以合成水凝胶为载体建造可注射性软骨
作者：杨维东 陈富林 毛天球 顾晓明 李石保 陶凯 陈书军
单位：西安第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032
关键词：组织工程；软骨；聚合物；水凝胶
实用口腔医学杂志990519 〔摘要〕 目的：应用组织工程学原理，采用温度固化型合成水凝胶作为可注射用软骨的细胞载体，观察软骨的形成情况。方法：从兔耳中分离获取软骨细胞，将软骨细胞与水凝胶溶液混合，混合液的软骨细胞的浓度为50×106/ ml，注射于裸鼠背部皮下组织中，在室温下合成水凝胶由液态变为固态，包被软骨细胞于水凝胶体中。注射后4、8周取材，通过大体标本观察、组织学观察软骨的形成情况。结果：注射后4周在皮下形成稍硬的结节，8周时形成的结节质地坚韧，切面色泽亮白。组织学观察，4周标本中即有软骨形成，但不成熟，8周标本中有成熟软骨形成，番红O染色呈强阳性。结论：温度固化型合成水凝胶作为软骨细胞载体，可以通过注射的方法建造可注射性软骨，具有广阔的应用前景。
, 百拇医药
Fabrication of cartilage with injectable synthetic hydrogel
Yang Weidong, Chen Fulin, Mao Tianqiu,et al. Stomatologyical college，Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To observe chondrogenesis using temperature dependent synthetic hydrogel as the carrier of chondrocytes isolated from rabbit's ears. Methods: Chondrocytes were harvested by typeⅡcollagenase digestion from rabit's ears. The cells were mixed with synthetic hydrogel in liquid state, and then the chondrocytes/hydrogel composition was injected into the dorsal subcutaneous tissue of athymic mice. The chondrongenesis was studied histologicaly for 8 weeks. Results: 4 weeks after injection, the hard nubble was formed subcutaneously and immatural cartilage was observed.8 weeks after injection mutural cartilage with strong GAG expression was observed.Conclusion: Neocartilage could be regenerated through the injection of synthetic hydrogel mixed with chondrocytes.
, 百拇医药
Key words Tissue engineering;Cartilage;Polymer;Hydrogel
软骨器官和结构常因先天性和获得性因素引起畸形和缺损。这些疾病在治疗上主要考虑两个问题：其一是选择理想的修复材料；其二是选择创伤小而修复效果好的治疗方法。然而，目前在材料的理想性和适用性方面还远未达到所希望的目标。
软骨移植是治疗软骨缺损或畸形的重要方法。在材料的选择上，由于异体和异种软骨尚未解决其移植免疫和细胞活性之间的矛盾，自体软骨仍作为首选材料。随着组织工程的发展，现已能够成功地建造自体软骨组织〔1,2〕。然而，在未来的可适用性上，可注射性软骨具有降低手术难度、减少手术创伤等优点，故特别适用于颌面整形外科、骨科等相关学科〔3,4〕。本实验拟通过组织工程的方法，应用温度固化型合成水凝胶为软骨细胞载体，研究建造可注射性组织工程软骨。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 新西兰兔、裸鼠(第四军医大学实验动物研究中心)。
1.1.2 温度固化型合成水凝胶(第四军医大学化学教研室与口腔医学院生物材料室合成)。
1.1.3 Ⅱ型胶原酶(Sigma), DMEM培养液(Gibco), 胎牛血清(浙江清湖犊牛利用研究所)
1.2 方法
1.2.1 温度固化型合成水凝胶的制备及特性 使聚氧化乙烯和聚氧化丙烯发生聚合反应，形成聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO)，并对化学键进行修饰，再与丙二醇和水混合，在真空条件下加热促溶。最终使该聚合物在6 ℃以下为牛顿流体， 17 ℃以上为凝胶。消毒后备用。
, 百拇医药
1.2.2 兔耳软骨细胞的分离和收集 见参考文献〔5〕
1.2.3 软骨细胞/合成水凝胶复合物的形成 在4℃条件下将分离收集的软骨细胞与250 g/L的合成水凝胶充分混合，使软骨细胞的最终浓度为50×106 /ml。在4 ℃条件下暂存备用。
1.2.4 软骨细胞/合成水凝胶复合物的注射 通过12号针头快速将软骨细胞/合成水凝胶复合物注射于3只裸鼠背部皮下组织，每个点注射0.3 ml作为实验组。以单纯注射合成水凝胶和相同浓度的软骨细胞悬液作为对照。
1.2.5 取材与观察 分别于注射后4、8周取材，通过大体标本观察、HE染色、番红 O染色观察软骨的形成和成熟情况。
2 结 果
2.1 大体标本观察 注射后 4 周标本，为皮下组织内的结节，质地稍硬。注射后8周的标本质地坚韧，周围有薄的包膜，剖面为亮白色，与正常软骨相似。软骨细胞悬液注射组也可见软骨样组织形成，但明显小于实验组。单纯注射合成水凝胶组未见软骨组织形成迹象。
, 百拇医药
2.2 组织学观察 HE染色结果显示，注射后4周标本，局部有大量成活的软骨细胞，可见类软骨组织，番红 O染色呈现弱阳性，表明软骨基质中糖胺多糖的成分较少，形成的软骨还不成熟。注射后8周标本，HE染色可见大量的软骨细胞位于陷窝内(图1)，材料已 被大部分吸收，组织结构类似正常软骨组织，番红O染色为强阳性(图2)，表明形成了 成熟的软骨。细胞悬液注射组也可见软骨形成，但软骨形成量明显少于复合物注射组。 单纯注射聚氧化乙烯水凝胶的标本中未见软骨形成。
图1 注射后8周形成的软骨组织(HE ×40)
图2 注射后8周形成的软骨基质(番红-O×40)
3 讨 论
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3.1 可注射性材料的研究
可注射性材料的研究已有近100年的历史，但结果并不令人满意。以液体硅胶为代表的非生物可注射性充填材料自1965年由美国食品及药物管理局(FDA)批准有限制地试用于人体后，却在全世界尤其是亚洲大范围的应用。随之发现大量病例出现局部肿胀、炎症及肉芽肿反应、注射物移位、局部溃疡等，造成灾难性的后果〔6〕。尽管目前美国FDA已不批准使用液体硅胶类材料，但仍有一些国家还在使用改良的液体硅胶，这说明可注射性充填材料不论是对医生或患者都具有很大的吸引力〔6〕。对于生物性可注射性充填材料也同样令人失望。异体和异种胶原基质和自体脂肪容易被吸收，同时胶原基质类产品有时可引起宿主的免疫反应，故不能认为是有前途的可注射性充填材料〔6，7〕。然而，随着组织工程学的发展，使研制和提供理想的可注射性充填及修复材料将成为可能。
3.2 可注射性软骨的研究
, 百拇医药
可注射性软骨研究的重点在于载体材料的研究。自Atala〔3〕首次将可注射性组织工程软骨应用于泌尿外科研究领域以来，来源于自然的可注射性载体材料(主要为胶原类、海藻酸盐及甲壳素等)被积极用于研究。由于自然材料的品质缺乏稳定性，并存在一定的免疫原性，故研制合成载体材料成为一种方向〔8〕。
Sims等〔8,9〕证实聚氧化乙烯是一种具有良好的生物相容性的可降解材料，将软骨细胞混悬于聚氧乙烯中注射于动物皮下，可形成软骨组织。但聚氧化乙烯的最大缺点是不易注射又缺乏固化特性。聚氧化丙烯同样具有良好的生物相容性，本实验借鉴药物缓释载体的研究成果〔7,9〕，合成聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，制备应用于组织工程的温度固化型合成水凝胶。该种水凝胶当高于临界温度时，溶解度降低，使被分散物质从溶液中以“胶体分散状态”析出，通过整个溶液形成连续的网状结构即水凝胶。此时软骨细胞被包埋于网状结构中，可以与周围体液自由交换营养及代谢物质。实验结果证实依据该聚合物的化学结构特点建造组织工程软骨是可行的。
, 百拇医药
3.3 可注射性软骨的研究方向
虽然本研究在裸鼠体内完成了可注射性组织工程软骨的建造，但仍留有许多研究的空白点，例如可注射性软骨在正常免疫功能动物体内的状况、组织工程软骨的特点和软骨组织的修复能力等。可注射性软骨最重要的价值在于低创伤的修复作用，因此根据不同临床专业的特点，研制不同固化特性的载体材料和相对应的注射及固化工具将成为向临床过渡所必需经历的研究过程。
4 结 论
可注射性软骨具有广泛的临床应用前景。本研究采用具有良好生物相容性的聚氧化乙烯和聚氧化丙烯合成温度固化型合成水凝胶，应用组织工程方法在裸鼠体内完成了可注射性软骨的建造，证实聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物是一种有前途的载体材料，可以进一步应用于可注射性组织工程软骨的研究。
本项目由国家自然科学基金(编号39770762)和军队医药卫生科研基金(编号98M104)资助
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参考文献
1Aigner J, Tegeler J, Hutzler P, et al. Cartilage tissue engineering with novel nonwoven structured biomaterial based on hyaluronic acid benzyl ester.J Biomater Mater Res, 1998,42:172
2 Rotter L. Tissue Engineering: A new field and its challenges.Pharm Research,1997,14(7):840
3 Atala A. Tissue engineering in urologic surgery. Urol Clin North Am, 1998,25(1):39
, 百拇医药
4 Paige KT, Cima LG, Yaremchuk MJ, et al. Injectable Cartilage. Plast Reconstr Surg, 1995,96(6)：1390
5 杨维东,陈富林,陶凯,等.兔动物模型在组织工程骨、软骨研究中的应用.实用口腔医学杂志,1999,15(5):375
6 Mak K, Toriumi DM. Injectable filler materials for Soft-tissue augmentation. Otolaryngol Clin North Am, 1994,27(1):211
7 Friess W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharmac Biopharmac,1998,45:113
, http://www.100md.com
8 Sims CD, Peter EM, Butler MD, et al. Injectable cartilage using polyethylene oxide polymer substrates. Plast Reconstr Surg, 1996,98(5):843
9 Han DK, Hubbell JA. Synthesis of polymer network scaffolds from L-lactide and poly(ethylene glycol) and their interaction with cells. Macromolecules, 1997,30:6077
(收稿：1999-07-26), 百拇医药
单位：西安第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科 710032
关键词：组织工程；软骨；聚合物；水凝胶
实用口腔医学杂志990519 〔摘要〕 目的：应用组织工程学原理，采用温度固化型合成水凝胶作为可注射用软骨的细胞载体，观察软骨的形成情况。方法：从兔耳中分离获取软骨细胞，将软骨细胞与水凝胶溶液混合，混合液的软骨细胞的浓度为50×106/ ml，注射于裸鼠背部皮下组织中，在室温下合成水凝胶由液态变为固态，包被软骨细胞于水凝胶体中。注射后4、8周取材，通过大体标本观察、组织学观察软骨的形成情况。结果：注射后4周在皮下形成稍硬的结节，8周时形成的结节质地坚韧，切面色泽亮白。组织学观察，4周标本中即有软骨形成，但不成熟，8周标本中有成熟软骨形成，番红O染色呈强阳性。结论：温度固化型合成水凝胶作为软骨细胞载体，可以通过注射的方法建造可注射性软骨，具有广阔的应用前景。
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Fabrication of cartilage with injectable synthetic hydrogel
Yang Weidong, Chen Fulin, Mao Tianqiu,et al. Stomatologyical college，Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
〔Abstract〕Objective:To observe chondrogenesis using temperature dependent synthetic hydrogel as the carrier of chondrocytes isolated from rabbit's ears. Methods: Chondrocytes were harvested by typeⅡcollagenase digestion from rabit's ears. The cells were mixed with synthetic hydrogel in liquid state, and then the chondrocytes/hydrogel composition was injected into the dorsal subcutaneous tissue of athymic mice. The chondrongenesis was studied histologicaly for 8 weeks. Results: 4 weeks after injection, the hard nubble was formed subcutaneously and immatural cartilage was observed.8 weeks after injection mutural cartilage with strong GAG expression was observed.Conclusion: Neocartilage could be regenerated through the injection of synthetic hydrogel mixed with chondrocytes.
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Key words Tissue engineering;Cartilage;Polymer;Hydrogel
软骨器官和结构常因先天性和获得性因素引起畸形和缺损。这些疾病在治疗上主要考虑两个问题：其一是选择理想的修复材料；其二是选择创伤小而修复效果好的治疗方法。然而，目前在材料的理想性和适用性方面还远未达到所希望的目标。
软骨移植是治疗软骨缺损或畸形的重要方法。在材料的选择上，由于异体和异种软骨尚未解决其移植免疫和细胞活性之间的矛盾，自体软骨仍作为首选材料。随着组织工程的发展，现已能够成功地建造自体软骨组织〔1,2〕。然而，在未来的可适用性上，可注射性软骨具有降低手术难度、减少手术创伤等优点，故特别适用于颌面整形外科、骨科等相关学科〔3,4〕。本实验拟通过组织工程的方法，应用温度固化型合成水凝胶为软骨细胞载体，研究建造可注射性组织工程软骨。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 新西兰兔、裸鼠(第四军医大学实验动物研究中心)。
1.1.2 温度固化型合成水凝胶(第四军医大学化学教研室与口腔医学院生物材料室合成)。
1.1.3 Ⅱ型胶原酶(Sigma), DMEM培养液(Gibco), 胎牛血清(浙江清湖犊牛利用研究所)
1.2 方法
1.2.1 温度固化型合成水凝胶的制备及特性 使聚氧化乙烯和聚氧化丙烯发生聚合反应，形成聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO)，并对化学键进行修饰，再与丙二醇和水混合，在真空条件下加热促溶。最终使该聚合物在6 ℃以下为牛顿流体， 17 ℃以上为凝胶。消毒后备用。
, 百拇医药
1.2.2 兔耳软骨细胞的分离和收集 见参考文献〔5〕
1.2.3 软骨细胞/合成水凝胶复合物的形成 在4℃条件下将分离收集的软骨细胞与250 g/L的合成水凝胶充分混合，使软骨细胞的最终浓度为50×106 /ml。在4 ℃条件下暂存备用。
1.2.4 软骨细胞/合成水凝胶复合物的注射 通过12号针头快速将软骨细胞/合成水凝胶复合物注射于3只裸鼠背部皮下组织，每个点注射0.3 ml作为实验组。以单纯注射合成水凝胶和相同浓度的软骨细胞悬液作为对照。
1.2.5 取材与观察 分别于注射后4、8周取材，通过大体标本观察、HE染色、番红 O染色观察软骨的形成和成熟情况。
2 结 果
2.1 大体标本观察 注射后 4 周标本，为皮下组织内的结节，质地稍硬。注射后8周的标本质地坚韧，周围有薄的包膜，剖面为亮白色，与正常软骨相似。软骨细胞悬液注射组也可见软骨样组织形成，但明显小于实验组。单纯注射合成水凝胶组未见软骨组织形成迹象。
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2.2 组织学观察 HE染色结果显示，注射后4周标本，局部有大量成活的软骨细胞，可见类软骨组织，番红 O染色呈现弱阳性，表明软骨基质中糖胺多糖的成分较少，形成的软骨还不成熟。注射后8周标本，HE染色可见大量的软骨细胞位于陷窝内(图1)，材料已 被大部分吸收，组织结构类似正常软骨组织，番红O染色为强阳性(图2)，表明形成了 成熟的软骨。细胞悬液注射组也可见软骨形成，但软骨形成量明显少于复合物注射组。 单纯注射聚氧化乙烯水凝胶的标本中未见软骨形成。
图1 注射后8周形成的软骨组织(HE ×40)
图2 注射后8周形成的软骨基质(番红-O×40)
3 讨 论
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3.1 可注射性材料的研究
可注射性材料的研究已有近100年的历史，但结果并不令人满意。以液体硅胶为代表的非生物可注射性充填材料自1965年由美国食品及药物管理局(FDA)批准有限制地试用于人体后，却在全世界尤其是亚洲大范围的应用。随之发现大量病例出现局部肿胀、炎症及肉芽肿反应、注射物移位、局部溃疡等，造成灾难性的后果〔6〕。尽管目前美国FDA已不批准使用液体硅胶类材料，但仍有一些国家还在使用改良的液体硅胶，这说明可注射性充填材料不论是对医生或患者都具有很大的吸引力〔6〕。对于生物性可注射性充填材料也同样令人失望。异体和异种胶原基质和自体脂肪容易被吸收，同时胶原基质类产品有时可引起宿主的免疫反应，故不能认为是有前途的可注射性充填材料〔6，7〕。然而，随着组织工程学的发展，使研制和提供理想的可注射性充填及修复材料将成为可能。
3.2 可注射性软骨的研究
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可注射性软骨研究的重点在于载体材料的研究。自Atala〔3〕首次将可注射性组织工程软骨应用于泌尿外科研究领域以来，来源于自然的可注射性载体材料(主要为胶原类、海藻酸盐及甲壳素等)被积极用于研究。由于自然材料的品质缺乏稳定性，并存在一定的免疫原性，故研制合成载体材料成为一种方向〔8〕。
Sims等〔8,9〕证实聚氧化乙烯是一种具有良好的生物相容性的可降解材料，将软骨细胞混悬于聚氧乙烯中注射于动物皮下，可形成软骨组织。但聚氧化乙烯的最大缺点是不易注射又缺乏固化特性。聚氧化丙烯同样具有良好的生物相容性，本实验借鉴药物缓释载体的研究成果〔7,9〕，合成聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，制备应用于组织工程的温度固化型合成水凝胶。该种水凝胶当高于临界温度时，溶解度降低，使被分散物质从溶液中以“胶体分散状态”析出，通过整个溶液形成连续的网状结构即水凝胶。此时软骨细胞被包埋于网状结构中，可以与周围体液自由交换营养及代谢物质。实验结果证实依据该聚合物的化学结构特点建造组织工程软骨是可行的。
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3.3 可注射性软骨的研究方向
虽然本研究在裸鼠体内完成了可注射性组织工程软骨的建造，但仍留有许多研究的空白点，例如可注射性软骨在正常免疫功能动物体内的状况、组织工程软骨的特点和软骨组织的修复能力等。可注射性软骨最重要的价值在于低创伤的修复作用，因此根据不同临床专业的特点，研制不同固化特性的载体材料和相对应的注射及固化工具将成为向临床过渡所必需经历的研究过程。
4 结 论
可注射性软骨具有广泛的临床应用前景。本研究采用具有良好生物相容性的聚氧化乙烯和聚氧化丙烯合成温度固化型合成水凝胶，应用组织工程方法在裸鼠体内完成了可注射性软骨的建造，证实聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物是一种有前途的载体材料，可以进一步应用于可注射性组织工程软骨的研究。
本项目由国家自然科学基金(编号39770762)和军队医药卫生科研基金(编号98M104)资助
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参考文献
1Aigner J, Tegeler J, Hutzler P, et al. Cartilage tissue engineering with novel nonwoven structured biomaterial based on hyaluronic acid benzyl ester.J Biomater Mater Res, 1998,42:172
2 Rotter L. Tissue Engineering: A new field and its challenges.Pharm Research,1997,14(7):840
3 Atala A. Tissue engineering in urologic surgery. Urol Clin North Am, 1998,25(1):39
, 百拇医药
4 Paige KT, Cima LG, Yaremchuk MJ, et al. Injectable Cartilage. Plast Reconstr Surg, 1995,96(6)：1390
5 杨维东,陈富林,陶凯,等.兔动物模型在组织工程骨、软骨研究中的应用.实用口腔医学杂志,1999,15(5):375
6 Mak K, Toriumi DM. Injectable filler materials for Soft-tissue augmentation. Otolaryngol Clin North Am, 1994,27(1):211
7 Friess W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharmac Biopharmac,1998,45:113
, http://www.100md.com
8 Sims CD, Peter EM, Butler MD, et al. Injectable cartilage using polyethylene oxide polymer substrates. Plast Reconstr Surg, 1996,98(5):843
9 Han DK, Hubbell JA. Synthesis of polymer network scaffolds from L-lactide and poly(ethylene glycol) and their interaction with cells. Macromolecules, 1997,30:6077
(收稿：1999-07-26), 百拇医药