细胞程序性死亡在颌面部细胞凝聚区形成中的作用
作者：金 岩 李 鑫 董绍忠 吕红兵 杨连甲 李 媛 朱萧玲 赵 宇
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：细胞程序性死亡；干细胞；颌；面部；胚胎
实用口腔医学杂志990116 〔摘要〕 目的：观察和分析细胞程序性死亡(PCD)在细胞凝聚区形成中的作用和意义。方法：建立和制备C57BL/6N系小鼠胚胎期13、14、15、16d和生后10d等多时间点的颌面部发育模型，采用原位末端转移酶标记法标记颌面部组织的PCD细胞。结果：在颌面部骨、牙齿等多种组织器官形成初期都包括间充质细胞的聚集，并出现特定的细胞凝聚区。随着细胞凝聚的出现，PCD的数量和密度增多。当凝聚区内的细胞向特定细胞系表型转化时，PCD数量下降。结论：PCD在颌面部凝聚区的形成中发挥着重要的作用，可控制其中的细胞数量和质量并有利于凝聚区的塑形。
, http://www.100md.com The effects of programmed cell death on the formation of cellular condensation in maxillofacial development
Jin Yan, Li Xin, Dong Shaozhong, et al.
Department of Oral Pathology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032
〔Abstract〕 Objective: To observe and analyse the role and effects of programmed cell death (PCD) in the formation of cellular condensation in maxillofacial development. Method: The model of maxillofacial developent of C57BL/6N mouse was established and the series samples of 13, 14, 15 and 16 days of gestation and that of 10 days after birth were processed. PCD was labelled by using TdT-mediated-dUTP nick end labeling (TUNEL). Results: It was observed that condensation was involved in the development of bone, tooth and other tissues in maxillofacial region. The amount of PCD-positive cells increased after the cell aggregation initialed, in contrast, the number of PCD-positive cell decreased when the cells in condensation were undergoing specialized differentiation. Conclusion: PCD is a critical factor in the formation of cellular condensation and PCD contributes in both controlling of the quality and quantity of cells in the condensation and the remoudling of the condensation.
, 百拇医药
Key words Programmed cell death; Stem cells; Jaw; Face; Embryo
目前认为，几乎所有器官的早期形态发生都包括间充质细胞的凝聚和上皮层外形的变化，间充质细胞的凝聚(condensation)是形态发生的关键。如特定骨骼的发生发育取决于该部位凝聚区的形成，成骨性凝聚区的缺陷导致了骨的形态异常[1]。凝聚区的形成过程包括胚胎干细胞的一系列活动，其最终的形成受到多种因素的调控。细胞程序性死亡(programmed cell death，简称PCD)是机体在正常生理状况下的一种细胞死亡，是一种与有丝分裂功能相反的调节细胞群体的方式，PCD在机体发育中发挥着重要的作用。但是，目前对于PCD在细胞凝聚区形成中的作用所知甚少，因此本研究的目的旨在观察和分析PCD在颌面部组织形态发生中在凝聚区形成过程中的作用和意义。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1颌面部组织发育组织的标本制备 取12周龄，体重25g以上的C57BL/6N系小鼠共21只。雌、雄比例为2∶1，前一天晚8:00雌雄小鼠同笼。次日晨观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0d(gestation day0，简称GD0)，隔离饲养。分别于妊娠GD13d14h(GD1314，下同)、148、1424、158、1522、168、生后10d共7个时间点各脱颈处死小鼠2只，剖腹取胚鼠。将胚鼠头部与体部于颈部切断后立即将头部置于体积分数为10%中性甲醛固定。经系列常规组织处理后将头部喙部朝下，石蜡包埋，5μm切片，拷干，切片部分进行常规苏木精伊红染色，部分进行PCD的标记染色。主要对于颌面部发育组织中的骨、牙齿、腺体、舌等组织进行观察分析。
1.2PCD细胞的标记 采用原位末端转移酶标记法(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，简称TUNEL)标记PCD细胞(ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit试剂盒，简称ApopTag试剂盒，美国Oncor公司产品)。切片常规脱蜡，至蒸馏水，蛋白酶K20mg/L处理15min后加50μl平衡液(ApopTag试剂盒)1min。用含TDT酶反应液的复合液(ApopTag试剂盒)10μl进一步处理30min，A液(0.1mol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl)中漂洗15min，2次。正常血清孵育后加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体，湿盒内37℃2h。切片于A液和B液(0.1mol/LTris-HCl,0.1mol/LNaCl,0.05mol/LMgCl2)中分别振荡漂洗后，加新鲜配置的显色液(NBT/BCIP显色系统)暗处显色，4h后中止反应。用伊红衬染胞浆，梯度酒精脱水后透明封片。
, 百拇医药
2 结 果
组织学观察显示了颌面部组织器官的发育过程，颌面部骨、关节、牙齿、肌肉(包括舌)等有形组织器官的形成初期都包括间充质细胞或胚胎干细胞的一系列活动，并出现特定的细胞凝聚区。最早出现的凝聚区在下颌突，为下颌骨的始基(图1)，GD13d时可见下颌突内未来下颌骨位置的间充质细胞聚集、增殖，并形成一定的形态。采用原位末端转移酶标记法标记PCD细胞，结果显示，在颌面部发育的自始至终都有PCD的出现。GD13d，上、下颌突的发育速度加快，突起内的外胚间充质细胞数量增多，除下颌突内形成凝聚区外，大部分区域细胞的分布仍较均匀，形态一致或相似，其中PCD的数量较少(图2)；而此时下颌凝聚区内的PCD数量明显增多(图3)，并持续到骨的生长。在GD15d时，上颌突内也出现凝聚区，可见PCD阳性标记细胞在凝聚区内的密度要高于凝聚区外(图4)。结果显示，在颌骨形成的部位，早期的凝聚区可见数量较多的PCD，而随着凝聚区内细胞向成骨细胞分化，PCD数量渐下降，至骨组织出现时，PCD只保持较低的数量。
, 百拇医药
颌面部肌肉的形成方式也表现为，在肌肉形成部位细胞增多、聚集，此时PCD数量较多，随之出现细胞分化为幼稚的成肌细胞，细胞形态发生变化，PCD数量减少(图5)，待出现明确的肌纤维时，PCD数量明显减少(图6)。
图1 GD13d，下颌突未来下颌骨位置
出现细胞凝聚区(箭头示)，H-E,×10
图2 GD13d，上颌突内均匀分布的间充质细胞中见
少量PCD阳性细胞(箭头示)，TUNEL染色，×40
, 百拇医药
图3 GD13d，下颌突内凝聚区中见较多的PCD
阳性细胞(箭头示)，TUNEL染色，×40
图4 GD15d，示上颌突内凝聚区PCD阳性标
记细胞(箭头示)，TUNEL染色，×40
图5 GD15d，示幼稚的成肌细胞和间充质细胞
中的PCD阳性着色(箭头示)，TUNEL染色，×40
图6 生后10d，示上颌分化成熟的肌纤维中只有
, 百拇医药
少量PCD细胞(箭头示)，TUNEL染色，×40
3 讨 论
目前，对于与骨的形态发生相关的细胞凝聚区的研究最为活跃，发现细胞凝聚区的形态及大小达不到正常可以出现：(1)成骨及成软骨延迟并导致形态变小；(2)邻近的凝聚区未能分隔或发生融合而导致骨骼形态异常；(3)邻近的凝聚区未能正常融合而导致骨缺陷；(4)凝聚区未达到最小的域值而造成骨或软骨的完全缺失。间充质细胞凝聚区启动其中细胞的分化，与骨骼形态发生有关的凝聚区细胞可以分化为成软骨或成骨细胞，是骨骼发育的关键，很多影响骨骼发育的基因表达异常可能出现在外胚间充质细胞凝聚形成凝聚区的过程[2]。Storm等人[1]首次发现了有骨骼发育畸形的短足小鼠和短耳小鼠中有与BMPs有关的基因突变和表达异常，这两种骨骼发育畸形都有明显的凝聚区的变化。在颅颌面部，凝聚区细胞来源于神经嵴细胞，这些神经嵴细胞在移行至特定区域后与原有的中胚层构成外胚间充质，在邻近的胚胎性上皮作用下，外胚间充质细胞发生移行、识别、聚集和增生，进而形成凝聚区[3,4]。颌面部由骨、关节、牙齿、肌肉(包括舌)等多种有形组织器官构成，实验结果显示，这些组织器官的形成初期都包括间充质细胞的一系列活动，并出现特定的细胞凝聚区。我们认为，由这些外胚间充质细胞构成的细胞凝聚区的大小、形态等方面，可能决定颌面部骨、关节、牙齿等组织器官发育的未来，因而也可能是腭裂等发育畸形形成的关键。
, 百拇医药
细胞程序性死亡也称凋亡(apoptosis)，PCD的紊乱与肿瘤的发生有着直接的关系，近期的研究显示PCD在整个生物的进化和胚胎发育中也起着主要的作用[5]。对PCD在胚胎发育中的作用形式的认识将会加深对发育中组织器官的形态发生以及畸形的深入了解。本文结果显示在颌面部发育的自始至终都有PCD的出现，PCD的出现是伴随着胚胎发育的普遍的现象。这正说明了PCD在胚胎发育中的重要作用。在颌面部组织发育中，随着特定组织器官的形成，相应的胚胎干细胞(如外胚间充质细胞)在相应部位凝聚，随着细胞凝聚的出现，PCD的数量和密度增多。当凝聚区内的细胞向特定细胞系表型转化时，PCD数量下降。PCD在颌面部凝聚区的形成中发挥着重要的作用，可控制其中的细胞数量和质量并有利于凝聚区的塑形。我们认为，PCD在发育中的作用主要为：(1)塑形；(2)去除不需要的结构；(3)细胞数量控制；(4)细胞质量控制等。
PCD受到多种因素的调控，其中bcl-2、fas、c-myc、转化生长因子β(transforming growth factor β，TGFβ)等因子是重要的调控因素。目前认为生长因子对于凝聚区的影响最应受到重视。近期的研究发现，骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)不仅可以诱导未分化间充质细胞分化为成骨细胞，也是骨骼发育前期凝聚区中未分化细胞的潜在凋亡信号，BMP可以调控其中的细胞增殖和分化的数量[6]。已有大量实验证实，包括BMP的TGF-β超家族成员在多种组织的生长发育及愈合中发挥着诱导和调控的作用。BMP的骨诱导是通过诱导未分化间充质细胞分化成软骨和成骨细胞来完成的，是骨生成的启动因子。在对肢体骨骼发育的观察中，Kingsley[2]发现了BMP-2,-4,-5在决定未来骨骼的形成和基本外形的细胞凝聚区的表达，推测BMPs在诱导局部间充质细胞形成凝聚区以及凝聚区细胞进一步分化为软骨和骨发挥着重要的作用。他们认为，BMPs在细胞凝聚区合成及分布的基因变化，或者BMPs激活的分子信号接受途径，决定骨骼发育的结局。
, 百拇医药
综上所述，细胞凝聚区是颌面部多种组织器官正常发育生长的前提，而PCD在保证凝聚区的正常发育中发挥着重要的作用。
参考文献
1 Storm EE, Huynh TV, Copeland NG, et al. Limbalterationsin brachypodism mice due to mutations in a new member of the TGFβ-superfamily. Nature, 1994, 368: 639
2 Kingsley DM. What do BMPs do in mammals? Clues from the mouse short-ear mutation. Trends Genet， 1994, 10:16
3 Antoniades K, Economou L, Sioga A, et al. Pathogenesis of bromodeoxyuridine-induced cleft palate in mice. J Cranio Maxillo-facial Surgery ， 1995, 23:252
, 百拇医药
4 Moore GE. Molecular genetic approaches to the study of human cranio- facial dysmorphologies. Int Rev Cytol, 1995, 158:215
5 Nagata S. Apoptosis by death factor. Cell ，1997, 88:355
6 Macias D, Ganan Y, Sampath TK, et al. Role of BMP-2 and OP-1 (BMP-7) in programmed cell death and skeletogenesis during chick limb development. Development, 1997, 124:1109
(收稿：1998-10-19), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：细胞程序性死亡；干细胞；颌；面部；胚胎
实用口腔医学杂志990116 〔摘要〕 目的：观察和分析细胞程序性死亡(PCD)在细胞凝聚区形成中的作用和意义。方法：建立和制备C57BL/6N系小鼠胚胎期13、14、15、16d和生后10d等多时间点的颌面部发育模型，采用原位末端转移酶标记法标记颌面部组织的PCD细胞。结果：在颌面部骨、牙齿等多种组织器官形成初期都包括间充质细胞的聚集，并出现特定的细胞凝聚区。随着细胞凝聚的出现，PCD的数量和密度增多。当凝聚区内的细胞向特定细胞系表型转化时，PCD数量下降。结论：PCD在颌面部凝聚区的形成中发挥着重要的作用，可控制其中的细胞数量和质量并有利于凝聚区的塑形。
, http://www.100md.com The effects of programmed cell death on the formation of cellular condensation in maxillofacial development
Jin Yan, Li Xin, Dong Shaozhong, et al.
Department of Oral Pathology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710032
〔Abstract〕 Objective: To observe and analyse the role and effects of programmed cell death (PCD) in the formation of cellular condensation in maxillofacial development. Method: The model of maxillofacial developent of C57BL/6N mouse was established and the series samples of 13, 14, 15 and 16 days of gestation and that of 10 days after birth were processed. PCD was labelled by using TdT-mediated-dUTP nick end labeling (TUNEL). Results: It was observed that condensation was involved in the development of bone, tooth and other tissues in maxillofacial region. The amount of PCD-positive cells increased after the cell aggregation initialed, in contrast, the number of PCD-positive cell decreased when the cells in condensation were undergoing specialized differentiation. Conclusion: PCD is a critical factor in the formation of cellular condensation and PCD contributes in both controlling of the quality and quantity of cells in the condensation and the remoudling of the condensation.
, 百拇医药
Key words Programmed cell death; Stem cells; Jaw; Face; Embryo
目前认为，几乎所有器官的早期形态发生都包括间充质细胞的凝聚和上皮层外形的变化，间充质细胞的凝聚(condensation)是形态发生的关键。如特定骨骼的发生发育取决于该部位凝聚区的形成，成骨性凝聚区的缺陷导致了骨的形态异常[1]。凝聚区的形成过程包括胚胎干细胞的一系列活动，其最终的形成受到多种因素的调控。细胞程序性死亡(programmed cell death，简称PCD)是机体在正常生理状况下的一种细胞死亡，是一种与有丝分裂功能相反的调节细胞群体的方式，PCD在机体发育中发挥着重要的作用。但是，目前对于PCD在细胞凝聚区形成中的作用所知甚少，因此本研究的目的旨在观察和分析PCD在颌面部组织形态发生中在凝聚区形成过程中的作用和意义。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1颌面部组织发育组织的标本制备 取12周龄，体重25g以上的C57BL/6N系小鼠共21只。雌、雄比例为2∶1，前一天晚8:00雌雄小鼠同笼。次日晨观察雌鼠阴栓情况，有阴栓者为妊娠0d(gestation day0，简称GD0)，隔离饲养。分别于妊娠GD13d14h(GD1314，下同)、148、1424、158、1522、168、生后10d共7个时间点各脱颈处死小鼠2只，剖腹取胚鼠。将胚鼠头部与体部于颈部切断后立即将头部置于体积分数为10%中性甲醛固定。经系列常规组织处理后将头部喙部朝下，石蜡包埋，5μm切片，拷干，切片部分进行常规苏木精伊红染色，部分进行PCD的标记染色。主要对于颌面部发育组织中的骨、牙齿、腺体、舌等组织进行观察分析。
1.2PCD细胞的标记 采用原位末端转移酶标记法(TdT-mediated-dUTP nick end labeling，简称TUNEL)标记PCD细胞(ApopTag Plus In Situ Apoptosis Detection Kit试剂盒，简称ApopTag试剂盒，美国Oncor公司产品)。切片常规脱蜡，至蒸馏水，蛋白酶K20mg/L处理15min后加50μl平衡液(ApopTag试剂盒)1min。用含TDT酶反应液的复合液(ApopTag试剂盒)10μl进一步处理30min，A液(0.1mol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl)中漂洗15min，2次。正常血清孵育后加标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体，湿盒内37℃2h。切片于A液和B液(0.1mol/LTris-HCl,0.1mol/LNaCl,0.05mol/LMgCl2)中分别振荡漂洗后，加新鲜配置的显色液(NBT/BCIP显色系统)暗处显色，4h后中止反应。用伊红衬染胞浆，梯度酒精脱水后透明封片。
, 百拇医药
2 结 果
组织学观察显示了颌面部组织器官的发育过程，颌面部骨、关节、牙齿、肌肉(包括舌)等有形组织器官的形成初期都包括间充质细胞或胚胎干细胞的一系列活动，并出现特定的细胞凝聚区。最早出现的凝聚区在下颌突，为下颌骨的始基(图1)，GD13d时可见下颌突内未来下颌骨位置的间充质细胞聚集、增殖，并形成一定的形态。采用原位末端转移酶标记法标记PCD细胞，结果显示，在颌面部发育的自始至终都有PCD的出现。GD13d，上、下颌突的发育速度加快，突起内的外胚间充质细胞数量增多，除下颌突内形成凝聚区外，大部分区域细胞的分布仍较均匀，形态一致或相似，其中PCD的数量较少(图2)；而此时下颌凝聚区内的PCD数量明显增多(图3)，并持续到骨的生长。在GD15d时，上颌突内也出现凝聚区，可见PCD阳性标记细胞在凝聚区内的密度要高于凝聚区外(图4)。结果显示，在颌骨形成的部位，早期的凝聚区可见数量较多的PCD，而随着凝聚区内细胞向成骨细胞分化，PCD数量渐下降，至骨组织出现时，PCD只保持较低的数量。
, 百拇医药
颌面部肌肉的形成方式也表现为，在肌肉形成部位细胞增多、聚集，此时PCD数量较多，随之出现细胞分化为幼稚的成肌细胞，细胞形态发生变化，PCD数量减少(图5)，待出现明确的肌纤维时，PCD数量明显减少(图6)。
图1 GD13d，下颌突未来下颌骨位置
出现细胞凝聚区(箭头示)，H-E,×10
图2 GD13d，上颌突内均匀分布的间充质细胞中见
少量PCD阳性细胞(箭头示)，TUNEL染色，×40
, 百拇医药
图3 GD13d，下颌突内凝聚区中见较多的PCD
阳性细胞(箭头示)，TUNEL染色，×40
图4 GD15d，示上颌突内凝聚区PCD阳性标
记细胞(箭头示)，TUNEL染色，×40
图5 GD15d，示幼稚的成肌细胞和间充质细胞
中的PCD阳性着色(箭头示)，TUNEL染色，×40
图6 生后10d，示上颌分化成熟的肌纤维中只有
, 百拇医药
少量PCD细胞(箭头示)，TUNEL染色，×40
3 讨 论
目前，对于与骨的形态发生相关的细胞凝聚区的研究最为活跃，发现细胞凝聚区的形态及大小达不到正常可以出现：(1)成骨及成软骨延迟并导致形态变小；(2)邻近的凝聚区未能分隔或发生融合而导致骨骼形态异常；(3)邻近的凝聚区未能正常融合而导致骨缺陷；(4)凝聚区未达到最小的域值而造成骨或软骨的完全缺失。间充质细胞凝聚区启动其中细胞的分化，与骨骼形态发生有关的凝聚区细胞可以分化为成软骨或成骨细胞，是骨骼发育的关键，很多影响骨骼发育的基因表达异常可能出现在外胚间充质细胞凝聚形成凝聚区的过程[2]。Storm等人[1]首次发现了有骨骼发育畸形的短足小鼠和短耳小鼠中有与BMPs有关的基因突变和表达异常，这两种骨骼发育畸形都有明显的凝聚区的变化。在颅颌面部，凝聚区细胞来源于神经嵴细胞，这些神经嵴细胞在移行至特定区域后与原有的中胚层构成外胚间充质，在邻近的胚胎性上皮作用下，外胚间充质细胞发生移行、识别、聚集和增生，进而形成凝聚区[3,4]。颌面部由骨、关节、牙齿、肌肉(包括舌)等多种有形组织器官构成，实验结果显示，这些组织器官的形成初期都包括间充质细胞的一系列活动，并出现特定的细胞凝聚区。我们认为，由这些外胚间充质细胞构成的细胞凝聚区的大小、形态等方面，可能决定颌面部骨、关节、牙齿等组织器官发育的未来，因而也可能是腭裂等发育畸形形成的关键。
, 百拇医药
细胞程序性死亡也称凋亡(apoptosis)，PCD的紊乱与肿瘤的发生有着直接的关系，近期的研究显示PCD在整个生物的进化和胚胎发育中也起着主要的作用[5]。对PCD在胚胎发育中的作用形式的认识将会加深对发育中组织器官的形态发生以及畸形的深入了解。本文结果显示在颌面部发育的自始至终都有PCD的出现，PCD的出现是伴随着胚胎发育的普遍的现象。这正说明了PCD在胚胎发育中的重要作用。在颌面部组织发育中，随着特定组织器官的形成，相应的胚胎干细胞(如外胚间充质细胞)在相应部位凝聚，随着细胞凝聚的出现，PCD的数量和密度增多。当凝聚区内的细胞向特定细胞系表型转化时，PCD数量下降。PCD在颌面部凝聚区的形成中发挥着重要的作用，可控制其中的细胞数量和质量并有利于凝聚区的塑形。我们认为，PCD在发育中的作用主要为：(1)塑形；(2)去除不需要的结构；(3)细胞数量控制；(4)细胞质量控制等。
PCD受到多种因素的调控，其中bcl-2、fas、c-myc、转化生长因子β(transforming growth factor β，TGFβ)等因子是重要的调控因素。目前认为生长因子对于凝聚区的影响最应受到重视。近期的研究发现，骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)不仅可以诱导未分化间充质细胞分化为成骨细胞，也是骨骼发育前期凝聚区中未分化细胞的潜在凋亡信号，BMP可以调控其中的细胞增殖和分化的数量[6]。已有大量实验证实，包括BMP的TGF-β超家族成员在多种组织的生长发育及愈合中发挥着诱导和调控的作用。BMP的骨诱导是通过诱导未分化间充质细胞分化成软骨和成骨细胞来完成的，是骨生成的启动因子。在对肢体骨骼发育的观察中，Kingsley[2]发现了BMP-2,-4,-5在决定未来骨骼的形成和基本外形的细胞凝聚区的表达，推测BMPs在诱导局部间充质细胞形成凝聚区以及凝聚区细胞进一步分化为软骨和骨发挥着重要的作用。他们认为，BMPs在细胞凝聚区合成及分布的基因变化，或者BMPs激活的分子信号接受途径，决定骨骼发育的结局。
, 百拇医药
综上所述，细胞凝聚区是颌面部多种组织器官正常发育生长的前提，而PCD在保证凝聚区的正常发育中发挥着重要的作用。
参考文献
1 Storm EE, Huynh TV, Copeland NG, et al. Limbalterationsin brachypodism mice due to mutations in a new member of the TGFβ-superfamily. Nature, 1994, 368: 639
2 Kingsley DM. What do BMPs do in mammals? Clues from the mouse short-ear mutation. Trends Genet， 1994, 10:16
3 Antoniades K, Economou L, Sioga A, et al. Pathogenesis of bromodeoxyuridine-induced cleft palate in mice. J Cranio Maxillo-facial Surgery ， 1995, 23:252
, 百拇医药
4 Moore GE. Molecular genetic approaches to the study of human cranio- facial dysmorphologies. Int Rev Cytol, 1995, 158:215
5 Nagata S. Apoptosis by death factor. Cell ，1997, 88:355
6 Macias D, Ganan Y, Sampath TK, et al. Role of BMP-2 and OP-1 (BMP-7) in programmed cell death and skeletogenesis during chick limb development. Development, 1997, 124:1109
(收稿：1998-10-19), 百拇医药