应用多糖及胶原蛋白复合生物膜做小型猪牙直接盖髓基础研究初探
作者：王 琦 徐爱凤 王 宁 王凤光 孙 莹 汪育苗
单位：北京首都医科大学附属北京口腔医院口腔内科(王 琦 徐爱凤)；口腔组织病理科(王 宁 王凤光 孙 莹 汪育苗)
关键词：多糖类；胶原；雏型猪；修复性牙本质
实用口腔医学杂志990314 〔摘要〕 目的：研究应用多糖(以氨基多糖为主)及胶原蛋白复合生物膜对小型猪牙行直接盖髓术的作用。方法：用多糖及胶原蛋白复合生物膜做小型猪牙的直接盖髓术并与氢氧化钙对照。分别于术后2、4、12 周、6 个月将小型猪快速处死，本文是随机抽样不同时期的4 个对照牙经固定，超声快速脱钙做组织切片，在光镜下观察。结果：4 个术后不同时期的牙在穿髓孔处均有不同程度的修复性牙本质形成。周边造牙本质细胞排列整齐，牙髓无炎症及变性，根髓及牙周组织正常，最终形成牙本质桥将穿髓孔封闭使牙髓保存了活力。结论：实验结果证明了含有多糖及胶原蛋白复合生物膜对小型猪牙有良好的直接盖髓作用，从而推动实验深入进行。
, 百拇医药
Direct pulp capping with polysaccharide and collagen protein
biomembrane in mini-pig
Wang Qi, Xu Aifeng, Wang Ning, et al.Beijing Hospital of Stomatology, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050
〔Abstract〕Objective: To study effects of biomembrane compounded with polysaccharide and collagen protein in direct pulp capping in mini-pig. Methods:The pulp of tested teeth of mini-pigs were directly capped with polysaccharide and collagen protein biomembrane and Ca(OH)2 was used as the control. The tested teeth were extracted 2 weeks, 4 weeks, 12 weeks, and 6 months after the operation. The extracted teeth were examined histopathologically.Result:Reparative dentin under the biomembrane in opened area was observed in the tested teeth. The arrangement of odontoblasts was found in line and there was no inflammation. The root pulp and periodontal tissue were normal. Finally the opened area was closed by dentinal bridge. Conclusion:Polysaccharide and collagen protein biomembrane is effective in promoting the formation of reparative dentin.
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Key words Polysaccharides; Collagen; Miniature swine；Reparative dentin
目前国内外很多有关多糖(以氨基多糖醛)及胶原蛋白等各种生长因子的生物制剂在医药领域中广泛研究和应用的报道[1～4]。胶原及其他生物材料。氨基多糖是天然高分子物质，可以和蛋白、碳酸钙紧密结合成为一种络合体[7]，有调节体液平衡，抑制细菌和寄生虫作用，促进伤口愈合，有增强免疫力，促进细胞再生功能，有良好的生物学可溶性，已在外科应用[4,5]。胶原有促进成纤维细胞增殖，诱导硬组织桥形成等作用[1,6]。本实验用含有氨基多糖及胶原蛋白的生物膜作为小型猪牙的直接盖髓剂，取得了意想不到的效果。
1 材料和方法
1.1 本实验用小型猪由北京农业大学实验动物研究所提供，年龄在生后半年至1 年，实验期在我院动物室用标准混合饲料笼养，实验前观察1～2 周待生活习惯稳定、无全身疾病时作为待实验动物。实验当日早晨禁食，实验时用复方氯胺酮注射液按每10 kg体重用1 ml的用量从猪耳后做肌肉注射麻醉，待麻醉后侧卧体位，剪去口周棕毛，用水冲洗，用25g/L 碘酒及体积分数为 75%酒精消毒，用木塞将口张开，做口内消毒并放置吸唾器。全实验过程均无菌操作。
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1.2 实验用多糖胶原蛋白复合生物膜(以下简称生物膜)经制作、除杂质、干燥、消毒，常温保存待用。检查小型猪口腔内牙齿状况为乳牙及恒牙混合牙列，选择无龋坏、无磨耗、牙周正常的牙，用消毒的高速涡轮机钻将小型猪牙开髓，如果出血多，注意止血，穿髓孔大小约0.5～1 mm，用生物膜做直接盖髓，少量氧化锌丁香油糊剂及水门汀垫底后做银汞合金充填；对照组用无菌氢氧化钙粉剂加少量无菌生理盐水调合后做直接盖髓，同样用氧化锌丁香油糊剂及水门汀垫底，银汞合金充填。待小型猪麻醉苏醒后放入动物室笼养。术后观察实验动物进食及日常活动无异常表现，分别在手术后2、4、12 周、6 个月时用心脏直接穿刺放血将小型猪快速处死。
1.3 立即将处死后小型猪实验牙拔下，拔时注意不可拔断，以免牙髓被脱出而移位，放入体积分数为10% 福尔马林液中固定。观察拔下的实验牙均无牙体变色，牙周正常，无瘘管，说明牙髓是活的。
1.4 随机抽取不同盖髓期的4个牙，为2周
(左上第一磨牙)、4周
(左上第二前磨牙)、12周
(左上第二磨牙)、6个月(左上第一磨牙)及氢氧化钙对照的4周(左上第二磨牙)。用快速超声脱钙后，脱水、包埋、切片、HE 染色，在光镜下观察并用显微摄影作形态学分析。
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2 结 果
2.12 周组织切片 见牙髓腔毛细血管充血，纤维细胞增生，周边成牙本质细胞排列整齐，穿髓孔处可见明显的新生粉染均质物质为牙本质。冠髓及根髓组织正常。
2.24 周组织切片 牙髓腔有毛血管扩张，充血明显，纤维细胞增生，周边成牙本质细胞排列整齐，穿髓孔处可见已形成的牙本质团块，成弧形排列，团块周边有丰富的成牙本质细胞。冠髓及根髓组织正常。
2.312 周组织切片 牙髓腔内毛细血管扩张，纤维细胞增生，周边成牙本质细胞排列整齐，穿髓孔下方可见新生的牙本质，已有牙本质小管形成，并见大部分不规则的钙化物形成。冠髓及根髓组织正常。
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2.46个月组织切片 牙髓腔毛细血管扩张、淤血，髓腔血管周围可见散在的粉染均质物，周边成牙本质细胞排列整齐，穿髓孔下方可见已形成的牙本质桥，近髓腔侧有多量成牙本质细胞形成。冠髓及根髓组织正常。
2.5氢氧化钙盖髓4 周的组织切片 穿髓孔处血块机化，其下方有牙本质基质将穿髓孔封闭，周边有成牙本质细胞形成，牙髓结构基本正常，毛细血管充血扩张，牙髓细胞空泡变性较多。
图1直接盖髓后2 周 可见穿髓孔处明显的新生牙本质基质将穿孔封闭 3.3×4
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图2直接盖髓后4 周 穿髓孔处可见牙本质团块成弧形排列，团块周边有丰富的成牙本质细胞 3.3×4
3 讨 论
3.1 从小型猪麻醉下行生物膜直接盖髓后到各实验期处死之间在笼中饲养观察，被实验小型猪进食及日常生活无异常。其中一头猪实验观察期间于3 个月时生出12 头猪仔，这说明使用生物膜直接盖髓没有影响小型猪的生长发育及生理功能，也说明牙髓及根尖周无炎症，在各实验期结束将实验猪处死后观察，无一例牙体变色，粘膜正常，牙周组织正常，无根尖周病变，无窦道，说明实验初步是成功的。
3.2 本实验曾选用家兔牙做直接盖髓术，但由于家兔为啮齿类动物，牙齿磨耗速度极快，未到观察期牙髓腔已被大部磨损，无法观察结果，使实验中途停止。而本实验选用小型猪为实验对象，并取得了良好结果是因为小型猪在组织解剖学、生理学和免疫学等方面与人类有很多相似之处，已在生物学、医学研究中广泛应用[9]。小型猪的牙弓、牙齿、牙根、牙髓腔和
关系、解剖学特点、牙齿组织学表现、牙齿的理化特性与人类有很大的相似性，而且与人牙有相似的组织病理变化，也是一种适于在口腔医学研究中推广应用的实验动物[10]。所以本实验选用了小型猪牙。
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3.3 一种好的盖髓剂应具备促进牙髓组织的修复再生能力，并对牙髓组织无毒性及刺激性等等[5]。本实验的组织切片中表明盖髓后2 周至6 个月在穿髓孔处，有修复性牙本质逐渐形成，从2 周初期粉染的均质物到4 周牙本质团块形成，12 周新生的修复性牙本质中排列较规则的牙本质小管，6 个月的牙本质桥形成，说明了生物膜是具有良好的直接盖髓作用。
3.4 在用生物膜盖髓后各期组织切片中看到修复性牙本质形成的过程中，牙髓一直是正常的，牙髓细胞无炎症、无变性的改变，这也说明生物膜对牙髓组织无毒性、无刺激性，与牙髓组织有相容性。
在对照组4 周的氢氧化钙直接盖髓的组织切片中看到虽然在穿髓孔处有初期钙化的修复性牙本质将穿髓孔封闭，但在牙髓中可见到大量牙髓细胞空泡变性，正如资料中所表明的氢氧化钙可引起牙髓组织炎症及变性[6]。4 周用生物膜直接盖髓组织切片中除有初期钙化的修复性牙本质封闭穿髓孔外并有牙本质团块呈弧形排列，牙髓组织无炎症，无变性，修复速度快。
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3.5 实验中由于麻醉后小型猪的体位为侧卧，所以做直接盖髓时穿髓孔多是开的较大且有出血，但在用实验的生物膜直接盖髓均获得成功，也说明了生物膜直接盖髓的效果是比较好的。
本实验结果提示：含有多糖及胶原蛋白的生物制剂作为盖髓剂有促进牙髓修复性牙本质形成，保存牙髓活力的功能，实验的初步效果进一步推动了该研究项目深入地进行。
参考文献
1 韩永战综述. 用于活髓保存治疗的生物材料. 牙体牙髓牙周学杂志，1994,2(4):121
2 Nakashima M. Dentin induction by implants of autolyzed antigen-extracted allogenie(AAA) dentin on amputatea pulps of dogs. Endol Dent Traumatol, 1989,5:279
, http://www.100md.com
3 Wang EA, Rosen V, Cordes P, et al. Purification and characterization of other distinct bone-inducing factors, Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85:9484
4 温玉麟，赵潇涛. 甲壳质及其衍生物在药物制剂中的应用. 中国海洋药物杂志，1989,1:33
5 屈步华，李德华，吴晴斋. 甲壳胺对二度冻伤治疗作用的初步研究. 中国海洋药物杂志，1993,1:33
6 王满恩, 王嘉德. 牙髓病学的生物学基础. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991.152～157
7 北京农业大学实验动物研究所. 猪模型在生物医学研究中的应用. 北京：北京农业大学出版社，1987.3～15
8 李玉晶, 赵宝荣，葛丽华，等. 小型猪牙系统解剖组织特点. 中华口腔医学杂志，1993,28(4):234
(收稿：1999-04-05 ), http://www.100md.com
单位：北京首都医科大学附属北京口腔医院口腔内科(王 琦 徐爱凤)；口腔组织病理科(王 宁 王凤光 孙 莹 汪育苗)
关键词：多糖类；胶原；雏型猪；修复性牙本质
实用口腔医学杂志990314 〔摘要〕 目的：研究应用多糖(以氨基多糖为主)及胶原蛋白复合生物膜对小型猪牙行直接盖髓术的作用。方法：用多糖及胶原蛋白复合生物膜做小型猪牙的直接盖髓术并与氢氧化钙对照。分别于术后2、4、12 周、6 个月将小型猪快速处死，本文是随机抽样不同时期的4 个对照牙经固定，超声快速脱钙做组织切片，在光镜下观察。结果：4 个术后不同时期的牙在穿髓孔处均有不同程度的修复性牙本质形成。周边造牙本质细胞排列整齐，牙髓无炎症及变性，根髓及牙周组织正常，最终形成牙本质桥将穿髓孔封闭使牙髓保存了活力。结论：实验结果证明了含有多糖及胶原蛋白复合生物膜对小型猪牙有良好的直接盖髓作用，从而推动实验深入进行。
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Direct pulp capping with polysaccharide and collagen protein
biomembrane in mini-pig
Wang Qi, Xu Aifeng, Wang Ning, et al.Beijing Hospital of Stomatology, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050
〔Abstract〕Objective: To study effects of biomembrane compounded with polysaccharide and collagen protein in direct pulp capping in mini-pig. Methods:The pulp of tested teeth of mini-pigs were directly capped with polysaccharide and collagen protein biomembrane and Ca(OH)2 was used as the control. The tested teeth were extracted 2 weeks, 4 weeks, 12 weeks, and 6 months after the operation. The extracted teeth were examined histopathologically.Result:Reparative dentin under the biomembrane in opened area was observed in the tested teeth. The arrangement of odontoblasts was found in line and there was no inflammation. The root pulp and periodontal tissue were normal. Finally the opened area was closed by dentinal bridge. Conclusion:Polysaccharide and collagen protein biomembrane is effective in promoting the formation of reparative dentin.
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Key words Polysaccharides; Collagen; Miniature swine；Reparative dentin
目前国内外很多有关多糖(以氨基多糖醛)及胶原蛋白等各种生长因子的生物制剂在医药领域中广泛研究和应用的报道[1～4]。胶原及其他生物材料。氨基多糖是天然高分子物质，可以和蛋白、碳酸钙紧密结合成为一种络合体[7]，有调节体液平衡，抑制细菌和寄生虫作用，促进伤口愈合，有增强免疫力，促进细胞再生功能，有良好的生物学可溶性，已在外科应用[4,5]。胶原有促进成纤维细胞增殖，诱导硬组织桥形成等作用[1,6]。本实验用含有氨基多糖及胶原蛋白的生物膜作为小型猪牙的直接盖髓剂，取得了意想不到的效果。
1 材料和方法
1.1 本实验用小型猪由北京农业大学实验动物研究所提供，年龄在生后半年至1 年，实验期在我院动物室用标准混合饲料笼养，实验前观察1～2 周待生活习惯稳定、无全身疾病时作为待实验动物。实验当日早晨禁食，实验时用复方氯胺酮注射液按每10 kg体重用1 ml的用量从猪耳后做肌肉注射麻醉，待麻醉后侧卧体位，剪去口周棕毛，用水冲洗，用25g/L 碘酒及体积分数为 75%酒精消毒，用木塞将口张开，做口内消毒并放置吸唾器。全实验过程均无菌操作。
, http://www.100md.com
1.2 实验用多糖胶原蛋白复合生物膜(以下简称生物膜)经制作、除杂质、干燥、消毒，常温保存待用。检查小型猪口腔内牙齿状况为乳牙及恒牙混合牙列，选择无龋坏、无磨耗、牙周正常的牙，用消毒的高速涡轮机钻将小型猪牙开髓，如果出血多，注意止血，穿髓孔大小约0.5～1 mm，用生物膜做直接盖髓，少量氧化锌丁香油糊剂及水门汀垫底后做银汞合金充填；对照组用无菌氢氧化钙粉剂加少量无菌生理盐水调合后做直接盖髓，同样用氧化锌丁香油糊剂及水门汀垫底，银汞合金充填。待小型猪麻醉苏醒后放入动物室笼养。术后观察实验动物进食及日常活动无异常表现，分别在手术后2、4、12 周、6 个月时用心脏直接穿刺放血将小型猪快速处死。
1.3 立即将处死后小型猪实验牙拔下，拔时注意不可拔断，以免牙髓被脱出而移位，放入体积分数为10% 福尔马林液中固定。观察拔下的实验牙均无牙体变色，牙周正常，无瘘管，说明牙髓是活的。
1.4 随机抽取不同盖髓期的4个牙，为2周
(左上第一磨牙)、4周(左上第二前磨牙)、12周(左上第二磨牙)、6个月(左上第一磨牙)及氢氧化钙对照的4周(左上第二磨牙)。用快速超声脱钙后，脱水、包埋、切片、HE 染色，在光镜下观察并用显微摄影作形态学分析。, 百拇医药
2 结 果
2.1
2 周组织切片 见牙髓腔毛细血管充血，纤维细胞增生，周边成牙本质细胞排列整齐，穿髓孔处可见明显的新生粉染均质物质为牙本质。冠髓及根髓组织正常。2.2
4 周组织切片 牙髓腔有毛血管扩张，充血明显，纤维细胞增生，周边成牙本质细胞排列整齐，穿髓孔处可见已形成的牙本质团块，成弧形排列，团块周边有丰富的成牙本质细胞。冠髓及根髓组织正常。2.3
12 周组织切片 牙髓腔内毛细血管扩张，纤维细胞增生，周边成牙本质细胞排列整齐，穿髓孔下方可见新生的牙本质，已有牙本质小管形成，并见大部分不规则的钙化物形成。冠髓及根髓组织正常。, 百拇医药
2.4
6个月组织切片 牙髓腔毛细血管扩张、淤血，髓腔血管周围可见散在的粉染均质物，周边成牙本质细胞排列整齐，穿髓孔下方可见已形成的牙本质桥，近髓腔侧有多量成牙本质细胞形成。冠髓及根髓组织正常。2.5
氢氧化钙盖髓4 周的组织切片 穿髓孔处血块机化，其下方有牙本质基质将穿髓孔封闭，周边有成牙本质细胞形成，牙髓结构基本正常，毛细血管充血扩张，牙髓细胞空泡变性较多。图1
直接盖髓后2 周 可见穿髓孔处明显的新生牙本质基质将穿孔封闭 3.3×4, http://www.100md.com
图2
直接盖髓后4 周 穿髓孔处可见牙本质团块成弧形排列，团块周边有丰富的成牙本质细胞 3.3×43 讨 论
3.1 从小型猪麻醉下行生物膜直接盖髓后到各实验期处死之间在笼中饲养观察，被实验小型猪进食及日常生活无异常。其中一头猪实验观察期间于3 个月时生出12 头猪仔，这说明使用生物膜直接盖髓没有影响小型猪的生长发育及生理功能，也说明牙髓及根尖周无炎症，在各实验期结束将实验猪处死后观察，无一例牙体变色，粘膜正常，牙周组织正常，无根尖周病变，无窦道，说明实验初步是成功的。
3.2 本实验曾选用家兔牙做直接盖髓术，但由于家兔为啮齿类动物，牙齿磨耗速度极快，未到观察期牙髓腔已被大部磨损，无法观察结果，使实验中途停止。而本实验选用小型猪为实验对象，并取得了良好结果是因为小型猪在组织解剖学、生理学和免疫学等方面与人类有很多相似之处，已在生物学、医学研究中广泛应用[9]。小型猪的牙弓、牙齿、牙根、牙髓腔和
关系、解剖学特点、牙齿组织学表现、牙齿的理化特性与人类有很大的相似性，而且与人牙有相似的组织病理变化，也是一种适于在口腔医学研究中推广应用的实验动物[10]。所以本实验选用了小型猪牙。, 百拇医药
3.3 一种好的盖髓剂应具备促进牙髓组织的修复再生能力，并对牙髓组织无毒性及刺激性等等[5]。本实验的组织切片中表明盖髓后2 周至6 个月在穿髓孔处，有修复性牙本质逐渐形成，从2 周初期粉染的均质物到4 周牙本质团块形成，12 周新生的修复性牙本质中排列较规则的牙本质小管，6 个月的牙本质桥形成，说明了生物膜是具有良好的直接盖髓作用。
3.4 在用生物膜盖髓后各期组织切片中看到修复性牙本质形成的过程中，牙髓一直是正常的，牙髓细胞无炎症、无变性的改变，这也说明生物膜对牙髓组织无毒性、无刺激性，与牙髓组织有相容性。
在对照组4 周的氢氧化钙直接盖髓的组织切片中看到虽然在穿髓孔处有初期钙化的修复性牙本质将穿髓孔封闭，但在牙髓中可见到大量牙髓细胞空泡变性，正如资料中所表明的氢氧化钙可引起牙髓组织炎症及变性[6]。4 周用生物膜直接盖髓组织切片中除有初期钙化的修复性牙本质封闭穿髓孔外并有牙本质团块呈弧形排列，牙髓组织无炎症，无变性，修复速度快。
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3.5 实验中由于麻醉后小型猪的体位为侧卧，所以做直接盖髓时穿髓孔多是开的较大且有出血，但在用实验的生物膜直接盖髓均获得成功，也说明了生物膜直接盖髓的效果是比较好的。
本实验结果提示：含有多糖及胶原蛋白的生物制剂作为盖髓剂有促进牙髓修复性牙本质形成，保存牙髓活力的功能，实验的初步效果进一步推动了该研究项目深入地进行。
参考文献
1 韩永战综述. 用于活髓保存治疗的生物材料. 牙体牙髓牙周学杂志，1994,2(4):121
2 Nakashima M. Dentin induction by implants of autolyzed antigen-extracted allogenie(AAA) dentin on amputatea pulps of dogs. Endol Dent Traumatol, 1989,5:279
, http://www.100md.com
3 Wang EA, Rosen V, Cordes P, et al. Purification and characterization of other distinct bone-inducing factors, Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85:9484
4 温玉麟，赵潇涛. 甲壳质及其衍生物在药物制剂中的应用. 中国海洋药物杂志，1989,1:33
5 屈步华，李德华，吴晴斋. 甲壳胺对二度冻伤治疗作用的初步研究. 中国海洋药物杂志，1993,1:33
6 王满恩, 王嘉德. 牙髓病学的生物学基础. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1991.152～157
7 北京农业大学实验动物研究所. 猪模型在生物医学研究中的应用. 北京：北京农业大学出版社，1987.3～15
8 李玉晶, 赵宝荣，葛丽华，等. 小型猪牙
系统解剖组织特点. 中华口腔医学杂志，1993,28(4):234(收稿：1999-04-05 ), http://www.100md.com