骨骼肌失神经后退变与再生的形态学观察
作者：唐休发 刘宝林 顾晓明 孙庆妹
单位：顾晓明 刘宝林 孙庆妹 西安第四军医大学口腔医学院 710032；唐休发 现在成都华西医科大学口腔医学院工作
关键词：肌；肌去神经法；萎缩；显微镜检查
骨骼肌失神经后退变与再生的形态学观察〔摘要〕 目的：观察骨骼肌神经切断后的形态学动态变化，特别是较长时间失神经肌肉有无退变及再生。方法：以纯系BALB/C小鼠为实验动物，切断一侧坐骨神经，术后1、2、4、8、12和16周分别取腓肠肌进行光电镜观察。结果：失神经早期主要为肌纤维萎缩，随后退变、再生，较长时间失神经以后再生的肌细胞再发生退变。长时间失神经肌肉光镜下见成堆的细胞核，似大量的增生的纤维结缔组织取代肌组织，电镜下可见到含有不成熟肌原纤维、胞核位于中央的不成熟肌细胞。结论：失神经后肌细胞退变和再生同时存在，由于无神经支配，再生的肌细胞不能分化发育为成熟的肌纤维，而再发生退变。长时间失神经后，最终可能使肌卫星细胞或其它成肌细胞不断消耗，使肌肉恢复功能差。
, http://www.100md.com
The morphological feature of the skeletal muscles after denervation
Tang Xiufa, Liu Baolin, Gu Xiaoming, et al.
Siomaiological College, Fourth Military Medical University
〔Abstract〕Objective: To investigate the morphological feature of degeneration and regeneration of skeletal muscle after denervation. Methods:Denervation was carried out in gastrocnemius muscles in 30 adult BALB/C mice by cutting the sciatic nerve. The denervated gastrocnemius muscles were removed 1,2,4,8,12 and 16 weeks respectively after denervation. Specimens were Processed for histological study with light microscope and TEM. Results:Musclc fiber atrophy followed by degeneration and regeneration was observed in the early period of denervation. Fusion of the regenerated muscle cells with each another followed by degeneration of the cells and growth of fibroconnnective tissue were observed in the later stage. Conclusion:Degeneration and regeneration may coexist in the denervated muscles. The regenerated musle cells can not fully develop due to the deficit of nerve regulation and degenerate again. As a result, muscle cells may be replaced by fibro-connective tissue.
, 百拇医药
Key words Mascles; Denervation; Atrophy; Microscopy
骨骼肌的功能性重建决定于神经和肌肉两方面的因素，一要有到达肌肉并与肌细胞接触的神经纤维，二要有能接受神经的肌细胞。显微外科技术为游离移植和单纯神经损伤的肌肉提供了神经来源，对如何促使神经到达肌肉的研究亦较多。但无论立即吻合还是延期神经吻合，或别的术式，再生神经到达肌肉均需要一定时间，不同术式所需时间长短不等，即失神经肌肉总是不能立即与神经发生结构和功能性联系而发生萎缩，使其最终功能受到影响。失神经的时间不同，对肌功能恢复的影响程度不同。本文通过动物试验从形态学角度观察骨骼肌失神经后不同时间的退变与再生变化。
1 材料与方法
1.1 实验动物及手术方法 见参考文献[1]。
1.2 实验主要试剂及设备
, 百拇医药
1.2.1常规HE染色及透射电镜样品制备试剂。
1.2.2NOVA超薄切片机(LKB公司)。
1.2.3JEM-2000EX透射电镜(日本生产)。
1.3 实验方法
1.3.1石蜡切片制备于动物手术后1、2、4、8、12和16周处死动物，取实验侧和对照侧腓肠肌原长固定于体积分数(φ)为10%的福尔马林液中12h，常规脱水，纵、横向石蜡包埋，5μm厚切片裱于清洁玻片上，常规HE染色，光镜观察。
1.3.2超薄切片的制备取1、4和12周组实验侧和正常腓肠肌中部肌肉，低温下切成1mm×1mm×1mm大小组织块各4块，立即固定于30g/L戊二醛溶液2～4h，10g/L锇酸后固定1～2h，逐级丙酮脱水，Epon812包埋，NOVA超薄切片机切片。JEM-2000EX透射电镜观察。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 光镜下见正常肌组织肌纤维排列整齐，肌束间间隙小，有少量结缔组织，纵切片上可见肌纤维横纹清晰，肌核椭圆形，沿肌纤维长轴方向排列，大多在肌纤维边缘。肌纤维间可见成纤维细胞，肌核染色较成纤维细胞核染色淡。肌浆均匀分布。横切片上肌核位于肌纤维边缘。
切断神经后1周组，肌纤维大部分萎缩，纤维间间隙增大，胞浆染色变淡，肌核增加，形成核堆，核染色浓淡不均，仍可见肌纤维横纹，大部分肌核沿肌纤维长轴方向排列。
切断神经后2周组，可见肌纤维萎缩，部分肌纤维退变，横纹模糊或消失，胞浆淡染或不均匀，核增多，分布紊乱，形成核堆，替代退变肌细胞。少部分肌纤维仍可见横纹，肌纤维间结缔组织增多，少部分区域有脂肪浸润于肌纤维之间。
切断神经后4周组，大部分肌纤维萎缩，退变的肌纤维轮廓消失，核排列紊乱，部分核排列仍有方向性，可见核固缩和肿胀以及位于肌纤维中央的核，肌细胞胞浆少(图1)。
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切断神经后8周组，肌纤维轮廓模糊，横纹消失，胞浆淡染，肿胀淡染的核增多，成串沿肌纤维方向排列，部分区域脂肪结缔组织浸润。
切断神经后12周组，肌纤维严重萎缩，几乎不见胞浆，各种形态的核成堆分布，染色不均，无正常形态的肌细胞。固缩核增多。脂肪组织浸润明显。
切断神经后16周组，部分肿胀的核染色极淡，分布紊乱，大量的核成串状分布。固缩的核亦较多。无明显脂肪浸润(图2)。
2.2 电镜下见正常肌肉肌原纤维排列整齐，Z线清晰，线粒体均匀分布在肌原纤维之间，排列规则，未见溶酶体。神经切断后1周肌原纤维排列基本整齐，线粒体增多，无明显肿胀。4周组线粒体明显增多肿胀，溶酶体增多，可见含不成熟的肌原纤维的细胞；12周有核位于细胞中央的细胞，胞浆内有不成熟肌原纤维，线粒体肿胀，被认为是再生的肌细胞退变，也可见未发生退变的再生肌细胞，核位于细胞中央，肌原纤维分布不规则(图3，4)。
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图1 部分核固缩、肿胀呈串珠状(失神经4周，HE×40)
图2 大量的细胞核成堆分布，胞浆少(失神经16周，HE×20)
图3 核位于中央的不成熟肌细胞(失神经后12周，TEM×3000)
图4 不成熟的细胞再生退变(失神经后12周，TEM×10K)
, 百拇医药
3 讨 论
骨骼肌支配神经切断或破坏后，又无足够的再生可能时，受累骨骼肌变小和松驰，组织学上肌纤维横径变小，横切面的形状变为棱角形，肌核彼此密集，常形成核堆。肌纤维的萎缩是由于其内的肌原纤维及其他结构减少所致，肌细胞膜形成皱折。但早期肌细胞并不发生坏死，只是在状态持续了较长时间以后肌纤维才崩解，留下空的基底膜外壳[2]。而且不同型肌纤维对失神经的反应敏感性是不一致的，ⅡB型纤维最早发生萎缩，继之各型纤维萎缩，肌纤维内部结构紊乱[3]。而大部分肌肉包括腓肠肌均为混合型肌，因此，不同时间不同纤维所发生的变化程度不同步。其机理尚不清楚。
本实验对失神经鼠腓肠肌动态观察发现，肌纤维早期发生萎缩，继之退变，退变的肌细胞被成肌细胞替代[4]。在严重萎缩的肌纤维所在位置核增多，这些核排列仍有一定方向性，细胞核中有的肿胀，有的固缩，增多的核可能为相对性的，也可能因细胞增殖而形成绝对性的核增多。电镜下见失神经较长时间组(12周)有细胞核位于细胞中央、胞浆中有不成熟的肌原纤维的细胞。因此失神经早期，由于退变肌纤维的基膜存在，由肌卫星细胞等成肌潜能的细胞增殖而来的细胞可能在基膜内融合为不成熟的肌细胞，而失神经时间较长的肌肉，基膜最终崩解，新形成的不成熟的肌细胞亦发生退变，即在没有神经支配的状况下，新形成的成肌细胞反复退变与再生，不断循环，最终导致肌原性细胞全部丧失[5]。但可能这个时间是相当长的。本实验中的观察时间内仍有再生的肌细胞，因此，促进失神经骨骼肌再生，促使神经与肌肉尽早发生形态和功能性联接可能会提高失神经肌肉功能恢复程度。
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本课题由博士后科学基金资助
参考文献
1 唐休发，顾晓明，刘宝林，等. 神经切断后骨骼肌特异蛋白表达变化. 实用口腔医学杂志，1998,14(2):83
2 武忠弼译. 病理学. 总论与各论. 北京：人民卫生出版社，1989.974
3 Oldfors A, Mair WGP, Fogdestam I. The morphological sequences in man of de and reinnervation in free muscle transfer with microneurovascular anastomoses. Scand J Plast Reconstr Surg, 1989,23:35
4 Koshima I, Endo T. Experimental study of vascularized muscle: Multifactorial analysis of muscle regeneration following denervation. J Reconstr Micro Surg, 1989,5(3):225
5 Schmalbruch H, Al-Amood WS, Lewis DM. Morphology of long-term denervated rat soleus muscle and the effect of chronic electrical stimulation. J Physiol, 1991,441:233
(收稿：1997-08-19), 百拇医药
单位：顾晓明 刘宝林 孙庆妹 西安第四军医大学口腔医学院 710032；唐休发 现在成都华西医科大学口腔医学院工作
关键词：肌；肌去神经法；萎缩；显微镜检查
骨骼肌失神经后退变与再生的形态学观察〔摘要〕 目的：观察骨骼肌神经切断后的形态学动态变化，特别是较长时间失神经肌肉有无退变及再生。方法：以纯系BALB/C小鼠为实验动物，切断一侧坐骨神经，术后1、2、4、8、12和16周分别取腓肠肌进行光电镜观察。结果：失神经早期主要为肌纤维萎缩，随后退变、再生，较长时间失神经以后再生的肌细胞再发生退变。长时间失神经肌肉光镜下见成堆的细胞核，似大量的增生的纤维结缔组织取代肌组织，电镜下可见到含有不成熟肌原纤维、胞核位于中央的不成熟肌细胞。结论：失神经后肌细胞退变和再生同时存在，由于无神经支配，再生的肌细胞不能分化发育为成熟的肌纤维，而再发生退变。长时间失神经后，最终可能使肌卫星细胞或其它成肌细胞不断消耗，使肌肉恢复功能差。
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The morphological feature of the skeletal muscles after denervation
Tang Xiufa, Liu Baolin, Gu Xiaoming, et al.
Siomaiological College, Fourth Military Medical University
〔Abstract〕Objective: To investigate the morphological feature of degeneration and regeneration of skeletal muscle after denervation. Methods:Denervation was carried out in gastrocnemius muscles in 30 adult BALB/C mice by cutting the sciatic nerve. The denervated gastrocnemius muscles were removed 1,2,4,8,12 and 16 weeks respectively after denervation. Specimens were Processed for histological study with light microscope and TEM. Results:Musclc fiber atrophy followed by degeneration and regeneration was observed in the early period of denervation. Fusion of the regenerated muscle cells with each another followed by degeneration of the cells and growth of fibroconnnective tissue were observed in the later stage. Conclusion:Degeneration and regeneration may coexist in the denervated muscles. The regenerated musle cells can not fully develop due to the deficit of nerve regulation and degenerate again. As a result, muscle cells may be replaced by fibro-connective tissue.
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Key words Mascles; Denervation; Atrophy; Microscopy
骨骼肌的功能性重建决定于神经和肌肉两方面的因素，一要有到达肌肉并与肌细胞接触的神经纤维，二要有能接受神经的肌细胞。显微外科技术为游离移植和单纯神经损伤的肌肉提供了神经来源，对如何促使神经到达肌肉的研究亦较多。但无论立即吻合还是延期神经吻合，或别的术式，再生神经到达肌肉均需要一定时间，不同术式所需时间长短不等，即失神经肌肉总是不能立即与神经发生结构和功能性联系而发生萎缩，使其最终功能受到影响。失神经的时间不同，对肌功能恢复的影响程度不同。本文通过动物试验从形态学角度观察骨骼肌失神经后不同时间的退变与再生变化。
1 材料与方法
1.1 实验动物及手术方法 见参考文献[1]。
1.2 实验主要试剂及设备
, 百拇医药
1.2.1常规HE染色及透射电镜样品制备试剂。
1.2.2NOVA超薄切片机(LKB公司)。
1.2.3JEM-2000EX透射电镜(日本生产)。
1.3 实验方法
1.3.1石蜡切片制备于动物手术后1、2、4、8、12和16周处死动物，取实验侧和对照侧腓肠肌原长固定于体积分数(φ)为10%的福尔马林液中12h，常规脱水，纵、横向石蜡包埋，5μm厚切片裱于清洁玻片上，常规HE染色，光镜观察。
1.3.2超薄切片的制备取1、4和12周组实验侧和正常腓肠肌中部肌肉，低温下切成1mm×1mm×1mm大小组织块各4块，立即固定于30g/L戊二醛溶液2～4h，10g/L锇酸后固定1～2h，逐级丙酮脱水，Epon812包埋，NOVA超薄切片机切片。JEM-2000EX透射电镜观察。
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2 结 果
2.1 光镜下见正常肌组织肌纤维排列整齐，肌束间间隙小，有少量结缔组织，纵切片上可见肌纤维横纹清晰，肌核椭圆形，沿肌纤维长轴方向排列，大多在肌纤维边缘。肌纤维间可见成纤维细胞，肌核染色较成纤维细胞核染色淡。肌浆均匀分布。横切片上肌核位于肌纤维边缘。
切断神经后1周组，肌纤维大部分萎缩，纤维间间隙增大，胞浆染色变淡，肌核增加，形成核堆，核染色浓淡不均，仍可见肌纤维横纹，大部分肌核沿肌纤维长轴方向排列。
切断神经后2周组，可见肌纤维萎缩，部分肌纤维退变，横纹模糊或消失，胞浆淡染或不均匀，核增多，分布紊乱，形成核堆，替代退变肌细胞。少部分肌纤维仍可见横纹，肌纤维间结缔组织增多，少部分区域有脂肪浸润于肌纤维之间。
切断神经后4周组，大部分肌纤维萎缩，退变的肌纤维轮廓消失，核排列紊乱，部分核排列仍有方向性，可见核固缩和肿胀以及位于肌纤维中央的核，肌细胞胞浆少(图1)。
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切断神经后8周组，肌纤维轮廓模糊，横纹消失，胞浆淡染，肿胀淡染的核增多，成串沿肌纤维方向排列，部分区域脂肪结缔组织浸润。
切断神经后12周组，肌纤维严重萎缩，几乎不见胞浆，各种形态的核成堆分布，染色不均，无正常形态的肌细胞。固缩核增多。脂肪组织浸润明显。
切断神经后16周组，部分肿胀的核染色极淡，分布紊乱，大量的核成串状分布。固缩的核亦较多。无明显脂肪浸润(图2)。
2.2 电镜下见正常肌肉肌原纤维排列整齐，Z线清晰，线粒体均匀分布在肌原纤维之间，排列规则，未见溶酶体。神经切断后1周肌原纤维排列基本整齐，线粒体增多，无明显肿胀。4周组线粒体明显增多肿胀，溶酶体增多，可见含不成熟的肌原纤维的细胞；12周有核位于细胞中央的细胞，胞浆内有不成熟肌原纤维，线粒体肿胀，被认为是再生的肌细胞退变，也可见未发生退变的再生肌细胞，核位于细胞中央，肌原纤维分布不规则(图3，4)。
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图1 部分核固缩、肿胀呈串珠状(失神经4周，HE×40)
图2 大量的细胞核成堆分布，胞浆少(失神经16周，HE×20)
图3 核位于中央的不成熟肌细胞(失神经后12周，TEM×3000)
图4 不成熟的细胞再生退变(失神经后12周，TEM×10K)
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3 讨 论
骨骼肌支配神经切断或破坏后，又无足够的再生可能时，受累骨骼肌变小和松驰，组织学上肌纤维横径变小，横切面的形状变为棱角形，肌核彼此密集，常形成核堆。肌纤维的萎缩是由于其内的肌原纤维及其他结构减少所致，肌细胞膜形成皱折。但早期肌细胞并不发生坏死，只是在状态持续了较长时间以后肌纤维才崩解，留下空的基底膜外壳[2]。而且不同型肌纤维对失神经的反应敏感性是不一致的，ⅡB型纤维最早发生萎缩，继之各型纤维萎缩，肌纤维内部结构紊乱[3]。而大部分肌肉包括腓肠肌均为混合型肌，因此，不同时间不同纤维所发生的变化程度不同步。其机理尚不清楚。
本实验对失神经鼠腓肠肌动态观察发现，肌纤维早期发生萎缩，继之退变，退变的肌细胞被成肌细胞替代[4]。在严重萎缩的肌纤维所在位置核增多，这些核排列仍有一定方向性，细胞核中有的肿胀，有的固缩，增多的核可能为相对性的，也可能因细胞增殖而形成绝对性的核增多。电镜下见失神经较长时间组(12周)有细胞核位于细胞中央、胞浆中有不成熟的肌原纤维的细胞。因此失神经早期，由于退变肌纤维的基膜存在，由肌卫星细胞等成肌潜能的细胞增殖而来的细胞可能在基膜内融合为不成熟的肌细胞，而失神经时间较长的肌肉，基膜最终崩解，新形成的不成熟的肌细胞亦发生退变，即在没有神经支配的状况下，新形成的成肌细胞反复退变与再生，不断循环，最终导致肌原性细胞全部丧失[5]。但可能这个时间是相当长的。本实验中的观察时间内仍有再生的肌细胞，因此，促进失神经骨骼肌再生，促使神经与肌肉尽早发生形态和功能性联接可能会提高失神经肌肉功能恢复程度。
, http://www.100md.com
本课题由博士后科学基金资助
参考文献
1 唐休发，顾晓明，刘宝林，等. 神经切断后骨骼肌特异蛋白表达变化. 实用口腔医学杂志，1998,14(2):83
2 武忠弼译. 病理学. 总论与各论. 北京：人民卫生出版社，1989.974
3 Oldfors A, Mair WGP, Fogdestam I. The morphological sequences in man of de and reinnervation in free muscle transfer with microneurovascular anastomoses. Scand J Plast Reconstr Surg, 1989,23:35
4 Koshima I, Endo T. Experimental study of vascularized muscle: Multifactorial analysis of muscle regeneration following denervation. J Reconstr Micro Surg, 1989,5(3):225
5 Schmalbruch H, Al-Amood WS, Lewis DM. Morphology of long-term denervated rat soleus muscle and the effect of chronic electrical stimulation. J Physiol, 1991,441:233
(收稿：1997-08-19), 百拇医药