丹参对骨髓培养中破骨细胞生成的影响
作者：丁 寅 相马俊一 山本照子 松本进 作田守
单位：丁 寅 第四军医大学口腔医学院正畸科 710032；相马俊一 山本照子 松本进 作田守 日本大阪大学齿学部矫正科
关键词：丹参；骨髓细胞；破骨细胞
实用口腔医学杂志990104 〔摘要〕 目的：研究丹参对体外骨髓细胞培养中破骨细胞生成的作用。方法：采用小鼠长骨骨髓体外培养方法，通过检测抗酒石酸磷酸酶(TRACP)阳性细胞生成数，反映破骨细胞的生成情况。结果：1.0g/L丹参可明显抑制TRACP阳性细胞的生成，其生成数仅为对照组的29.8%；PGE2(10-7mol/L)及1.25(OH)2D3(10-8mol/L)产生明显的促进作用，与对照组比较，TRACP阳性细胞生成数分别增加了6.04和6.68倍；丹参还可明显抑制PGE2和1.25(OH)2D3的作用，混合培养组TRACP阳性细胞生成数仅仅是单纯加PGE2和1.25(OH)2D3组的35.2%和39.3%，特别是多核破骨细胞数大量减少。结论：丹参可抑制骨髓细胞体外培养中破骨样细胞的生成，主要抑制破骨母细胞向成熟破骨细胞的转化，而成骨细胞可能在其中发挥了作用。
, 百拇医药
Effects of Salvia Miltiorrhiza Bung on osteoclast-like cells formation in mouse bone marrow culture
Ding Yin, Shunichi Soma , Teruko Takano-Yamamoto, et al
Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective: To study the effects of Salvia Miltorrhiza Bung(SMB) on the differentiation of cultured bone marrow cells into osteoclast-like cells. Methods: Mouse bone marrow cells were cultured in α-MEM alone(the control) or exposed to (1.0 g/L) of SMB，10-7mol/L of PGE2, 10-8 mol/L of 1.25(OH)2D3, 10 g/L of SMB+ 10-7 mol/L of PGE2 or 1.0 g/L of SMB+10-8mol/L of 1.25(OH)2D3 for 8 days respectively. Tatrate-risistant acid phosphatase(TRACP) positive cells were detected with Burstone stainning method. Result: The number of TRACP positive cells in the group of SMB was 29.8% of that in the control and that in SMB+PGE2 or in 1.25(OH)2D3 were 35.2% or 39.3% of that in PGE2) or in 1.25(OH)2O3. TRACP positive cells in the group of 1.25(OH)2D3 and of PGE2 were 6.68 and 6.04 times as many as those in the control respectively.Conclusion: SMB has the inhibiting effects on the differentiation of bone marrow cells into osteoclast-like cells by direct or indirect action on osteoblasts that can synthesize and secrete stimulating factors for osteoclast differentiation.
, 百拇医药
Key words Salvia Miltiorrhiza; Bone marrow cells; Osteoclasts
丹参作为一种治疗冠心病的药物近年来也用于促进骨折愈合[1，2]，对丹参参与骨组织改建的机理也有一些研究。丹参除具有扩张微血管、降低血小板聚集和改善微循环的作用外，还有促进局部氧自由基清除，促进成骨样细胞分裂与增殖，增强成骨样细胞碱性磷酸酶活性和促进骨生成等作用[3～5]。但是，丹参对破骨细胞及骨吸收的作用仍不清楚。本研究通过小鼠骨髓细胞体外培养实验，观察丹参对破骨细胞的生成有何作用，进一步认识丹参在骨改建中的作用机理。
1 材料与方法
1.1实验材料 选用出生后7～9周小鼠(由日本静冈实验动物中心提供)；纯化丹参液由中国上海新冈制药厂提供；α-MEM培养液由美国西格玛公司提供；日本ICA生物制品公司提供胎牛血清(FCS)。
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1.2骨髓细胞收集 颈椎脱臼法处死小鼠，置于体积分数(φ)为75%酒精中浸泡10min，无菌条件下解剖小鼠，取出四肢长骨，剔除附着之软组织，切除两端关节头，暴露骨髓腔，用注射器抽取磷酸缓冲液冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，混匀，计数备用。
1.3细胞培养 将骨髓细胞种于24孔培养板内(75×104个/孔)，设对照组，丹参(1.0g/L),PGE2(10-7mol/L),1.25(OH)2D3(10-8mol/L),丹参+PGE2,丹参+1.25(OH)2D3共6组，每组4孔。将细胞置于CO2孵箱内(37℃,φ5%CO2),在φ含10%胎牛血清(FCS)的α-MEM培养液中进行培养，每两天更换培养液1次，根据设计在培养液中加入丹参，PGE2，1.25(OH)2D3等，8d后中止培养，进行细胞固定与计数。
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1.4细胞染色与计数 细胞培养结束后，用φ为10%磷酸缓冲福尔马林液固定细胞(4℃,24h),按Burstone方法[6]进行细胞抗酒石酸磷酸酶(TRACP)染色，在倒置显微镜下观察(细胞呈深褐色，单核或多核)，用计数器计数。
1.5统计学分析 采用Wilcoxon秩和分析法进行统计学处理。
2 结 果
结果显示，在不同浓度中，仅1.0g/L丹参培养组TRACP阳性细胞的形成受到明显抑制(图1)，与对照组比较，其TRACP阳性细胞数，仅为对照组的29.8%；而PGE2(10-7mol/L)与1.25(OH)2D3培养组(10-8mol/L)TRACP阳性细胞数，特别是多核破骨细胞数明显增多，分别增加了6.04倍和6.68倍(图2)；丹参与PGE2或丹参与1.25(OH)2D3混合培养组TRACP阳性细胞数均明显少于单纯加PGE2或1.25(OH)2D3培养组，仅为后两组的35.2%和39.3%，(图3，4)。这些结果说明丹参具有抑制破骨细胞形成的作用。
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图1 丹参对TRACP阳性细胞生成的影响(n=4)
图2 各组TRACP阳性细胞生成数(n=4)
图3 丹参对PGE2作用的影响(n=4)
图4 丹参对1.25(OH)2D3作用的影响(n=4)
3 讨 论
3.1抗酒石酸磷酸酶与破骨细胞 抗酒石酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase简称TRACP)被认为是破骨细胞的标记酶。它不但可以反应多核破骨细胞生成数，还可以反映破骨细胞前体细胞的数量，该类细胞多为单核。这些单核的TRACP阳性细胞在PGE2,1.25(OH)2D3及一些骨吸收因子(如IL-1,IL-6,TNF等)的作用下，可以融合形成多核的破骨细胞[7～8]。
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3.2成骨细胞在骨吸收中的作用 研究表明，1.25(OH)2D3,甲状旁腺素(PTH),胰岛素样生长因子(IGF),肿瘤坏死因子(TNF),白细胞介素(IL-1,IL-6),转化生长因子(TGF-β)等都通过直接或间接作用于成骨细胞而影响破骨母细胞向成熟的多核破骨细胞转化，PGE2则是这一过程中重要的调节因素[9～11]。由此可见，骨吸收过程是一个多种因素共同参与的、多途径调节的复杂过程，在这一过程中，成骨细胞发挥了非常关键的作用。
3.3丹参对破骨细胞生成的作用 研究表明，丹参具有增加成骨样细胞碱性磷酸酶活性的作用，从而增强成骨细胞的功能与活性，促进新骨形成[5]。本研究发现，在骨髓培养中，丹参组不仅TRACP阳性细胞减少，而且更缺少多核破骨细胞，说明丹参不仅抑制了破骨母细胞的形成，更重要的是抑制了破骨母细胞向多核破骨细胞转化。此外，丹参还对PGE2及1.25(OH)2D3的促破骨细胞生成作用产生抑制，致使多核破骨细胞数大量减少，而这两种物质正是通过促使破骨母细胞融合形成多核破骨细胞来促进骨吸收的。这一结果说明丹参在体外骨髓培养中对破骨细胞的抑制作用主要是通过抑制破骨母细胞向成熟的多核破骨细胞转化而实现的。有学者[12]认为丹参具有钙离子阻滞剂作用,可以阻止细胞对钙离子的摄取,降低细胞内Ca2+与cAMP浓度,影响单核细胞向破骨细胞转化,从而推测钙离子阻滞作用可能是丹参对破骨细胞产生抑制作用的主要机理。此外，丹参在增强成骨细胞的功能与活性，促进新骨形成的同时，可能作用于成骨细胞，抑制其产生或分泌一些破骨细胞促进因子，使破骨细胞生成减少，影响骨吸收。
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参考文献
1 林润台，孙翼，王忠，等. 丹参促进下颌骨骨折愈合的超微结构研究. 中华口腔医学杂志, 1992,27(4)：216
2 秦军志, 王贤淑. 丹参对大鼠胫骨骨折愈合过程中血清、骨痂及骨组织中钙、锌、铜的影响. 中国中西医结合杂志, 1992,12(6)：354
3 苏晓华，梁殿权，王孝铭， 等. 丹参素(DS-182)对大鼠心肌线粒体氧自由基损伤的保护作用. 中华病理生理杂志，1992,21(2)：122
4 胡美珠，柴本甫，徐荣辉， 等. 丹参对体外鸡胚胎颅盖骨成骨细胞样细胞分裂增殖的放射自显影研究. 中华外科杂志, 1993,31(4)：252
5 Ding Y, Soma S, Takano-Yamamoto T, et al. Effects of Salvia Miltiorrhiza Bung(SMB) on osteoblast like cells-MC3T3-E1 cells. J Osaka Univ Dent Sch,1995,35:21
, http://www.100md.com
6 Burstone MS. Histochemical demonstration of acid phsphatase with naphthol AS-phosphates. J Natl Cancer Inst, 1958,21:523
7 Minkin C. Bone acid phosphatase: Tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcif Tissue Int,1982,34:285
8 Takahashi N, Yamana H, Yoshiki SH, et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology, 1988,122(4):1373
, 百拇医药
9 Akatsu T, Takahashi N, Udagawa N, et al. Role of prostaglandings in interleukin-1-induced bone resorption in mice in vitro. J Bone Miner Res, 1991,6(2):183
10 Shinar DM, Rodan GA. Biophasic effects of transforming growth facter-β on the production of osteoclast-like cells in mouse bone marrow cultures: The role of prostaglandings in the generation of these cells. Endocrinology. 1990,126(6):3153
11 Akatsu T, Takahashi N, Udagawa N, et al. Parathyroid hormone(PTH)-related protein is a potent stimulator of osteoclast-like multinucleated cell formation to the same extent as PTH in mouse marrow cultures. Endocrinology. 1989,125(1):20
12 张丁, 傅民魁. 丹参对破骨细胞生长抑制作用的研究. 口腔正畸学杂志, 1995,2(3):186
(收稿：1998-03-30), http://www.100md.com
单位：丁 寅 第四军医大学口腔医学院正畸科 710032；相马俊一 山本照子 松本进 作田守 日本大阪大学齿学部矫正科
关键词：丹参；骨髓细胞；破骨细胞
实用口腔医学杂志990104 〔摘要〕 目的：研究丹参对体外骨髓细胞培养中破骨细胞生成的作用。方法：采用小鼠长骨骨髓体外培养方法，通过检测抗酒石酸磷酸酶(TRACP)阳性细胞生成数，反映破骨细胞的生成情况。结果：1.0g/L丹参可明显抑制TRACP阳性细胞的生成，其生成数仅为对照组的29.8%；PGE2(10-7mol/L)及1.25(OH)2D3(10-8mol/L)产生明显的促进作用，与对照组比较，TRACP阳性细胞生成数分别增加了6.04和6.68倍；丹参还可明显抑制PGE2和1.25(OH)2D3的作用，混合培养组TRACP阳性细胞生成数仅仅是单纯加PGE2和1.25(OH)2D3组的35.2%和39.3%，特别是多核破骨细胞数大量减少。结论：丹参可抑制骨髓细胞体外培养中破骨样细胞的生成，主要抑制破骨母细胞向成熟破骨细胞的转化，而成骨细胞可能在其中发挥了作用。
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Effects of Salvia Miltiorrhiza Bung on osteoclast-like cells formation in mouse bone marrow culture
Ding Yin, Shunichi Soma , Teruko Takano-Yamamoto, et al
Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective: To study the effects of Salvia Miltorrhiza Bung(SMB) on the differentiation of cultured bone marrow cells into osteoclast-like cells. Methods: Mouse bone marrow cells were cultured in α-MEM alone(the control) or exposed to (1.0 g/L) of SMB，10-7mol/L of PGE2, 10-8 mol/L of 1.25(OH)2D3, 10 g/L of SMB+ 10-7 mol/L of PGE2 or 1.0 g/L of SMB+10-8mol/L of 1.25(OH)2D3 for 8 days respectively. Tatrate-risistant acid phosphatase(TRACP) positive cells were detected with Burstone stainning method. Result: The number of TRACP positive cells in the group of SMB was 29.8% of that in the control and that in SMB+PGE2 or in 1.25(OH)2D3 were 35.2% or 39.3% of that in PGE2) or in 1.25(OH)2O3. TRACP positive cells in the group of 1.25(OH)2D3 and of PGE2 were 6.68 and 6.04 times as many as those in the control respectively.Conclusion: SMB has the inhibiting effects on the differentiation of bone marrow cells into osteoclast-like cells by direct or indirect action on osteoblasts that can synthesize and secrete stimulating factors for osteoclast differentiation.
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Key words Salvia Miltiorrhiza; Bone marrow cells; Osteoclasts
丹参作为一种治疗冠心病的药物近年来也用于促进骨折愈合[1，2]，对丹参参与骨组织改建的机理也有一些研究。丹参除具有扩张微血管、降低血小板聚集和改善微循环的作用外，还有促进局部氧自由基清除，促进成骨样细胞分裂与增殖，增强成骨样细胞碱性磷酸酶活性和促进骨生成等作用[3～5]。但是，丹参对破骨细胞及骨吸收的作用仍不清楚。本研究通过小鼠骨髓细胞体外培养实验，观察丹参对破骨细胞的生成有何作用，进一步认识丹参在骨改建中的作用机理。
1 材料与方法
1.1实验材料 选用出生后7～9周小鼠(由日本静冈实验动物中心提供)；纯化丹参液由中国上海新冈制药厂提供；α-MEM培养液由美国西格玛公司提供；日本ICA生物制品公司提供胎牛血清(FCS)。
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1.2骨髓细胞收集 颈椎脱臼法处死小鼠，置于体积分数(φ)为75%酒精中浸泡10min，无菌条件下解剖小鼠，取出四肢长骨，剔除附着之软组织，切除两端关节头，暴露骨髓腔，用注射器抽取磷酸缓冲液冲洗骨髓腔，收集骨髓冲洗液，混匀，计数备用。
1.3细胞培养 将骨髓细胞种于24孔培养板内(75×104个/孔)，设对照组，丹参(1.0g/L),PGE2(10-7mol/L),1.25(OH)2D3(10-8mol/L),丹参+PGE2,丹参+1.25(OH)2D3共6组，每组4孔。将细胞置于CO2孵箱内(37℃,φ5%CO2),在φ含10%胎牛血清(FCS)的α-MEM培养液中进行培养，每两天更换培养液1次，根据设计在培养液中加入丹参，PGE2，1.25(OH)2D3等，8d后中止培养，进行细胞固定与计数。
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1.4细胞染色与计数 细胞培养结束后，用φ为10%磷酸缓冲福尔马林液固定细胞(4℃,24h),按Burstone方法[6]进行细胞抗酒石酸磷酸酶(TRACP)染色，在倒置显微镜下观察(细胞呈深褐色，单核或多核)，用计数器计数。
1.5统计学分析 采用Wilcoxon秩和分析法进行统计学处理。
2 结 果
结果显示，在不同浓度中，仅1.0g/L丹参培养组TRACP阳性细胞的形成受到明显抑制(图1)，与对照组比较，其TRACP阳性细胞数，仅为对照组的29.8%；而PGE2(10-7mol/L)与1.25(OH)2D3培养组(10-8mol/L)TRACP阳性细胞数，特别是多核破骨细胞数明显增多，分别增加了6.04倍和6.68倍(图2)；丹参与PGE2或丹参与1.25(OH)2D3混合培养组TRACP阳性细胞数均明显少于单纯加PGE2或1.25(OH)2D3培养组，仅为后两组的35.2%和39.3%，(图3，4)。这些结果说明丹参具有抑制破骨细胞形成的作用。
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图1 丹参对TRACP阳性细胞生成的影响(n=4)
图2 各组TRACP阳性细胞生成数(n=4)
图3 丹参对PGE2作用的影响(n=4)
图4 丹参对1.25(OH)2D3作用的影响(n=4)
3 讨 论
3.1抗酒石酸磷酸酶与破骨细胞 抗酒石酸磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase简称TRACP)被认为是破骨细胞的标记酶。它不但可以反应多核破骨细胞生成数，还可以反映破骨细胞前体细胞的数量，该类细胞多为单核。这些单核的TRACP阳性细胞在PGE2,1.25(OH)2D3及一些骨吸收因子(如IL-1,IL-6,TNF等)的作用下，可以融合形成多核的破骨细胞[7～8]。
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3.2成骨细胞在骨吸收中的作用 研究表明，1.25(OH)2D3,甲状旁腺素(PTH),胰岛素样生长因子(IGF),肿瘤坏死因子(TNF),白细胞介素(IL-1,IL-6),转化生长因子(TGF-β)等都通过直接或间接作用于成骨细胞而影响破骨母细胞向成熟的多核破骨细胞转化，PGE2则是这一过程中重要的调节因素[9～11]。由此可见，骨吸收过程是一个多种因素共同参与的、多途径调节的复杂过程，在这一过程中，成骨细胞发挥了非常关键的作用。
3.3丹参对破骨细胞生成的作用 研究表明，丹参具有增加成骨样细胞碱性磷酸酶活性的作用，从而增强成骨细胞的功能与活性，促进新骨形成[5]。本研究发现，在骨髓培养中，丹参组不仅TRACP阳性细胞减少，而且更缺少多核破骨细胞，说明丹参不仅抑制了破骨母细胞的形成，更重要的是抑制了破骨母细胞向多核破骨细胞转化。此外，丹参还对PGE2及1.25(OH)2D3的促破骨细胞生成作用产生抑制，致使多核破骨细胞数大量减少，而这两种物质正是通过促使破骨母细胞融合形成多核破骨细胞来促进骨吸收的。这一结果说明丹参在体外骨髓培养中对破骨细胞的抑制作用主要是通过抑制破骨母细胞向成熟的多核破骨细胞转化而实现的。有学者[12]认为丹参具有钙离子阻滞剂作用,可以阻止细胞对钙离子的摄取,降低细胞内Ca2+与cAMP浓度,影响单核细胞向破骨细胞转化,从而推测钙离子阻滞作用可能是丹参对破骨细胞产生抑制作用的主要机理。此外，丹参在增强成骨细胞的功能与活性，促进新骨形成的同时，可能作用于成骨细胞，抑制其产生或分泌一些破骨细胞促进因子，使破骨细胞生成减少，影响骨吸收。
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参考文献
1 林润台，孙翼，王忠，等. 丹参促进下颌骨骨折愈合的超微结构研究. 中华口腔医学杂志, 1992,27(4)：216
2 秦军志, 王贤淑. 丹参对大鼠胫骨骨折愈合过程中血清、骨痂及骨组织中钙、锌、铜的影响. 中国中西医结合杂志, 1992,12(6)：354
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6 Burstone MS. Histochemical demonstration of acid phsphatase with naphthol AS-phosphates. J Natl Cancer Inst, 1958,21:523
7 Minkin C. Bone acid phosphatase: Tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function. Calcif Tissue Int,1982,34:285
8 Takahashi N, Yamana H, Yoshiki SH, et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology, 1988,122(4):1373
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9 Akatsu T, Takahashi N, Udagawa N, et al. Role of prostaglandings in interleukin-1-induced bone resorption in mice in vitro. J Bone Miner Res, 1991,6(2):183
10 Shinar DM, Rodan GA. Biophasic effects of transforming growth facter-β on the production of osteoclast-like cells in mouse bone marrow cultures: The role of prostaglandings in the generation of these cells. Endocrinology. 1990,126(6):3153
11 Akatsu T, Takahashi N, Udagawa N, et al. Parathyroid hormone(PTH)-related protein is a potent stimulator of osteoclast-like multinucleated cell formation to the same extent as PTH in mouse marrow cultures. Endocrinology. 1989,125(1):20
12 张丁, 傅民魁. 丹参对破骨细胞生长抑制作用的研究. 口腔正畸学杂志, 1995,2(3):186
(收稿：1998-03-30), http://www.100md.com