转化生长因子-β受体在人牙髓中的表达和意义
作者：张 莹 张 郁 金 岩
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：转化生长因子-β受体；牙髓；免疫组织化学
实用口腔医学杂志990513 〔摘要〕 目的：探讨转化生长因子β受体在人牙髓中的表达和牙髓细胞对TGF-β作用的反应机理。方法：用免疫组化方法检测转化生长因子βⅠ型受体(TβR-I)和Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)在健康及龋坏人牙髓中的表达。结果：转化生长因子-βⅠ型受体和Ⅱ型受体在成牙本质细胞层强阳性表达，其中Ⅰ型受体较Ⅱ型受体表达量多，两种受体在成牙本质细胞层下方的富细胞区及中心部牙髓有表达或弱表达，龋坏牙髓与正常牙髓有相同的反应模式。结论：转化生长因子-βⅠ型和Ⅱ型受体在健康及龋坏人牙成牙本质细胞及牙髓其它细胞皆有表达，提示成牙本质细胞及牙髓其它细胞在牙髓损伤修复过程中具有重要作用。
The expression of TGF-β receptors in human pulp cells
, 百拇医药
Zhang Ying, Zhang Yu, Jin Yan.Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstraot〕Objective:To observe the expression of TGF-β receptor (TβR) in human pulpal cells.Method:TβR-I and TβR-Ⅱ in healthy and carious human dental pulp were examined with immunohistochemical technique.Results:Strong specific staining for both receptor I and Ⅱ was observed,and more recepter Ⅰ was found in the odontoblasts of healthy teeth. Less receptor I and Ⅱ expression was observed in the cell rich layer underlying the odontoblasts. Similar pattern of staining was observed in the pulp from carious teeth.Conclusion:TβR-I and -Ⅱ were expressed in odontoblasts as well as other pulp cells in both health and clisease mature human molar teeth Such findings may be important in the response of these cells after tissue injury.
, 百拇医药
Key words Transforming growth factor beta receptors;Dental pulp; Immunohistochemistry
转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一族具有多种生物学功能的细胞因子，对许多器官和组织的生长和分化起着重要作用，能刺激或抑制多种细胞的增殖，在创伤愈合、胚胎发育、细胞外基质形成、骨的重建、免疫调节以及神经系统的发育等过程中发挥重要作用。TGF-β参与牙髓损伤修复过程逐渐得到人们的关注，国内外已有TGF-β直接盖髓成功的报道〔1、2〕。有关TGF-β参与损伤修复的机理研究较少。本实验的目的是探讨TGF-β受体在健康及龋坏人牙髓中的表达和TGF-β参与牙髓损伤修复的作用机理。
1 材料与方法
1.1 标本制备
, 百拇医药
收集口腔颌面外科门诊患者因治疗需要拔除的健康第三磨牙10个，龋坏牙根据龋坏程度分为三度，I度为牙釉质龋，Ⅱ度为牙本质浅龋，Ⅲ度为牙本质深龋尚未露髓(包括牙颈部龋)各10个，患者年龄在20～40岁之间，牙齿拔除后立即穿通髓角。用40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，制备2 mm厚牙齿磨片，继续固定24 h。甲酸甲酸钠脱钙液4 ℃下脱钙两周左右，常规脱水，石蜡包埋，制备5 μm厚连续切片。
1.2 主要试剂
TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体多克隆抗体(博士德公司)，SP试剂盒(美国Zymed公司)，DAB试剂盒(中山公司)
1.3 免疫组化染色
采用SP法，切片脱蜡至水，体积分数为0.3%过氧化氢液室温下孵育10 min以消除内源性过氧化物酶，1 g/L胰蛋白酶消化15 min，正常羊血清孵育30 min，滴加一抗(工作液)，4 ℃湿盒过夜，37 ℃复温1 h，滴加生物素化二抗(1∶100)37 ℃孵育30 min，酶结合物(1∶100) 37 ℃孵育30 min，DAB显微镜下控制显色。上述各步之后均用0.01 mol/L PBS振洗3次，每次5 min。阳性对照，乳腺癌组织。阴性对照用PBS代替一抗，常规脱水，二甲苯透明，封片。
, 百拇医药
2 结 果
TGF-β I型和Ⅱ型受体的染色阳性部位在细胞膜和细胞浆，深棕色为强阳性，棕色为阳性，浅黄色为弱阳性。健康人恒牙TGF-β I型受体在成牙本质细胞层呈强阳性表达(图1)，在成牙本质细胞层下方的富细胞区呈阳性 (图2)，牙髓中间部细胞为弱阳性 (图3)，TGF-β Ⅱ型受体与I型受体染色相同，表达较弱(图4)。牙釉质龋和牙本质浅龋TGF-β I型受体和Ⅱ型受体表达与健康人恒牙染色结果一致(图5)，牙本质深龋下方的成牙本质细胞大多破坏，周围残留的成牙本质细胞和牙髓细胞染色也与正常人牙相同。
图1 TGF-β I型受体在健康人牙髓成牙本质
细胞呈强阳性 40×
, 百拇医药
图2 TGF-β I型受体在健康人牙髓富细胞区呈阳性 40×
图3 TGF-β I型受体在健康人牙髓中间部细胞为弱阳性 40×
图4 TGF-βⅡ型受体在健康人牙髓成牙本质细胞呈强阳性，其下方的牙髓细胞呈弱阳性 40×
图5 TGF-βⅡ型受体在牙本质浅龋中的成牙本质细胞呈强阳性 40×
3 讨 论
转化生长因子-β超家族成员包括5种TGF-β(β 1～β 5)和其它类似物，在哺乳动物中主要包括TGF-β 1～β 3。TGF-βs在牙髓损伤修复过程中具有重要作用。Cassidy等〔3〕报道在人牙本质中的EDTA和胶原酶溶解液中含有TGF-β 1，提示牙本质基质中含有TGF-β 1，牙体损伤后(如龋坏、酸蚀、磨损等)可以释放出来作用于成牙本质细胞，参与反应性牙本质形成。Tziafas〔1〕用浸有TGF-β 1的微孔滤膜置于暴露的狗磨牙牙髓42 d后发现有一厚层管样牙本质基质形成并衬有一层高柱状的极化细胞；未用TGF-β抗体中和的脱矿或未脱矿牙本质盖髓可以诱异管状牙本质形成并衬有极化的成牙本质细胞样的细胞；而用TGF-β抗体中和的脱矿牙本质盖髓则完全丧失了诱导活性，未脱矿牙本质只能形成纤维样牙本质，说明TGF-β 1对修复性牙本质的形成具有肯定的作用，牙本质基质诱导牙本质形成的能力很可能与含有TGF-β分子有关。
, 百拇医药
TGF-β是通过细胞膜表面的受体起作用的，I型和Ⅱ型受体属于跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶，Mr分别为53 000和75 000，二者都有一个短的富含半胱氨酸的细胞外片段和较长的细胞内片段。细胞内片段主要由丝氨酸/苏氨酸激酶区组成。尽管二者结构相似，但其氨基酸序列有较大的不同，在激酶区的同源性不足40%，其它区域同源性更低。I型和Ⅱ型受体与配体连接的特性也完全不同，Ⅱ型受体可以直接同配体连接，而I型受体只能识别与Ⅱ型受体结合的配体，通常不能识别游离的配体。TGF-β与 I型、Ⅱ型受体结合后形成异聚体复合物。Ⅱ型受体具有激酶活性，一旦与配体联接，便可以使I型受体磷酸化。I型受体本身不能磷酸化，它是Ⅱ型受体的作用底物，其功能是作用于TGF-β信号转导的下游分子。I型受体的转运与表达依赖于Ⅱ型受体，Ⅱ型受体只有在I型受体存在的时候与配体结合才容易，单独存在时与配体结合能力很弱。因此，细胞对TGF-β刺激的应答在很大程度上依赖于I、Ⅱ型受体间的相互作用，二者对TGF-β的信号转导是必不可少的〔4,5〕。
免疫组化结果表明在健康及龋坏人恒牙中，成牙本质细胞层TGF-βI 型和Ⅱ型受体均呈强阳性表达，提示TGF-β信号主要作用于成牙本质细胞。I型和Ⅱ型受体在健康及浅龋人恒牙中的表达没有差异，可能由于成牙本质细胞属于终末分化的成熟细胞，其受体表达水平不受龋坏影响，这与Sloan〔6〕的报道结果一致。Smith等〔7〕认为牙本质中存在多种生长因子，在龋坏引起的牙齿硬组织脱矿过程中，细菌产生的酸溶解生长因子，使这些分子按照一定比率从牙本质中释放出来，刺激成牙本质细胞合成和分泌牙本质基质成份，形成反应性牙本质。牙髓组织中的其它细胞TGF-β I型和Ⅱ型受体也有阳性或弱阳性表达，表明这些牙髓细胞对TGF-β的反应性较弱，但有可能在维持牙本质牙髓复合体在牙髓损伤修复过程中的整体反应中起关键作用〔8〕，当牙齿硬组织破坏、牙髓暴露时，成牙本质细胞层大多遭到破坏，牙髓细胞可以在适当的盖髓剂作用下分化为成牙本质细胞样的细胞，形成修复性牙本质，牙髓细胞I型和Ⅱ型受体的表达也可能与修复性牙本质形成有关。
, http://www.100md.com
近年来的研究表明，I型受体又包括结构相近的6个亚型，被称作activin receptor-like kinases(ALK1～6)，其中ALK-5为I型TGF-β受体。在牙髓细胞分化为前成牙本质细胞的体外研究中发现，随着前成牙本质细胞的分化成熟，转化生长因子-β超家族成员和它们的受体具有临时协同表达能力，其中包括TGF-β 1、BMP-4、BMP-7、ALK-2、ALK-3和ALK-5〔9〕。利用反转录PCR技术检测胚胎性牙髓(大鼠切牙)和成熟性牙髓(成年牛牙髓)中TGF-β I型和Ⅱ型受体的表达情况，结果二者均有表达，提示TGF-β I型和Ⅱ型受体在牙齿发育和牙髓损伤修复过程中可能发挥作用〔10〕。
牙髓损伤修复的机理到目前为止还未阐明，临床上还未找到一种理想的盖髓剂，探讨TGF-β及其受体在反应性和修复性牙本质形成中的作用机理对牙齿疾病的治疗提供了一种新的可能方法。
参考文献
, 百拇医药
1 Tziafas D,Papadimitriou S.Role of exogenous TGF-β 1 in induction of reparative dentinogenesis in vivo.Eur J Oral Sci, 1998,106(suppl 1) :192
2 贾东.转化生长因子β1对牙髓修复影响的实验研究:〔学位论文〕.西安：第四军医大学口腔医学院,1998:6
3 Cassidy N,Fahey M,Prime SS,et al.Comparative analysis of transfoming growth factor -β isoforms 1-3 in human and rabbit dentine matrices.Arch Oral Biol, 1997,42:219
4 Wrana JL,Attisano L,Wieser R,et al.Mechanism of activation of the TGF-β receptor.Nature,1994,370:341
, http://www.100md.com
5 Carcamo J,Zentella A,Massague J.Disruption of transforming growth factor β signaling by a mutation that prevents transphosphorylation within the receptor complex.Mol cell Biol,1995,15:1573
6 Sloan AJ,Matthews JB, Smith AJ.TGF-β receptor expression in human odontoblast and pulpal cells.J Dent Res,1998,77:1034
7 Smith AJ,Cassidy N,Perry H, et al.Reactionary dentinogenesis.Int J Dev Biol,1995,39(2):273
, http://www.100md.com
8 Smith AJ,Matthews JB,Hall RC.Transforming growth factor-β 1 (TGF-β 1) in dentine matrix.Ligand activation and receptor expression.Eur J Oral Sci, 1998,106(suppl 1):179
9 Toyono T,Nakasshima M,Kuhara S,et al.Temporal changes in expression of transforming growth factor-β superfamily members and their receptors during bovine preodontoblast differentiation in vitro.Arch Oral Biol,1997,42:481
10 Toyono T,Nakashima M,Kuhara S,et al.Expression of TGF-β superfamily receptors in dental pulp.J Dent Res,1997,76:1555
(收稿：1998-11-25 修回：1999-02-08), http://www.100md.com
单位：西安第四军医大学口腔医学院 710032
关键词：转化生长因子-β受体；牙髓；免疫组织化学
实用口腔医学杂志990513 〔摘要〕 目的：探讨转化生长因子β受体在人牙髓中的表达和牙髓细胞对TGF-β作用的反应机理。方法：用免疫组化方法检测转化生长因子βⅠ型受体(TβR-I)和Ⅱ型受体(TβR-Ⅱ)在健康及龋坏人牙髓中的表达。结果：转化生长因子-βⅠ型受体和Ⅱ型受体在成牙本质细胞层强阳性表达，其中Ⅰ型受体较Ⅱ型受体表达量多，两种受体在成牙本质细胞层下方的富细胞区及中心部牙髓有表达或弱表达，龋坏牙髓与正常牙髓有相同的反应模式。结论：转化生长因子-βⅠ型和Ⅱ型受体在健康及龋坏人牙成牙本质细胞及牙髓其它细胞皆有表达，提示成牙本质细胞及牙髓其它细胞在牙髓损伤修复过程中具有重要作用。
The expression of TGF-β receptors in human pulp cells
, 百拇医药
Zhang Ying, Zhang Yu, Jin Yan.Stomatological College,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032
〔Abstraot〕Objective:To observe the expression of TGF-β receptor (TβR) in human pulpal cells.Method:TβR-I and TβR-Ⅱ in healthy and carious human dental pulp were examined with immunohistochemical technique.Results:Strong specific staining for both receptor I and Ⅱ was observed,and more recepter Ⅰ was found in the odontoblasts of healthy teeth. Less receptor I and Ⅱ expression was observed in the cell rich layer underlying the odontoblasts. Similar pattern of staining was observed in the pulp from carious teeth.Conclusion:TβR-I and -Ⅱ were expressed in odontoblasts as well as other pulp cells in both health and clisease mature human molar teeth Such findings may be important in the response of these cells after tissue injury.
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Key words Transforming growth factor beta receptors;Dental pulp; Immunohistochemistry
转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一族具有多种生物学功能的细胞因子，对许多器官和组织的生长和分化起着重要作用，能刺激或抑制多种细胞的增殖，在创伤愈合、胚胎发育、细胞外基质形成、骨的重建、免疫调节以及神经系统的发育等过程中发挥重要作用。TGF-β参与牙髓损伤修复过程逐渐得到人们的关注，国内外已有TGF-β直接盖髓成功的报道〔1、2〕。有关TGF-β参与损伤修复的机理研究较少。本实验的目的是探讨TGF-β受体在健康及龋坏人牙髓中的表达和TGF-β参与牙髓损伤修复的作用机理。
1 材料与方法
1.1 标本制备
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收集口腔颌面外科门诊患者因治疗需要拔除的健康第三磨牙10个，龋坏牙根据龋坏程度分为三度，I度为牙釉质龋，Ⅱ度为牙本质浅龋，Ⅲ度为牙本质深龋尚未露髓(包括牙颈部龋)各10个，患者年龄在20～40岁之间，牙齿拔除后立即穿通髓角。用40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h，制备2 mm厚牙齿磨片，继续固定24 h。甲酸甲酸钠脱钙液4 ℃下脱钙两周左右，常规脱水，石蜡包埋，制备5 μm厚连续切片。
1.2 主要试剂
TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体多克隆抗体(博士德公司)，SP试剂盒(美国Zymed公司)，DAB试剂盒(中山公司)
1.3 免疫组化染色
采用SP法，切片脱蜡至水，体积分数为0.3%过氧化氢液室温下孵育10 min以消除内源性过氧化物酶，1 g/L胰蛋白酶消化15 min，正常羊血清孵育30 min，滴加一抗(工作液)，4 ℃湿盒过夜，37 ℃复温1 h，滴加生物素化二抗(1∶100)37 ℃孵育30 min，酶结合物(1∶100) 37 ℃孵育30 min，DAB显微镜下控制显色。上述各步之后均用0.01 mol/L PBS振洗3次，每次5 min。阳性对照，乳腺癌组织。阴性对照用PBS代替一抗，常规脱水，二甲苯透明，封片。
, 百拇医药
2 结 果
TGF-β I型和Ⅱ型受体的染色阳性部位在细胞膜和细胞浆，深棕色为强阳性，棕色为阳性，浅黄色为弱阳性。健康人恒牙TGF-β I型受体在成牙本质细胞层呈强阳性表达(图1)，在成牙本质细胞层下方的富细胞区呈阳性 (图2)，牙髓中间部细胞为弱阳性 (图3)，TGF-β Ⅱ型受体与I型受体染色相同，表达较弱(图4)。牙釉质龋和牙本质浅龋TGF-β I型受体和Ⅱ型受体表达与健康人恒牙染色结果一致(图5)，牙本质深龋下方的成牙本质细胞大多破坏，周围残留的成牙本质细胞和牙髓细胞染色也与正常人牙相同。
图1 TGF-β I型受体在健康人牙髓成牙本质
细胞呈强阳性 40×
, 百拇医药
图2 TGF-β I型受体在健康人牙髓富细胞区呈阳性 40×
图3 TGF-β I型受体在健康人牙髓中间部细胞为弱阳性 40×
图4 TGF-βⅡ型受体在健康人牙髓成牙本质细胞呈强阳性，其下方的牙髓细胞呈弱阳性 40×
图5 TGF-βⅡ型受体在牙本质浅龋中的成牙本质细胞呈强阳性 40×
3 讨 论
转化生长因子-β超家族成员包括5种TGF-β(β 1～β 5)和其它类似物，在哺乳动物中主要包括TGF-β 1～β 3。TGF-βs在牙髓损伤修复过程中具有重要作用。Cassidy等〔3〕报道在人牙本质中的EDTA和胶原酶溶解液中含有TGF-β 1，提示牙本质基质中含有TGF-β 1，牙体损伤后(如龋坏、酸蚀、磨损等)可以释放出来作用于成牙本质细胞，参与反应性牙本质形成。Tziafas〔1〕用浸有TGF-β 1的微孔滤膜置于暴露的狗磨牙牙髓42 d后发现有一厚层管样牙本质基质形成并衬有一层高柱状的极化细胞；未用TGF-β抗体中和的脱矿或未脱矿牙本质盖髓可以诱异管状牙本质形成并衬有极化的成牙本质细胞样的细胞；而用TGF-β抗体中和的脱矿牙本质盖髓则完全丧失了诱导活性，未脱矿牙本质只能形成纤维样牙本质，说明TGF-β 1对修复性牙本质的形成具有肯定的作用，牙本质基质诱导牙本质形成的能力很可能与含有TGF-β分子有关。
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TGF-β是通过细胞膜表面的受体起作用的，I型和Ⅱ型受体属于跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶，Mr分别为53 000和75 000，二者都有一个短的富含半胱氨酸的细胞外片段和较长的细胞内片段。细胞内片段主要由丝氨酸/苏氨酸激酶区组成。尽管二者结构相似，但其氨基酸序列有较大的不同，在激酶区的同源性不足40%，其它区域同源性更低。I型和Ⅱ型受体与配体连接的特性也完全不同，Ⅱ型受体可以直接同配体连接，而I型受体只能识别与Ⅱ型受体结合的配体，通常不能识别游离的配体。TGF-β与 I型、Ⅱ型受体结合后形成异聚体复合物。Ⅱ型受体具有激酶活性，一旦与配体联接，便可以使I型受体磷酸化。I型受体本身不能磷酸化，它是Ⅱ型受体的作用底物，其功能是作用于TGF-β信号转导的下游分子。I型受体的转运与表达依赖于Ⅱ型受体，Ⅱ型受体只有在I型受体存在的时候与配体结合才容易，单独存在时与配体结合能力很弱。因此，细胞对TGF-β刺激的应答在很大程度上依赖于I、Ⅱ型受体间的相互作用，二者对TGF-β的信号转导是必不可少的〔4,5〕。
免疫组化结果表明在健康及龋坏人恒牙中，成牙本质细胞层TGF-βI 型和Ⅱ型受体均呈强阳性表达，提示TGF-β信号主要作用于成牙本质细胞。I型和Ⅱ型受体在健康及浅龋人恒牙中的表达没有差异，可能由于成牙本质细胞属于终末分化的成熟细胞，其受体表达水平不受龋坏影响，这与Sloan〔6〕的报道结果一致。Smith等〔7〕认为牙本质中存在多种生长因子，在龋坏引起的牙齿硬组织脱矿过程中，细菌产生的酸溶解生长因子，使这些分子按照一定比率从牙本质中释放出来，刺激成牙本质细胞合成和分泌牙本质基质成份，形成反应性牙本质。牙髓组织中的其它细胞TGF-β I型和Ⅱ型受体也有阳性或弱阳性表达，表明这些牙髓细胞对TGF-β的反应性较弱，但有可能在维持牙本质牙髓复合体在牙髓损伤修复过程中的整体反应中起关键作用〔8〕，当牙齿硬组织破坏、牙髓暴露时，成牙本质细胞层大多遭到破坏，牙髓细胞可以在适当的盖髓剂作用下分化为成牙本质细胞样的细胞，形成修复性牙本质，牙髓细胞I型和Ⅱ型受体的表达也可能与修复性牙本质形成有关。
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近年来的研究表明，I型受体又包括结构相近的6个亚型，被称作activin receptor-like kinases(ALK1～6)，其中ALK-5为I型TGF-β受体。在牙髓细胞分化为前成牙本质细胞的体外研究中发现，随着前成牙本质细胞的分化成熟，转化生长因子-β超家族成员和它们的受体具有临时协同表达能力，其中包括TGF-β 1、BMP-4、BMP-7、ALK-2、ALK-3和ALK-5〔9〕。利用反转录PCR技术检测胚胎性牙髓(大鼠切牙)和成熟性牙髓(成年牛牙髓)中TGF-β I型和Ⅱ型受体的表达情况，结果二者均有表达，提示TGF-β I型和Ⅱ型受体在牙齿发育和牙髓损伤修复过程中可能发挥作用〔10〕。
牙髓损伤修复的机理到目前为止还未阐明，临床上还未找到一种理想的盖髓剂，探讨TGF-β及其受体在反应性和修复性牙本质形成中的作用机理对牙齿疾病的治疗提供了一种新的可能方法。
参考文献
, 百拇医药
1 Tziafas D,Papadimitriou S.Role of exogenous TGF-β 1 in induction of reparative dentinogenesis in vivo.Eur J Oral Sci, 1998,106(suppl 1) :192
2 贾东.转化生长因子β1对牙髓修复影响的实验研究:〔学位论文〕.西安：第四军医大学口腔医学院,1998:6
3 Cassidy N,Fahey M,Prime SS,et al.Comparative analysis of transfoming growth factor -β isoforms 1-3 in human and rabbit dentine matrices.Arch Oral Biol, 1997,42:219
4 Wrana JL,Attisano L,Wieser R,et al.Mechanism of activation of the TGF-β receptor.Nature,1994,370:341
, http://www.100md.com
5 Carcamo J,Zentella A,Massague J.Disruption of transforming growth factor β signaling by a mutation that prevents transphosphorylation within the receptor complex.Mol cell Biol,1995,15:1573
6 Sloan AJ,Matthews JB, Smith AJ.TGF-β receptor expression in human odontoblast and pulpal cells.J Dent Res,1998,77:1034
7 Smith AJ,Cassidy N,Perry H, et al.Reactionary dentinogenesis.Int J Dev Biol,1995,39(2):273
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8 Smith AJ,Matthews JB,Hall RC.Transforming growth factor-β 1 (TGF-β 1) in dentine matrix.Ligand activation and receptor expression.Eur J Oral Sci, 1998,106(suppl 1):179
9 Toyono T,Nakasshima M,Kuhara S,et al.Temporal changes in expression of transforming growth factor-β superfamily members and their receptors during bovine preodontoblast differentiation in vitro.Arch Oral Biol,1997,42:481
10 Toyono T,Nakashima M,Kuhara S,et al.Expression of TGF-β superfamily receptors in dental pulp.J Dent Res,1997,76:1555
(收稿：1998-11-25 修回：1999-02-08), http://www.100md.com