松质骨基质-骨髓基质成骨细胞复合物的异位成骨作用
作者：陶 凯 毛天球 杨维东 陈富林 顾晓明 陈书军 李媛
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：骨基质；骨髓；成骨细胞
实用口腔医学杂志990521 〔摘要〕 目的：观察松质骨基质-骨髓基质成骨细胞复合移植皮下成骨作用，以探索松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。方法：新生兔骨髓细胞体外培养、诱导后，接种于藻酸盐/松质骨基质中，形成松质骨基质/藻酸盐/骨髓基质成骨细胞复合物，并植入裸鼠背部皮下，对照组单纯植入松质骨基质。 植入4、8周后行X线摄片和组织学检查，观察骨形成情况。结果：松质骨基质/骨髓基质成骨细胞复合物皮下成骨效果明显优于松质骨基质。前者兼有纤维成骨和软骨成骨，以纤维成骨为主；后者仅见少量软骨成骨。结论：松质骨基质可以作为一种良好的骨组织工程支架材料。
Ectopic bone formation by cancellous bone matrix-marrow stromal
, http://www.100md.com
osteoblasts composite
Tao Kai,Mao Tianqiu,Yang Weidong,et al. Stomatologycial College of Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective：To investigate the feasibility of using cancellous bone matrix as scaffolds for bone tissue engineering. Methods: The marrow stromal cells of newborn New Zealand rabbits were cultivated and induced in vitro and then seeded into alginate- cancellous bone matrix to form cancellous bone matrix-alginate-marrow stromal osteoblasts composites. The composites were implanted subcutaneously in nude mice. The cancellous bone matrix alone was implanted as control. The osteogenesis was assessed by histological and roentgenographic analysis. Results: The osteogenesis in the composites was better than that in the cancellous bone matrix. In the composites, both fibrous and cartilaginous osteogenesis were found and the former appeared more obvious. In the control, only slight cartilaginous osteogenesis was found. Conclusion: The cancellous bone matrix can be used as a scaffold material for bone tissue engineering.
, 百拇医药
Key words Bone matrix；Bone marrow；Osteoblasts
骨组织经盐酸脱矿处理形成 脱矿骨基质，移植后可以诱导未分化间充质细胞转化为成骨细胞而发挥骨诱导作用〔1〕，异体移植无明显免疫排斥反应〔2〕。国内外学者将它作为植骨材料进行了大量的实验和临床应用研究〔3〕。组织工程(tissue engineering)的研究进展为脱矿骨基质应用提供了新的思路，即体外分离培养自体细胞，细胞增殖分化后与脱矿骨基质复合，应用于临床修复工作。我们采用藻酸盐凝胶混匀-接种-固化技术，将骨髓基质成骨细胞与松质骨基质复合，植入裸鼠背部皮下，观察其异位成骨作用，并评价松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
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DMEM培养液(Gibco)，胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所)，胰蛋白酶(上海浦东生化试剂厂)，CO2培养箱(美国)，YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置显微镜(Olympus),β-甘油磷酸钠(Sigma)，地塞米松(Sigma)，L-抗坏血酸(Sigma)。
1.2 方法
1.2.1 松质骨基质制备〔4〕 兔髂骨、膝关节取材，去净周围软组织、骨膜及表面软骨，预冷生理盐水冲洗骨髓腔，彻底去除残存骨髓和血块，2.5 g/L胰蛋白酶消化 30 min后，经反复冲洗，然后进行如下处理：(1)25 ℃,1∶1氯仿/甲醇1 h；(2)4 ℃，0.6 mol/L盐酸72 h；(3)4 ℃，2 mol/L氯化钙1 h；(4)4 ℃，0.5 mol/L EDTA 1 h；(5)4 ℃，8 mol/L氯化锂1 h；(6)55 ℃，水浴4 h。每步完成后，均以预冷蒸馏水漂洗3次，每次10 min。标本冻干，环氧乙烷消毒备用。
, 百拇医药
1.2.2 骨髓细胞分离培养 新生新西兰幼兔3只，断头处死，无菌条件下取髂骨、四肢长骨。剪碎，DMEM培养液冲洗，轻轻吹打，取上清以DMEM液(含体积分数10%胎牛血清)进行培养。24 h后换液，去除未贴壁的血细胞。第3 d换液，第5 d换诱导液(DMEM液，含β-甘油磷酸钠10 mmol/L，地塞米松10-7mol/L，抗坏血酸50 mg/L)，使细胞向成骨细胞分化,形成骨髓基质成骨细胞(marrow stromal osteoblast)〔5〕。倒置显微镜下观察细胞生长情况。
1.2.3 骨髓基质成骨细胞接种 骨髓基质成骨细胞融合后以2.5 g/L胰酶消化，细胞计数。细胞与30 g/L海藻酸钠溶液混合(细胞终浓度5×107/ml，海藻酸钠终含量为10 g/L)，充分混匀后接种到冻干松质骨基质上。待松质骨基质润湿膨胀充分后，滴加25 g/L氯化钙，使藻酸盐固化30 min，形成松质骨基质/藻酸盐/骨髓基质成骨细胞复合物。
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1.2.4 实验动物及手术方法 选用裸鼠(BALB/C，雄性，5～6周，22 g)4只，自身对照。无菌条件下，切开裸鼠背部皮肤，潜行分离，于左右皮下分别植入复合物和松质骨基质(对照组)。每个动物每组植入2个标本，缝合皮肤。
1.2.5 观察方法 术后4、8周取材，进行以下观察。
(1)X线摄片 以X线牙片机行标本X线摄片，70 kV垂直投照，暴光时间0.30 s，球管距标本10 cm。
(2)组织学检查 取材标本大体观察后，甲酸/甲酸钠脱钙，脱水，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察新骨形成情况。
2 结 果
2.1 骨髓细胞培养情况
24 h骨髓细胞贴壁，细胞为短梭形、三角形或多角形。生长增殖迅速，7 d融合。
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2.2 X线摄片
复合物皮下植入标本均见X线阻射影，有明显成骨现象。4周时以周边成骨为著，中央有少量成骨。8周时中央亦有明显成骨现象。单纯骨基质皮下植入标本4周时，透光度与周围软组织相似，成骨作用不明显。8周时，边缘有局灶性密度增高影像，提示有少量成骨。
2.3 组织学观察
术后4周，大体观察可见复合物标本硬度明显高于对照组。镜下见复合物表层有类骨组织和新骨形成，成骨细胞较多，兼有纤维成骨和软骨成骨特征(图1)。后者表现为软骨细胞增生、肥大，软骨形成及软骨内骨化。复合物内层亦有散在局灶性编织骨形成。总体观察以纤维成骨为主。单纯骨基质标本仅见少量软骨样组织，提示为软骨成骨早期。
图1 术后4周成骨情况(HE ×40)
, 百拇医药
术后8周，大体观察复合物标本硬度增加，明显高于对照组。镜下见复合物表层及中心部均有新骨形成，以纤维成骨为主(图2)。单纯骨基质标本仅见少量新骨形成，仍为软骨成骨。
图2 术后8周成骨情况(HE ×40)标本切片见骨组织形成
3 讨 论
组织工程是近年来兴起的一项新技术，其核心包括支架材料和细胞两方面。理想的组织工程支架材料应具有生物相容性、生物可降解性、多孔性等特点，以利于细胞粘附、生长、增殖和分化，并形成功能性组织。由于异体松质骨基质具有良好的骨诱导作用和组织相容性，并且具有多孔网状结构，因此有可能成为自体细胞植入的支架。实验结果显示，含骨髓基质成骨细胞的复合物异位成骨作用明显优于单纯骨基质，且随时间延长骨组织形成量增加。从而证实了松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。骨组织由外层向内层逐渐形成，这可能与外层细胞获取营养物质充分及某些因子作用有关。
, 百拇医药
骨髓细胞中含有基质干细胞，可以分化成为成骨细胞。陈富林等〔6〕体外培养骨髓细胞证实其具有体外成骨能力。由于骨髓细胞取材简单，临床上可以通过穿刺获得，创伤小，可反复进行，培养周期短，因此已成为骨组织工程研究中较常用的骨源细胞。我们采用骨髓细胞作为骨源细胞，并体外诱导使其向成骨细胞转化，与松质骨基质复合后，皮下成骨作用明显。同时，以往文献中，骨髓细胞与材料复合方法较多，但是多数方法中骨髓细胞仅贴附于材料表面。我们采用凝胶类材料藻酸盐作为骨髓细胞与松质骨基质复合的载体，采用混匀-接种-固化技术，使骨髓基质成骨细胞充分渗入材料内部。研究结果证实，复合物中央部可见骨组织形成。
松质骨基质/骨髓基质成骨细胞复合物异位成骨作用明显，提示松质骨基质可以作为骨髓成骨细胞的良好载体，它不仅保持脱矿骨基质的活性，而且具有多孔网状结构，可以成为一种良好的骨组织工程支架材料。
本项目由国家自然科学基金(编号 39779762)
, 百拇医药
军队医疗卫生基金(编号98M104)资助
参考文献
1Urist MR. Bone:Formation by autoinduction,Science. 1965,150:893
2 杨维东,丁鸿才,马振国,等. 异体脱矿骨移植的抗原性研究. 实用口腔医学杂志,1991,7(3):131
3 杨维东,马振国,彭品祥,等. 异体脱矿骨移植修复创伤性眶底缺损. 实用口腔医学杂志，1994,10:175
4 孙沫逸,丁鸿才,毛天球,等.同种异体骨基质明胶异位诱导骨形成.华西口腔医学杂志,1991,9(4):254
5 Cheng SL, Yang JW, Rifas L,et al. Differentiation of human marrow osteogenic stromal cells in vivo:Induction of the osteoblast phenotype by dexamethasone. Endocrinology, 1994,134:277
6 陈富林,毛天球,马秦,等.骨髓细胞体外成骨能力的实验研究. 华西口腔医学杂志,1998,16(3):207
(收稿：1999-07-26), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：骨基质；骨髓；成骨细胞
实用口腔医学杂志990521 〔摘要〕 目的：观察松质骨基质-骨髓基质成骨细胞复合移植皮下成骨作用，以探索松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。方法：新生兔骨髓细胞体外培养、诱导后，接种于藻酸盐/松质骨基质中，形成松质骨基质/藻酸盐/骨髓基质成骨细胞复合物，并植入裸鼠背部皮下，对照组单纯植入松质骨基质。 植入4、8周后行X线摄片和组织学检查，观察骨形成情况。结果：松质骨基质/骨髓基质成骨细胞复合物皮下成骨效果明显优于松质骨基质。前者兼有纤维成骨和软骨成骨，以纤维成骨为主；后者仅见少量软骨成骨。结论：松质骨基质可以作为一种良好的骨组织工程支架材料。
Ectopic bone formation by cancellous bone matrix-marrow stromal
, http://www.100md.com
osteoblasts composite
Tao Kai,Mao Tianqiu,Yang Weidong,et al. Stomatologycial College of Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective：To investigate the feasibility of using cancellous bone matrix as scaffolds for bone tissue engineering. Methods: The marrow stromal cells of newborn New Zealand rabbits were cultivated and induced in vitro and then seeded into alginate- cancellous bone matrix to form cancellous bone matrix-alginate-marrow stromal osteoblasts composites. The composites were implanted subcutaneously in nude mice. The cancellous bone matrix alone was implanted as control. The osteogenesis was assessed by histological and roentgenographic analysis. Results: The osteogenesis in the composites was better than that in the cancellous bone matrix. In the composites, both fibrous and cartilaginous osteogenesis were found and the former appeared more obvious. In the control, only slight cartilaginous osteogenesis was found. Conclusion: The cancellous bone matrix can be used as a scaffold material for bone tissue engineering.
, 百拇医药
Key words Bone matrix；Bone marrow；Osteoblasts
骨组织经盐酸脱矿处理形成 脱矿骨基质，移植后可以诱导未分化间充质细胞转化为成骨细胞而发挥骨诱导作用〔1〕，异体移植无明显免疫排斥反应〔2〕。国内外学者将它作为植骨材料进行了大量的实验和临床应用研究〔3〕。组织工程(tissue engineering)的研究进展为脱矿骨基质应用提供了新的思路，即体外分离培养自体细胞，细胞增殖分化后与脱矿骨基质复合，应用于临床修复工作。我们采用藻酸盐凝胶混匀-接种-固化技术，将骨髓基质成骨细胞与松质骨基质复合，植入裸鼠背部皮下，观察其异位成骨作用，并评价松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
DMEM培养液(Gibco)，胎牛血清(浙江金华清湖犊牛利用研究所)，胰蛋白酶(上海浦东生化试剂厂)，CO2培养箱(美国)，YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置显微镜(Olympus),β-甘油磷酸钠(Sigma)，地塞米松(Sigma)，L-抗坏血酸(Sigma)。
1.2 方法
1.2.1 松质骨基质制备〔4〕 兔髂骨、膝关节取材，去净周围软组织、骨膜及表面软骨，预冷生理盐水冲洗骨髓腔，彻底去除残存骨髓和血块，2.5 g/L胰蛋白酶消化 30 min后，经反复冲洗，然后进行如下处理：(1)25 ℃,1∶1氯仿/甲醇1 h；(2)4 ℃，0.6 mol/L盐酸72 h；(3)4 ℃，2 mol/L氯化钙1 h；(4)4 ℃，0.5 mol/L EDTA 1 h；(5)4 ℃，8 mol/L氯化锂1 h；(6)55 ℃，水浴4 h。每步完成后，均以预冷蒸馏水漂洗3次，每次10 min。标本冻干，环氧乙烷消毒备用。
, 百拇医药
1.2.2 骨髓细胞分离培养 新生新西兰幼兔3只，断头处死，无菌条件下取髂骨、四肢长骨。剪碎，DMEM培养液冲洗，轻轻吹打，取上清以DMEM液(含体积分数10%胎牛血清)进行培养。24 h后换液，去除未贴壁的血细胞。第3 d换液，第5 d换诱导液(DMEM液，含β-甘油磷酸钠10 mmol/L，地塞米松10-7mol/L，抗坏血酸50 mg/L)，使细胞向成骨细胞分化,形成骨髓基质成骨细胞(marrow stromal osteoblast)〔5〕。倒置显微镜下观察细胞生长情况。
1.2.3 骨髓基质成骨细胞接种 骨髓基质成骨细胞融合后以2.5 g/L胰酶消化，细胞计数。细胞与30 g/L海藻酸钠溶液混合(细胞终浓度5×107/ml，海藻酸钠终含量为10 g/L)，充分混匀后接种到冻干松质骨基质上。待松质骨基质润湿膨胀充分后，滴加25 g/L氯化钙，使藻酸盐固化30 min，形成松质骨基质/藻酸盐/骨髓基质成骨细胞复合物。
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1.2.4 实验动物及手术方法 选用裸鼠(BALB/C，雄性，5～6周，22 g)4只，自身对照。无菌条件下，切开裸鼠背部皮肤，潜行分离，于左右皮下分别植入复合物和松质骨基质(对照组)。每个动物每组植入2个标本，缝合皮肤。
1.2.5 观察方法 术后4、8周取材，进行以下观察。
(1)X线摄片 以X线牙片机行标本X线摄片，70 kV垂直投照，暴光时间0.30 s，球管距标本10 cm。
(2)组织学检查 取材标本大体观察后，甲酸/甲酸钠脱钙，脱水，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察新骨形成情况。
2 结 果
2.1 骨髓细胞培养情况
24 h骨髓细胞贴壁，细胞为短梭形、三角形或多角形。生长增殖迅速，7 d融合。
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2.2 X线摄片
复合物皮下植入标本均见X线阻射影，有明显成骨现象。4周时以周边成骨为著，中央有少量成骨。8周时中央亦有明显成骨现象。单纯骨基质皮下植入标本4周时，透光度与周围软组织相似，成骨作用不明显。8周时，边缘有局灶性密度增高影像，提示有少量成骨。
2.3 组织学观察
术后4周，大体观察可见复合物标本硬度明显高于对照组。镜下见复合物表层有类骨组织和新骨形成，成骨细胞较多，兼有纤维成骨和软骨成骨特征(图1)。后者表现为软骨细胞增生、肥大，软骨形成及软骨内骨化。复合物内层亦有散在局灶性编织骨形成。总体观察以纤维成骨为主。单纯骨基质标本仅见少量软骨样组织，提示为软骨成骨早期。
图1 术后4周成骨情况(HE ×40)
, 百拇医药
术后8周，大体观察复合物标本硬度增加，明显高于对照组。镜下见复合物表层及中心部均有新骨形成，以纤维成骨为主(图2)。单纯骨基质标本仅见少量新骨形成，仍为软骨成骨。
图2 术后8周成骨情况(HE ×40)标本切片见骨组织形成
3 讨 论
组织工程是近年来兴起的一项新技术，其核心包括支架材料和细胞两方面。理想的组织工程支架材料应具有生物相容性、生物可降解性、多孔性等特点，以利于细胞粘附、生长、增殖和分化，并形成功能性组织。由于异体松质骨基质具有良好的骨诱导作用和组织相容性，并且具有多孔网状结构，因此有可能成为自体细胞植入的支架。实验结果显示，含骨髓基质成骨细胞的复合物异位成骨作用明显优于单纯骨基质，且随时间延长骨组织形成量增加。从而证实了松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。骨组织由外层向内层逐渐形成，这可能与外层细胞获取营养物质充分及某些因子作用有关。
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骨髓细胞中含有基质干细胞，可以分化成为成骨细胞。陈富林等〔6〕体外培养骨髓细胞证实其具有体外成骨能力。由于骨髓细胞取材简单，临床上可以通过穿刺获得，创伤小，可反复进行，培养周期短，因此已成为骨组织工程研究中较常用的骨源细胞。我们采用骨髓细胞作为骨源细胞，并体外诱导使其向成骨细胞转化，与松质骨基质复合后，皮下成骨作用明显。同时，以往文献中，骨髓细胞与材料复合方法较多，但是多数方法中骨髓细胞仅贴附于材料表面。我们采用凝胶类材料藻酸盐作为骨髓细胞与松质骨基质复合的载体，采用混匀-接种-固化技术，使骨髓基质成骨细胞充分渗入材料内部。研究结果证实，复合物中央部可见骨组织形成。
松质骨基质/骨髓基质成骨细胞复合物异位成骨作用明显，提示松质骨基质可以作为骨髓成骨细胞的良好载体，它不仅保持脱矿骨基质的活性，而且具有多孔网状结构，可以成为一种良好的骨组织工程支架材料。
本项目由国家自然科学基金(编号 39779762)
, 百拇医药
军队医疗卫生基金(编号98M104)资助
参考文献
1Urist MR. Bone:Formation by autoinduction,Science. 1965,150:893
2 杨维东,丁鸿才,马振国,等. 异体脱矿骨移植的抗原性研究. 实用口腔医学杂志,1991,7(3):131
3 杨维东,马振国,彭品祥,等. 异体脱矿骨移植修复创伤性眶底缺损. 实用口腔医学杂志，1994,10:175
4 孙沫逸,丁鸿才,毛天球,等.同种异体骨基质明胶异位诱导骨形成.华西口腔医学杂志,1991,9(4):254
5 Cheng SL, Yang JW, Rifas L,et al. Differentiation of human marrow osteogenic stromal cells in vivo:Induction of the osteoblast phenotype by dexamethasone. Endocrinology, 1994,134:277
6 陈富林,毛天球,马秦,等.骨髓细胞体外成骨能力的实验研究. 华西口腔医学杂志,1998,16(3):207
(收稿：1999-07-26), 百拇医药