骨形成蛋白及其mRNA在成釉细胞瘤中的表达
作者：岳 文 杨连甲 金 岩 董绍忠 朱萧玲 李 鑫
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：骨形成蛋白；成釉细胞瘤；信使RNA
实用口腔医学杂志990302 〔摘要〕 目的：检测成釉细胞瘤中的BMP的表达，探讨成釉细胞瘤的发生及病理机理。方法：采用免疫组化和原位杂交的方法，检测24例成釉细胞瘤标本中BMP蛋白和BMP-2 、-4 mRNA表达。
结果：成釉细胞瘤中的柱状上皮层和星网状细胞层中均有BMP-2 、-4 mRNA和BMP蛋白的表达，BMP-2、-4 mRNA的杂交信号强度在柱状上皮层小于星网状细胞。结论：BMP的表达为探讨成釉细胞瘤的来源提供了分子基础；BMP可能参与了肿瘤病理机理及生物学行为的形成。
Expression of BMP and it's mRNA in ameloblastoma
, http://www.100md.com
Yue Wen, Yang Lianjia, Jin Yan, et al.Dept. of Oral Pathology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective: To study the expression of BMP in ameloblastoma in order to explain the pathogenesis of ameloblastoma. Methods:The expression of BMP and BMP-2 and BMP-4 mRNA was investigated in the specimens of ameloblastoma from 24 cases with immunohistochemical and hybirdization in situ technique.Result:BMP and BMP-2 and BMP-4 mRNA positive reaction was observed in cylindrical epithelium and satellite reticalum cells, the expression of BMP-2 and BMP-4 mRNA in satellite reticalum cells was stronger than that in cylindrical epithelium. Conclusion:BMP may play some roles in the oncogenesis of ameloblastoma.
, 百拇医药
Key words Bone morphogenetic proteins(BMPs); Ameloblastoma; Messenger RNA
成釉细胞瘤是颌骨肿瘤中比较常见的一种，生长具有侵袭性，术后易复发，有少数可以发生恶性变或远处转移。骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, 简称BMPs)除BMP-1外，其它均属于TGF-β超家族。BMP-2 和BMP-4与许多骨肿瘤的临床和预后密切相关，但对于BMP-2、-4在颌骨成釉细胞瘤中的表达及其作用目前还不清楚。本实验应用BMP的单克隆抗体及BMP-2 和BMP-4的cDNA探针，对成釉细胞瘤中的骨形成蛋白进行蛋白和mRNA 水平的检测，以帮助探讨其发生机理及病理机理。
1 材料和方法
1.1 标本来源 所有标本来源于第四军医大学口腔医学院病理科(1996 ～1997 年)，标本总例数为24例。上颌骨标本8例，下颌骨标本16例，平均年龄48岁。标本由体积分数(φ)为10%的福尔马林液固定，常规石蜡包埋，连续组织切片，厚度5 μm。
, 百拇医药
1.2 免疫组化 bBMP-MCAb由本实验室制备，工作浓度为1∶50 ，ABC试剂盒购自Vector公司。常规免疫组化方法染色，DAB显色。设已知有BMP表达的骨肉瘤标本作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 原位杂交
1.3.1 探针的制备 重组质粒PSP64-BMP-2由美国基因研究所Dr Wozney 馈赠，bluescript sk-BMP-4由美国得克萨斯大学Feng Jianquan 教授馈赠。将上述重组质粒转化感受态细胞(PSP64-BMP-2的宿主菌为GM109，bluescript sk-BMP-4的宿主菌为XL1-blue)，经扩增、质粒提取及酶切鉴定后，参照地高辛标记检测试剂盒(德国 Boehringer Mannheim 公司)说明对探针行随机引物法标记。
1.3.2 原位杂交检测 切片经梯度酒精处理入DEPC水及0.1 mol/L的PBS，0.2 mol/L HCl和蛋白酶K处理(20 mg/L)，2g/L的甘氨酸终止反应，40 g/L 的多聚甲醛固定，经0.1 mol/L PBS洗后梯度酒精脱水、室温干燥，探针(2 mg/L)97 ℃变性10 min后杂交(42 ℃，20 h)。切片分别用2×SSC、1×SSC、buffer 1、buffer 3洗，正常羊血清封闭30 min后，以标记碱性磷酸酶的地高辛检测系统检测。实验设去除探针的空白对照和经RNA酶处理的消化对照，阳性对照为经过反复检验的骨肉瘤标本。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 提取质粒DNA酶切鉴定 PSP64-BMP-2由3.0 kb的载体和1.58 kb的BMP-2 cDNA组成，bluescript sk-BMP-4由2.96 kb的载体和1.8 kb的BMP-4 cDNA组成。分别经碱裂解方法提取的质粒DNA经ECORI酶切后得到两个片断，与λDNA/HinIII marker 比较后，确定含有BMP-2和BMP-4的cDNA片断。
2.2 免疫组化检测结果 BMP的阳性反应为胞浆的棕黄色着色或表现为基质黄染。24例成釉细胞瘤中均可见BMP阳性反应，阳性反应位于肿瘤细胞的胞浆中。在滤泡型的肿瘤中，柱状上皮可见较强的BMP阳性反应，星网状层细胞中可见散在的阳性反应细胞(图1)。
图1 免疫组化法，成釉细胞瘤胞浆显示BMP阳性 ×200
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2.3 原位杂交检测结果 BMP-2和BMP-4的杂交阳性标准为细胞浆中的深蓝色的细颗粒。24例原位杂交成釉细胞瘤标本中均可见阳性杂交信号。略去探针的空白对照未见阳性信号，RNA酶消化后阳性信号明显减弱。BMP-2和BMP-4 mRNA阳性信号的分布及强弱基本相似。在滤泡型的肿瘤中，在柱状上皮层细胞及不规则的星网状细胞胞浆中均有BMP-2和BMP-4的mRNA的扩增表达，但阳性杂交信号表达的数量及强度在柱状上皮细胞层低于星网状细胞(图2，3)。纤维组织基质及角化细胞中无阳性信号。
图2 原位杂交法，成釉细胞瘤胞浆显示BMP mRNA阳性 ×400
图3 原位杂交法，星网状细胞胞浆显示BMP mRNA阳性 ×400
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3 讨 论
骨形成蛋白家族为一组形态和功能相近的多肽。Urist在1971年首次提出骨形成蛋白的概念。目前已有16种不同的BMP cDNA被克隆。随着分子生物学的进展，对BMPs家族成员的研究日益深入和扩展〔1，2〕，发现BMP，尤其是BMP-2和BMP-4在胚胎的生长发育、创伤愈合、机体肿瘤的发生发展等过程中起重要作用。BMP-2和BMP-4结构相似，hBMP-2和hBMP-4的DNA编码区为1.19 kb和1.22 kb, 分别编码396 aa 和408 aa的蛋白质。两者的cDNA 3’端有强的同源性，氨基酸有70%同源。BMP-2和BMP-4在机体发育和疾病中作用也是相同的。两者在机体的许多肿瘤中(例如骨肉瘤、骨纤维异常增殖症、唾液腺肿瘤等)有表达，并且影响其临床和预后〔3,4〕。用原位杂交的方法可以检测到骨折后在新的软骨和骨形成早期就有BMP-2和BMP-4 mRNA的表达〔5〕。两者在胚胎鼠的颅盖骨细胞中有较高表达，且其mRNA水平同几种骨母细胞分化的标志(骨钙素、osteopotin、ALP等)是一致的〔6〕。牙胚从蕾状期到钟状期均有BMP蛋白的表达及BMP mRNA(BMP-1、BMP-2、BMP-3)的转录，在成牙本质细胞、成釉细胞呈强阳性表达。
, 百拇医药
关于成釉细胞瘤的来源，普遍认为发生于成釉器或Malassez上皮剩余、缩余釉上皮等牙源性上皮，也有人认为口腔粘膜上皮可增长入颌骨内发展而成。成釉细胞瘤与牙胚的成釉器有许多相似之处，这是成釉细胞瘤起源的形态学基础。作者在成釉细胞瘤中检测到BMP蛋白的表达和mRNA的转录，其表达水平类似于本实验室曾检测到的牙胚中的BMP表达，为探讨成釉细胞瘤的起源奠定了分子基础。
成釉细胞瘤中有BMP mRNA的扩增和蛋白的表达，但并无硬组织的形成。这与其他骨肿瘤病变不同。在骨肉瘤、软骨(肉)瘤、骨纤维异常增殖症中，BMP引起肿瘤中病理性骨质的形成，且其表达与形成的骨量密切相关〔7〕。成釉细胞瘤中BMP-2、-4 mRNA的表达在柱状上皮层中的强度小于其在星网状细胞层，提示可能是由于柱状上皮层中的BMP-2、-4 mRNA的转录受到抑制，从而使其产生硬组织的能力减弱或丧失。另一种可能就是成釉细胞瘤中的BMP的诱骨活性发生了改变。高玉好[8]将成釉细胞瘤组织植入动物，术后4周未见骨组织的形成，而对于骨肉瘤却是可以在体内诱导骨组织的形成，证实了这种可能性的存在。成釉细胞瘤中BMP的改变是否是由于BMP的基因发生了突变而引起的，这种BMP的改变又在成釉细胞瘤的发生和发展规律机理中起了什么作用?正是作者下一步要探讨的问题。
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参考文献
1Kessler E, Takahara K, Biniaminov L,et al. Bone morphogenetic protein-1: The type I procollagen C proteinase. Science，1996,271(5247): 360
2 Hino J, Takao M, Takeshita N, et al.cDNA cloning and genomic structure of human bone morphogenetic protein-3B (BMP-3b). Biochem Biophys Res Commun, 1996,223(2): 304
3 Hatakeyama S, Gao YH, Ohara Nemoto Y, et al. Expression of bone morphogenetic proteins of human neoplastic epithelial cells. Biochem Mol Biol, 1997,42(3): 497
, http://www.100md.com
4 Hatakeyama S, Satoh M, Yoshimura N, et al. Immunocytochemical localization of bone morphogenetic proteins (BMPs) in salivary gland pleomorphic adenoma. J Oral Pathol Med, 1994,23(5): 232
5 司晓辉，金岩，杨连甲.人重组骨形成蛋白2和转化生长因子β复合促进骨折愈合.实用口腔医学杂志,1997,3：166
6 Harris SE, Bonewald LF, Harris MA, et al. Effects of transforming growth factor beta on bone nodule formation and expression of bone morphogenetic protein 2, osteocalcin, osteopontin, alkaline phosphatase, and type I collagen mRNA in long-term cultures of fetal rat calvarial osteoblasts. J Bone Miner Res, 1994, 9(6): 855
7 Yoshikawa H, Shimizu K, Nakase T, et al. Periosteal sunburst spiculation in osteosarcoma. A possible role for bone morphogenetic protein. Clin Orthop, 1994,308: 213
8 高玉好. 成釉细胞瘤分子发生机制：[学位论文]. 西安：第四军医大学口腔医学院,1994
(收稿：1998-04-05修回：1998-08-03), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院病理科 710032
关键词：骨形成蛋白；成釉细胞瘤；信使RNA
实用口腔医学杂志990302 〔摘要〕 目的：检测成釉细胞瘤中的BMP的表达，探讨成釉细胞瘤的发生及病理机理。方法：采用免疫组化和原位杂交的方法，检测24例成釉细胞瘤标本中BMP蛋白和BMP-2 、-4 mRNA表达。
结果：成釉细胞瘤中的柱状上皮层和星网状细胞层中均有BMP-2 、-4 mRNA和BMP蛋白的表达，BMP-2、-4 mRNA的杂交信号强度在柱状上皮层小于星网状细胞。结论：BMP的表达为探讨成釉细胞瘤的来源提供了分子基础；BMP可能参与了肿瘤病理机理及生物学行为的形成。
Expression of BMP and it's mRNA in ameloblastoma
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Yue Wen, Yang Lianjia, Jin Yan, et al.Dept. of Oral Pathology, Stomatological College, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective: To study the expression of BMP in ameloblastoma in order to explain the pathogenesis of ameloblastoma. Methods:The expression of BMP and BMP-2 and BMP-4 mRNA was investigated in the specimens of ameloblastoma from 24 cases with immunohistochemical and hybirdization in situ technique.Result:BMP and BMP-2 and BMP-4 mRNA positive reaction was observed in cylindrical epithelium and satellite reticalum cells, the expression of BMP-2 and BMP-4 mRNA in satellite reticalum cells was stronger than that in cylindrical epithelium. Conclusion:BMP may play some roles in the oncogenesis of ameloblastoma.
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Key words Bone morphogenetic proteins(BMPs); Ameloblastoma; Messenger RNA
成釉细胞瘤是颌骨肿瘤中比较常见的一种，生长具有侵袭性，术后易复发，有少数可以发生恶性变或远处转移。骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, 简称BMPs)除BMP-1外，其它均属于TGF-β超家族。BMP-2 和BMP-4与许多骨肿瘤的临床和预后密切相关，但对于BMP-2、-4在颌骨成釉细胞瘤中的表达及其作用目前还不清楚。本实验应用BMP的单克隆抗体及BMP-2 和BMP-4的cDNA探针，对成釉细胞瘤中的骨形成蛋白进行蛋白和mRNA 水平的检测，以帮助探讨其发生机理及病理机理。
1 材料和方法
1.1 标本来源 所有标本来源于第四军医大学口腔医学院病理科(1996 ～1997 年)，标本总例数为24例。上颌骨标本8例，下颌骨标本16例，平均年龄48岁。标本由体积分数(φ)为10%的福尔马林液固定，常规石蜡包埋，连续组织切片，厚度5 μm。
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1.2 免疫组化 bBMP-MCAb由本实验室制备，工作浓度为1∶50 ，ABC试剂盒购自Vector公司。常规免疫组化方法染色，DAB显色。设已知有BMP表达的骨肉瘤标本作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 原位杂交
1.3.1 探针的制备 重组质粒PSP64-BMP-2由美国基因研究所Dr Wozney 馈赠，bluescript sk-BMP-4由美国得克萨斯大学Feng Jianquan 教授馈赠。将上述重组质粒转化感受态细胞(PSP64-BMP-2的宿主菌为GM109，bluescript sk-BMP-4的宿主菌为XL1-blue)，经扩增、质粒提取及酶切鉴定后，参照地高辛标记检测试剂盒(德国 Boehringer Mannheim 公司)说明对探针行随机引物法标记。
1.3.2 原位杂交检测 切片经梯度酒精处理入DEPC水及0.1 mol/L的PBS，0.2 mol/L HCl和蛋白酶K处理(20 mg/L)，2g/L的甘氨酸终止反应，40 g/L 的多聚甲醛固定，经0.1 mol/L PBS洗后梯度酒精脱水、室温干燥，探针(2 mg/L)97 ℃变性10 min后杂交(42 ℃，20 h)。切片分别用2×SSC、1×SSC、buffer 1、buffer 3洗，正常羊血清封闭30 min后，以标记碱性磷酸酶的地高辛检测系统检测。实验设去除探针的空白对照和经RNA酶处理的消化对照，阳性对照为经过反复检验的骨肉瘤标本。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 提取质粒DNA酶切鉴定 PSP64-BMP-2由3.0 kb的载体和1.58 kb的BMP-2 cDNA组成，bluescript sk-BMP-4由2.96 kb的载体和1.8 kb的BMP-4 cDNA组成。分别经碱裂解方法提取的质粒DNA经ECORI酶切后得到两个片断，与λDNA/HinIII marker 比较后，确定含有BMP-2和BMP-4的cDNA片断。
2.2 免疫组化检测结果 BMP的阳性反应为胞浆的棕黄色着色或表现为基质黄染。24例成釉细胞瘤中均可见BMP阳性反应，阳性反应位于肿瘤细胞的胞浆中。在滤泡型的肿瘤中，柱状上皮可见较强的BMP阳性反应，星网状层细胞中可见散在的阳性反应细胞(图1)。
图1 免疫组化法，成釉细胞瘤胞浆显示BMP阳性 ×200
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2.3 原位杂交检测结果 BMP-2和BMP-4的杂交阳性标准为细胞浆中的深蓝色的细颗粒。24例原位杂交成釉细胞瘤标本中均可见阳性杂交信号。略去探针的空白对照未见阳性信号，RNA酶消化后阳性信号明显减弱。BMP-2和BMP-4 mRNA阳性信号的分布及强弱基本相似。在滤泡型的肿瘤中，在柱状上皮层细胞及不规则的星网状细胞胞浆中均有BMP-2和BMP-4的mRNA的扩增表达，但阳性杂交信号表达的数量及强度在柱状上皮细胞层低于星网状细胞(图2，3)。纤维组织基质及角化细胞中无阳性信号。
图2 原位杂交法，成釉细胞瘤胞浆显示BMP mRNA阳性 ×400
图3 原位杂交法，星网状细胞胞浆显示BMP mRNA阳性 ×400
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3 讨 论
骨形成蛋白家族为一组形态和功能相近的多肽。Urist在1971年首次提出骨形成蛋白的概念。目前已有16种不同的BMP cDNA被克隆。随着分子生物学的进展，对BMPs家族成员的研究日益深入和扩展〔1，2〕，发现BMP，尤其是BMP-2和BMP-4在胚胎的生长发育、创伤愈合、机体肿瘤的发生发展等过程中起重要作用。BMP-2和BMP-4结构相似，hBMP-2和hBMP-4的DNA编码区为1.19 kb和1.22 kb, 分别编码396 aa 和408 aa的蛋白质。两者的cDNA 3’端有强的同源性，氨基酸有70%同源。BMP-2和BMP-4在机体发育和疾病中作用也是相同的。两者在机体的许多肿瘤中(例如骨肉瘤、骨纤维异常增殖症、唾液腺肿瘤等)有表达，并且影响其临床和预后〔3,4〕。用原位杂交的方法可以检测到骨折后在新的软骨和骨形成早期就有BMP-2和BMP-4 mRNA的表达〔5〕。两者在胚胎鼠的颅盖骨细胞中有较高表达，且其mRNA水平同几种骨母细胞分化的标志(骨钙素、osteopotin、ALP等)是一致的〔6〕。牙胚从蕾状期到钟状期均有BMP蛋白的表达及BMP mRNA(BMP-1、BMP-2、BMP-3)的转录，在成牙本质细胞、成釉细胞呈强阳性表达。
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关于成釉细胞瘤的来源，普遍认为发生于成釉器或Malassez上皮剩余、缩余釉上皮等牙源性上皮，也有人认为口腔粘膜上皮可增长入颌骨内发展而成。成釉细胞瘤与牙胚的成釉器有许多相似之处，这是成釉细胞瘤起源的形态学基础。作者在成釉细胞瘤中检测到BMP蛋白的表达和mRNA的转录，其表达水平类似于本实验室曾检测到的牙胚中的BMP表达，为探讨成釉细胞瘤的起源奠定了分子基础。
成釉细胞瘤中有BMP mRNA的扩增和蛋白的表达，但并无硬组织的形成。这与其他骨肿瘤病变不同。在骨肉瘤、软骨(肉)瘤、骨纤维异常增殖症中，BMP引起肿瘤中病理性骨质的形成，且其表达与形成的骨量密切相关〔7〕。成釉细胞瘤中BMP-2、-4 mRNA的表达在柱状上皮层中的强度小于其在星网状细胞层，提示可能是由于柱状上皮层中的BMP-2、-4 mRNA的转录受到抑制，从而使其产生硬组织的能力减弱或丧失。另一种可能就是成釉细胞瘤中的BMP的诱骨活性发生了改变。高玉好[8]将成釉细胞瘤组织植入动物，术后4周未见骨组织的形成，而对于骨肉瘤却是可以在体内诱导骨组织的形成，证实了这种可能性的存在。成釉细胞瘤中BMP的改变是否是由于BMP的基因发生了突变而引起的，这种BMP的改变又在成釉细胞瘤的发生和发展规律机理中起了什么作用?正是作者下一步要探讨的问题。
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参考文献
1Kessler E, Takahara K, Biniaminov L,et al. Bone morphogenetic protein-1: The type I procollagen C proteinase. Science，1996,271(5247): 360
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4 Hatakeyama S, Satoh M, Yoshimura N, et al. Immunocytochemical localization of bone morphogenetic proteins (BMPs) in salivary gland pleomorphic adenoma. J Oral Pathol Med, 1994,23(5): 232
5 司晓辉，金岩，杨连甲.人重组骨形成蛋白2和转化生长因子β复合促进骨折愈合.实用口腔医学杂志,1997,3：166
6 Harris SE, Bonewald LF, Harris MA, et al. Effects of transforming growth factor beta on bone nodule formation and expression of bone morphogenetic protein 2, osteocalcin, osteopontin, alkaline phosphatase, and type I collagen mRNA in long-term cultures of fetal rat calvarial osteoblasts. J Bone Miner Res, 1994, 9(6): 855
7 Yoshikawa H, Shimizu K, Nakase T, et al. Periosteal sunburst spiculation in osteosarcoma. A possible role for bone morphogenetic protein. Clin Orthop, 1994,308: 213
8 高玉好. 成釉细胞瘤分子发生机制：[学位论文]. 西安：第四军医大学口腔医学院,1994
(收稿：1998-04-05修回：1998-08-03), 百拇医药