEM培养基(低糖)(GIBCO,1kg/L)，补加200ml/L胎牛血清，106U/LLIF(白细胞分化抑制剂Esgro)，加适量青霉素和链霉素，使二者终浓度均为105U/L。传至第5代时用于实验。每次将RA现加入培养液中，终浓度分别为5μmol/L，对照组中加入等量的无水乙醇溶剂。每48h换1次培养液(内含等量的RA或无水乙醇)。
1.2RA处理未分化外胚间充质细胞后生长曲线的绘制
收集对数生长期细胞，并调整细胞浓度，接种于24孔培养板(细胞数3×104个/孔)，每次收集RA处理组和对照组各3孔，计数后取平均值，绘制细胞生长曲线，比较两组细胞的倍增时间。
, 百拇医药
1.3TUNEL法检测RA处理后的细胞凋亡
用细胞离心机分别收集处理组和对照组的细胞，TUNEL法见参考文献[4]。
1.4统计分析
RA处理组和对照组分别选取3个不同的视野，计算阳性细胞的百分数，然后进行χ2检验。
2 结 果
2.1RA处理后未分化外胚间充质细胞生长曲线的变化
图1显示RA处理后，未分化外胚间充质细胞生长受到抑制，其抑制作用始于处理后2d。计算两组的倍增时间可得知，正常组的倍增时间为29.04h，而RA处理组为47.34h。
, 百拇医药
图1 RA处理未分化外胚间充质细胞后生长曲线的变化
2.2RA处理后未分化外胚间充质细胞后细胞凋亡数量的变化
阳性信号为紫蓝色颗粒，主要位于胞核内。RA处理未分化外胚间充质细胞后，胞核阳性的细胞凋亡数量明显增加(图2、3)。正常组阳性细胞数占4.76%，而RA处理组则上升至39.18%。χ2检验结果，2组之间有显著性差异(P<0.01)。
图2正常的未分化间充质细胞中，图3RA处理后，阳性细胞数
阳性细胞数目较少。TUNEL×200 目显著增多。TUNEL×200
, 百拇医药
3 讨 论
机体内细胞数目是细胞增殖和细胞死亡动态平衡的结果。细胞死亡可分为细胞坏死和细胞凋亡两种。凋亡对后生动物门动物的发育、自身稳定起中心作用，是细胞数目精细调节的一个主要机理，可清除不需要的、已严重受损的、有潜在危险性的细胞[4]。但目前越来越多的研究表明，凋亡除了在肿瘤发生中起作用外，在胚胎的正常发育中也发现有凋亡细胞的存在，从而提示了凋亡在生物体内作用的广泛性。
维甲酸可以在基因转录及转录后两个水平起调节作用，但目前不清楚直接受活化RAR或RXR调节与细胞增殖分化密切相关的基因有哪些。RA现在常用来治疗急性早幼粒细胞性白血病，但RA同时也是一种致畸药因子。动物实验中已发现RA可诱导腭裂的发生，但RA的致畸机理一直不清楚。经过多年对凋亡的研究，有人将诱导凋亡的介导物分为3类：第一是激素及生长因子；第二是免疫细胞如杀伤细胞可直接介导杀伤细胞介导细胞凋亡；第三是某些抗癌药物(如RA)、毒素、损伤及射线、高温等。尽管RA诱导细胞凋亡早已为人们所肯定，但这些结果都直接来自于肿瘤细胞，对于正常的胚胎细胞，致畸因子RA作用后，为什么会引起细胞生长抑制，是否是由于RA诱发的细胞凋亡作用所引起的却未能得以证实。
, 百拇医药
现在已注意到凋亡和细胞周期之间的联系。有人认为凋亡和有丝分裂可能在机理上相关，这个观点的一个极端看法是凋亡可能是一种异常的有丝分裂。凋亡和有丝分裂之间相连接的一些直接证据来自在细胞增殖调节中起作用的相关基因，如P53,c-myc,Rb-1,D1,其中一些影响特异情况的凋亡[5]。
本文实验结果表明，用RA处理未分化外胚间充质细胞后，细胞的生长受到显著抑制，凋亡数目明显增加，说明凋亡对未分化外胚间充质细胞的增殖分化影响很大。RA对正常的未分化外胚间充质细胞也具有诱发凋亡的作用，这种作用的直接证据是细胞生长受抑，这也就解释了为什么RA处理孕鼠以后，胎鼠腭突中的间充质细胞增殖受到抑制，结果形成了小腭突而诱发腭裂。
由于凋亡本身独特的生物学特性，人们一直希望通过诱发细胞凋亡来治疗肿瘤。用RA诱导细胞凋亡的作用来治疗ALP就是一个比较成功的例子。与肿瘤治疗不同，RA对正常细胞所诱发的凋亡却很可能导致细胞正常功能的丧失。因此如何阻止RA作用后正常细胞凋亡的发生，对治疗RA所诱发的畸形将提供重要的理论依据。
, 百拇医药
参考文献
1 Moore GE. Molecular genetic approach to the study of craniofacial dysmorphologies. Int Rev Cytol, 1995, 158:215
2 吕红兵，金岩. BMP2,3,4,5异常表达及凋亡在腭裂形成中的基因调控.第三届青年学术年会论文集，生命科学和生物技术. 北京：中国科技出版社，1998.282
3 糜漫天，张乾勇，朱俊，等. 视黄酸诱导细胞分化分子机制的研究进展. 国外医学分子生物学分册，1998,20(1):17
4 金岩，李鑫，董绍忠，等. 细胞程序性死亡在颌面部细胞凝聚区形成中的作用. 实用口腔医学杂志，1999,15(1):42
5 Rubin LL, Gatchalian CL, Rimon G, et al. The molecular mechanisms of neuronal apoptosis. Curr Opin Neurobiol, 1994,4(5): 696
(收稿：1998-10-19), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：维甲酸；凋亡；干细胞
实用口腔医学杂志990118 〔摘要〕 目的：研究维甲酸处理未分化外胚间充质细胞后，细胞增殖和细胞凋亡的变化，探讨细胞增殖、凋亡与维甲酸之间的关系。方法：用5μmol/L维甲酸处理未分化外胚间充质细胞，绘制维甲酸处理前后细胞的生长曲线，并用TUNEL法检测细胞凋亡数量的变化。结果：维甲酸处理未分化外胚间充质细胞后，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡数量显著增加。结论：维甲酸可明显抑制未分化外胚间充质细胞的增殖，这种抑制作用可能是由于启动了细胞凋亡而引发的。
The effects of retinoic acid on the proliferation and apoptosis of undifferentiated ectomesenchymal cells derived from facial primordia of mouse fetus
, http://www.100md.com
Lu Hongbing, Jin Yan, Dong Shaozhong,et al.
Department of Oral Pathology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕 objective: To study the effects of retinoic acid(RA) on the proliferation and apoptosis of undifferentiated ectomesenchymal cells derived from facial primordia of mouse fetus.Methods: Cultured undifferentiated ectomesenchymal cells were exposed to 5 μmol/L of RA, the growth and apoptosis of the cells were examined with cell counting and TUNEL. Results: The doubling time (h) of the RA-treated and the control cells were 47.34 and 29.04 respectively, the TUNEL positive ratio(%) 39.18 and 4.76(P<0.01). Conclusion: RA induces apoptosis and therefore inhibits the proliferation of undifferentiated ectomesenchymal cells.
, 百拇医药
Key words Tretinoin; Apoptosis; Stem cells
如果在鼠胚面突发育的早期给予维甲酸(retinoic acid,RA)，则会诱导胚鼠形成面部畸形，如唇裂、腭裂等[1]。在腭裂形成的实验中，我们已观察到RA处理妊娠12d的孕鼠后，胎鼠的腭突细胞生长受到抑制，所形成的腭突体积比正常的小，以致两侧的腭突不能发生融合，形成腭裂[2]。究竟是何种原因引起细胞生长抑制呢？
维生素A代谢产物RA在胚胎发育、细胞分化和成熟过程中均有重要的作用，现已发现RA胞内核受体(RAR和RXR)和相应配体RA结合后，可与靶基因特定的DNA序列结合，在AF-1和AF-2协同下激活靶基因mRNA转录，发挥其治疗作用[3]。全反式维甲酸诱导分化急性早幼粒细胞白血病(ALP)过程中，肿瘤细胞出现凋亡。
RA对细胞凋亡的诱导作用大多是从肿瘤细胞的研究中得出的，RA对于正常发育的胚胎细胞有没有这种作用呢？RA对正常的胚胎细胞的增殖抑制原因是什么还不清楚。为了明确RA对未分化间充质细胞增殖与凋亡的影响，我们用RA处理未分化外胚间充质细胞，并对处理前后细胞的增殖与凋亡进行了研究。
, http://www.100md.com
1 材料方法
1.1未分化外胚间充质细胞的培养及RA诱导
将妊娠12d的孕鼠脱颈处死，取胎鼠面突，2.5g/L胰酶消化上皮，分离上皮于间充质，用组织块法对上皮层下的外胚间充质细胞进行原代培养，培养液为DMEM培养基(低糖)(GIBCO,1kg/L)，补加200ml/L胎牛血清，106U/LLIF(白细胞分化抑制剂Esgro)，加适量青霉素和链霉素，使二者终浓度均为105U/L。传至第5代时用于实验。每次将RA现加入培养液中，终浓度分别为5μmol/L，对照组中加入等量的无水乙醇溶剂。每48h换1次培养液(内含等量的RA或无水乙醇)。
1.2RA处理未分化外胚间充质细胞后生长曲线的绘制
收集对数生长期细胞，并调整细胞浓度，接种于24孔培养板(细胞数3×104个/孔)，每次收集RA处理组和对照组各3孔，计数后取平均值，绘制细胞生长曲线，比较两组细胞的倍增时间。
, 百拇医药
1.3TUNEL法检测RA处理后的细胞凋亡
用细胞离心机分别收集处理组和对照组的细胞，TUNEL法见参考文献[4]。
1.4统计分析
RA处理组和对照组分别选取3个不同的视野，计算阳性细胞的百分数，然后进行χ2检验。
2 结 果
2.1RA处理后未分化外胚间充质细胞生长曲线的变化
图1显示RA处理后，未分化外胚间充质细胞生长受到抑制，其抑制作用始于处理后2d。计算两组的倍增时间可得知，正常组的倍增时间为29.04h，而RA处理组为47.34h。
, 百拇医药
图1 RA处理未分化外胚间充质细胞后生长曲线的变化
2.2RA处理后未分化外胚间充质细胞后细胞凋亡数量的变化
阳性信号为紫蓝色颗粒，主要位于胞核内。RA处理未分化外胚间充质细胞后，胞核阳性的细胞凋亡数量明显增加(图2、3)。正常组阳性细胞数占4.76%，而RA处理组则上升至39.18%。χ2检验结果，2组之间有显著性差异(P<0.01)。
图2正常的未分化间充质细胞中，图3RA处理后，阳性细胞数
阳性细胞数目较少。TUNEL×200 目显著增多。TUNEL×200
, 百拇医药
3 讨 论
机体内细胞数目是细胞增殖和细胞死亡动态平衡的结果。细胞死亡可分为细胞坏死和细胞凋亡两种。凋亡对后生动物门动物的发育、自身稳定起中心作用，是细胞数目精细调节的一个主要机理，可清除不需要的、已严重受损的、有潜在危险性的细胞[4]。但目前越来越多的研究表明，凋亡除了在肿瘤发生中起作用外，在胚胎的正常发育中也发现有凋亡细胞的存在，从而提示了凋亡在生物体内作用的广泛性。
维甲酸可以在基因转录及转录后两个水平起调节作用，但目前不清楚直接受活化RAR或RXR调节与细胞增殖分化密切相关的基因有哪些。RA现在常用来治疗急性早幼粒细胞性白血病，但RA同时也是一种致畸药因子。动物实验中已发现RA可诱导腭裂的发生，但RA的致畸机理一直不清楚。经过多年对凋亡的研究，有人将诱导凋亡的介导物分为3类：第一是激素及生长因子；第二是免疫细胞如杀伤细胞可直接介导杀伤细胞介导细胞凋亡；第三是某些抗癌药物(如RA)、毒素、损伤及射线、高温等。尽管RA诱导细胞凋亡早已为人们所肯定，但这些结果都直接来自于肿瘤细胞，对于正常的胚胎细胞，致畸因子RA作用后，为什么会引起细胞生长抑制，是否是由于RA诱发的细胞凋亡作用所引起的却未能得以证实。
, 百拇医药
现在已注意到凋亡和细胞周期之间的联系。有人认为凋亡和有丝分裂可能在机理上相关，这个观点的一个极端看法是凋亡可能是一种异常的有丝分裂。凋亡和有丝分裂之间相连接的一些直接证据来自在细胞增殖调节中起作用的相关基因，如P53,c-myc,Rb-1,D1,其中一些影响特异情况的凋亡[5]。
本文实验结果表明，用RA处理未分化外胚间充质细胞后，细胞的生长受到显著抑制，凋亡数目明显增加，说明凋亡对未分化外胚间充质细胞的增殖分化影响很大。RA对正常的未分化外胚间充质细胞也具有诱发凋亡的作用，这种作用的直接证据是细胞生长受抑，这也就解释了为什么RA处理孕鼠以后，胎鼠腭突中的间充质细胞增殖受到抑制，结果形成了小腭突而诱发腭裂。
由于凋亡本身独特的生物学特性，人们一直希望通过诱发细胞凋亡来治疗肿瘤。用RA诱导细胞凋亡的作用来治疗ALP就是一个比较成功的例子。与肿瘤治疗不同，RA对正常细胞所诱发的凋亡却很可能导致细胞正常功能的丧失。因此如何阻止RA作用后正常细胞凋亡的发生，对治疗RA所诱发的畸形将提供重要的理论依据。
, 百拇医药
参考文献
1 Moore GE. Molecular genetic approach to the study of craniofacial dysmorphologies. Int Rev Cytol, 1995, 158:215
2 吕红兵，金岩. BMP2,3,4,5异常表达及凋亡在腭裂形成中的基因调控.第三届青年学术年会论文集，生命科学和生物技术. 北京：中国科技出版社，1998.282
3 糜漫天，张乾勇，朱俊，等. 视黄酸诱导细胞分化分子机制的研究进展. 国外医学分子生物学分册，1998,20(1):17
4 金岩，李鑫，董绍忠，等. 细胞程序性死亡在颌面部细胞凝聚区形成中的作用. 实用口腔医学杂志，1999,15(1):42
5 Rubin LL, Gatchalian CL, Rimon G, et al. The molecular mechanisms of neuronal apoptosis. Curr Opin Neurobiol, 1994,4(5): 696
(收稿：1998-10-19), 百拇医药