磁导向甲氨蝶呤缓释药物的形貌特征及缓释特性
作者：张皖清 孙玉鹏 毛天球 何远辉 徐来斌
单位：张皖清(第四军医大学口腔医学院，710032；现在304医院工作)；孙玉鹏(北京304医院)；毛天球(第四军医大学口腔医学院，710032)；徐来斌(西安近代化学研究所)；何远辉(西南应用磁学研究所)
关键词：甲氨蝶呤；磁微球；缓释制剂
实用口腔医学杂志000122 摘 要：目的：探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)的形貌特征及缓释特性。方法：采用分光光谱法、扫描电镜、透射电镜、X射线能谱分析等手段检测磁导向甲氨蝶呤缓释药物的含量及组成，并对FM-MTX的形貌特征及缓释特性进行检测。结果：化学交联法制备出磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物，其药物含量稳定。颗粒直径约(0.8±0.14) μm。在梯度磁场下比磁矩σs为0.9A.m2/kg。在0.9%氯化钠及RPMI1640培养液6 h仅有30.5%药物释放到介质中，24 h释药量约60%，48 h接近78%。结论：以化学交联法制得的磁导向甲氨蝶呤缓释药物FM-MTX含量稳定，在体外具有缓释作用。
, http://www.100md.com
分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0068-03
The morphology and slow-release characters of ferromagnetic methotrexate albumin microspheres
Zhang Wanqing Sun Yupeng Mao Tianqiu et al.
(Stomatological Hospital,Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Abstract：Objective：To study the morphology and slow release characters of magnetic targeted ferromagnetic albumin methotrexate conjugates (FM-MTX) as an antitumor drug.Methods:The morphology and slow release characters of FM-MTX were studied with ultraviolet spectrophotometry,transmission electron microscope,scanning electron microscopy and energy dispersive analysis of X ray.Results:Particle diameter of FM-MTX was (0.8±0.14) μm.The magnetic strength of FM-MTX σs was 0.9 A.m2/kg. About 30.5% of MTX were released into mediums by 6 h,about 60% by 24 h,approximately 78% by 48 h.Conclusion:The pharmaceutical parameters of FM-MTX are stable with slow release characters within 48 h in vitro.
, 百拇医药
Key words：Magnetic microspheres;Methotrexate; Sustained release preparation▲
磁性抗癌药缓释剂是将药物和适当的磁性材料(Fe3O4)配制的稳定的药物体系〔1〕。在足够强的外磁场定位控制下，选择性地注入血管，到达并定位于靶区，在靶区药物以受控的方式从载体中释放，在靶细胞的细胞或亚细胞水平上发挥药效作用，而对正常组织细胞无太大影响〔2〕〔3〕。
我们制备了磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物〔4〕。对其各组成成分、理化性能等进行检测〔6〕，本研究探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)的形貌特征及缓释特性，为该药物建立质量控制标准进入临床一期研究提供药学参数。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 仪器与试剂
紫外分光光度计(日本 岛津UV-2201型)。扫描电镜(英国Oxford)，透射电镜(JEM-2000EX)，磁强计(美国 振动样品155型)。试剂；甲醇、HCl、Na2CO3均为分析纯。RPMI1640培养液(GIBCO)。FM-MTX来源及制备方法见参考文献〔4〕。
1.2 形貌特征及磁化率测定
分别取FM磁液、FM-MTX药液数批，稀释20倍后在样品仪上进行样品制备，抽真空后表面喷金处理(喷金厚度为20 nm)。在Oxford扫描电子显微镜下观测其形貌特征，检测粒子形态，并通过X射线能谱分析仪检测各种元素含量。
采用振动样品磁强计测量，样品装在特制的样品管中，用非磁性粘结剂封严，测得M值后，根据σs=M/H及磁导率μ=1+4πσs，求出磁导率。
, 百拇医药
1.3 体外释药性能检测
分别以9 g/L Nacl水溶液及RPMI-1640培养液为释放介质，对磁性甲氨蝶呤白蛋白微球的体外释药进行检测。分别取一定量的药物置于溶出杯内，加溶出介质900 ml，搅拌，于一定时间点吸取5 ml，检测释药量。介质温度为(37±0.5) ℃，搅拌速度为100 r/min。释放液中药物检测方法：以753型紫外分光光度计在波长为306 nm处测定释放液的吸收值。按标准曲线法计算微球的累积释药量。
2 结 果
2.1 形貌特征
药物的微观形貌和结构对药物的质量控制具有非常重要的意义。精确测量和严格控制形貌是保证和改进药物的必要条件。电子显微镜能在材料的宏观性质和微观结构之间架起桥梁，把新材料的研制、加工工艺的评价和药物作用机理等研究向前推进了一步。
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在扫描电镜下，FM-MTX呈现小圆球状颗粒，粒径在0.8 μm占三分之一多(图1-②)。采用9 g/L NaCl稀释后，呈现花瓣样结构(图1-①③④)，粒径略有增加。
图1 FM-MTX形貌特征
图2 FM-MTX透射电镜观察
将FM-MTX药物稀释后直接滴网，在透射电镜下观察到药物呈颗粒状结构，电子密度很高(图2-①②)。
通过X射线能量色散谱EDS分析，检测出9 g/L Nacl稀释的FM-MTX药物的元素组成主要为：Fe、Na、Cl、O和C元素(图3)
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图3 FM-MTX能谱
表1 FM-MTX药物EDS能谱分析元素含量分布 Elmt
Spect.Type
Element(%)
Atomic(%)
C K
ED
4.05
9.73
O K
ED
16.35
, 百拇医药
29.50
Na K
ED
19.48
24.45
Al K
ED
0.08
0.09
S K
ED
0.15
0.14
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C l K
ED
17.48
14.23
Ca K
ED
-0.05
-0.04
Fe K
ED
42.34
21.88
Sm L
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ED
0.11
0.02
Total
100
100
采用155型振动样品磁强计测量FM-MTX的磁化强度，测得MS为0.20×10-3A.m2，比磁矩σs为0.9 A.m2/kg，其磁导率为2.2 mT。
2.2 体外释药特性
在306 nm处测得MTX释放液的吸收值。在最初的2 h内有突释效应，之后呈相对平缓的释药过程。FM-MTX在9 g/L Nacl及RPMI-1640培养液中均有缓释作用，6 h仅有30.5%药物释放到介质中，24 h释药量约60%，48 h接近78%。9 g/L Nacl液中释放率略快于RPMI-1640液(图4)。
, 百拇医药
图4 MTX释放液曲线
3 讨 论
抗癌药物磁性微球载体是七十年代开始研究的一种新剂型。它是将药物与具有磁响应物质结合构成的完整的药理体系〔3〕。药物进入体内，同时在肿瘤外部施加一定场强的外磁场，使磁性药物载体固定于磁场区域内即肿瘤靶区内。由于它能提高肿瘤局部的药物浓度，并且能延长药物在肿瘤组织的作用时间，使药物最大限度杀伤肿瘤靶细胞〔5〕，从而减小正常组织细胞尤其是减小增殖旺盛的骨髓细胞的损伤。因此愈来愈引起国内外学者的关注，并取得了一系列研究进展。
我们选用抗瘤谱较广、生化药理机制最为清楚的抗癌药甲氨蝶呤，根据甲氨蝶呤分子结构的特点，采用碳二亚胺法、活化酯法及SPDP异型双功能试剂法将甲氨蝶呤(MTX)与中间载体人血清白蛋白交联，活化MTX非药理活性基团后，与含有超微磁粒的生物磁液结合，制备出胶态偶联物甲氨蝶呤磁性白蛋白微球载体系统(FM-MTX)〔4〕。并对磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物的组成成分、理化性能等进行检测，HPLC法检测FM-MTX中MTX药物含量为260 mg/L。Fe3O4平均含量为66.29 mg/L。FM-MTX粒度分布均匀，粒径为0.4～1.0 μm，占88.61%。FM-MTX药物含量稳定，放置6个月，含量未见明显变化〔6〕。
, 百拇医药
FM-MTX的形态可通过电子显微镜进行直观研究，常用的有扫描电镜、负染色法及冰冻蚀刻等。本研究采用扫描电镜观察时发现，其分辩力尚不能达到满意要求；采用透射电镜负染法，应用铀、铅双染色，显示Fe颗粒非常清楚，但无法判断药物结构。本研究我们采用空间分辩力X射线能量色散谱(EDS)进行组成成份分析。根据不同元素电子跃迁前后的能级不同而得出特征性X射线波长，对FM-MTX的组成成份进行点面分析，得到按能量展开的特征性X射线能量分析图，应用相应的软件处理这些能谱图，就可以进行谱峰的定性和定量分析。能谱法灵敏度高，最小检测量为10-9～10-20 g。我们应用其进行定性定量分析FM-MTX药物，结果显示，FM-MTX的主成份以Fe，Na，C1，O，C，S为主，这与克分子比值计算相一致。我们在X射线能谱仪的图像分析基础上，应用激光粒度分析仪对样品粒度百分比进行检测，给出粒径分布直方图，小于1 μm者占80%以上，达到满意的药用要求。
基金项目：国家自然科学基金资助项目 39070871
, 百拇医药
国家新药基金资助项目 93-(62)-N-42
参考文献：
[1]Gupta PK.Drug trageting in cancer chemotherapy.A Clinical Perspective.Joumal of Pharmaceutical Science,1990,79:949
[2]Gupta PK,Hung T.Comparative disposition of adriamycin delivered via magnetic albumin microspheres in presence and absence of magnetic fieldin rats.Life Science,1990,46:471
[3]Widder KJ,Senyei AE,Sears B,et al.Experimental methods in cancer therapeutics.J Pharm Sci,1982,71:379
[4]张皖清,毛天球,孙玉鹏,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的研制及含量测定.实用口腔医学杂志,2000,16(1):61
[5] 张皖清,马定祥,毛天球,等.磁微粒负载甲氨蝶呤对舌癌移植瘤的靶向治疗实验研究.实用口腔医学杂志,1990,6:147
[6]张皖清,孙玉鹏,毛天球,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的药学参数检测.实用口腔医学杂志,2000,16(1):65
收稿日期：1998-08-24
修改日期：1999-11-01, http://www.100md.com
单位：张皖清(第四军医大学口腔医学院，710032；现在304医院工作)；孙玉鹏(北京304医院)；毛天球(第四军医大学口腔医学院，710032)；徐来斌(西安近代化学研究所)；何远辉(西南应用磁学研究所)
关键词：甲氨蝶呤；磁微球；缓释制剂
实用口腔医学杂志000122 摘 要：目的：探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)的形貌特征及缓释特性。方法：采用分光光谱法、扫描电镜、透射电镜、X射线能谱分析等手段检测磁导向甲氨蝶呤缓释药物的含量及组成，并对FM-MTX的形貌特征及缓释特性进行检测。结果：化学交联法制备出磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物，其药物含量稳定。颗粒直径约(0.8±0.14) μm。在梯度磁场下比磁矩σs为0.9A.m2/kg。在0.9%氯化钠及RPMI1640培养液6 h仅有30.5%药物释放到介质中，24 h释药量约60%，48 h接近78%。结论：以化学交联法制得的磁导向甲氨蝶呤缓释药物FM-MTX含量稳定，在体外具有缓释作用。
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分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0068-03
The morphology and slow-release characters of ferromagnetic methotrexate albumin microspheres
Zhang Wanqing Sun Yupeng Mao Tianqiu et al.
(Stomatological Hospital,Fourth Military Medical University, Xi'an 710032)
Abstract：Objective：To study the morphology and slow release characters of magnetic targeted ferromagnetic albumin methotrexate conjugates (FM-MTX) as an antitumor drug.Methods:The morphology and slow release characters of FM-MTX were studied with ultraviolet spectrophotometry,transmission electron microscope,scanning electron microscopy and energy dispersive analysis of X ray.Results:Particle diameter of FM-MTX was (0.8±0.14) μm.The magnetic strength of FM-MTX σs was 0.9 A.m2/kg. About 30.5% of MTX were released into mediums by 6 h,about 60% by 24 h,approximately 78% by 48 h.Conclusion:The pharmaceutical parameters of FM-MTX are stable with slow release characters within 48 h in vitro.
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Key words：Magnetic microspheres;Methotrexate; Sustained release preparation▲
磁性抗癌药缓释剂是将药物和适当的磁性材料(Fe3O4)配制的稳定的药物体系〔1〕。在足够强的外磁场定位控制下，选择性地注入血管，到达并定位于靶区，在靶区药物以受控的方式从载体中释放，在靶细胞的细胞或亚细胞水平上发挥药效作用，而对正常组织细胞无太大影响〔2〕〔3〕。
我们制备了磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物〔4〕。对其各组成成分、理化性能等进行检测〔6〕，本研究探讨磁导向甲氨蝶呤缓释药物(FM-MTX)的形貌特征及缓释特性，为该药物建立质量控制标准进入临床一期研究提供药学参数。
1 材料与方法
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1.1 仪器与试剂
紫外分光光度计(日本 岛津UV-2201型)。扫描电镜(英国Oxford)，透射电镜(JEM-2000EX)，磁强计(美国 振动样品155型)。试剂；甲醇、HCl、Na2CO3均为分析纯。RPMI1640培养液(GIBCO)。FM-MTX来源及制备方法见参考文献〔4〕。
1.2 形貌特征及磁化率测定
分别取FM磁液、FM-MTX药液数批，稀释20倍后在样品仪上进行样品制备，抽真空后表面喷金处理(喷金厚度为20 nm)。在Oxford扫描电子显微镜下观测其形貌特征，检测粒子形态，并通过X射线能谱分析仪检测各种元素含量。
采用振动样品磁强计测量，样品装在特制的样品管中，用非磁性粘结剂封严，测得M值后，根据σs=M/H及磁导率μ=1+4πσs，求出磁导率。
, 百拇医药
1.3 体外释药性能检测
分别以9 g/L Nacl水溶液及RPMI-1640培养液为释放介质，对磁性甲氨蝶呤白蛋白微球的体外释药进行检测。分别取一定量的药物置于溶出杯内，加溶出介质900 ml，搅拌，于一定时间点吸取5 ml，检测释药量。介质温度为(37±0.5) ℃，搅拌速度为100 r/min。释放液中药物检测方法：以753型紫外分光光度计在波长为306 nm处测定释放液的吸收值。按标准曲线法计算微球的累积释药量。
2 结 果
2.1 形貌特征
药物的微观形貌和结构对药物的质量控制具有非常重要的意义。精确测量和严格控制形貌是保证和改进药物的必要条件。电子显微镜能在材料的宏观性质和微观结构之间架起桥梁，把新材料的研制、加工工艺的评价和药物作用机理等研究向前推进了一步。
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在扫描电镜下，FM-MTX呈现小圆球状颗粒，粒径在0.8 μm占三分之一多(图1-②)。采用9 g/L NaCl稀释后，呈现花瓣样结构(图1-①③④)，粒径略有增加。
图1 FM-MTX形貌特征
图2 FM-MTX透射电镜观察
将FM-MTX药物稀释后直接滴网，在透射电镜下观察到药物呈颗粒状结构，电子密度很高(图2-①②)。
通过X射线能量色散谱EDS分析，检测出9 g/L Nacl稀释的FM-MTX药物的元素组成主要为：Fe、Na、Cl、O和C元素(图3)
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图3 FM-MTX能谱
表1 FM-MTX药物EDS能谱分析元素含量分布 Elmt
Spect.Type
Element(%)
Atomic(%)
C K
ED
4.05
9.73
O K
ED
16.35
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29.50
Na K
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19.48
24.45
Al K
ED
0.08
0.09
S K
ED
0.15
0.14
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C l K
ED
17.48
14.23
Ca K
ED
-0.05
-0.04
Fe K
ED
42.34
21.88
Sm L
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ED
0.11
0.02
Total
100
100
采用155型振动样品磁强计测量FM-MTX的磁化强度，测得MS为0.20×10-3A.m2，比磁矩σs为0.9 A.m2/kg，其磁导率为2.2 mT。
2.2 体外释药特性
在306 nm处测得MTX释放液的吸收值。在最初的2 h内有突释效应，之后呈相对平缓的释药过程。FM-MTX在9 g/L Nacl及RPMI-1640培养液中均有缓释作用，6 h仅有30.5%药物释放到介质中，24 h释药量约60%，48 h接近78%。9 g/L Nacl液中释放率略快于RPMI-1640液(图4)。
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图4 MTX释放液曲线
3 讨 论
抗癌药物磁性微球载体是七十年代开始研究的一种新剂型。它是将药物与具有磁响应物质结合构成的完整的药理体系〔3〕。药物进入体内，同时在肿瘤外部施加一定场强的外磁场，使磁性药物载体固定于磁场区域内即肿瘤靶区内。由于它能提高肿瘤局部的药物浓度，并且能延长药物在肿瘤组织的作用时间，使药物最大限度杀伤肿瘤靶细胞〔5〕，从而减小正常组织细胞尤其是减小增殖旺盛的骨髓细胞的损伤。因此愈来愈引起国内外学者的关注，并取得了一系列研究进展。
我们选用抗瘤谱较广、生化药理机制最为清楚的抗癌药甲氨蝶呤，根据甲氨蝶呤分子结构的特点，采用碳二亚胺法、活化酯法及SPDP异型双功能试剂法将甲氨蝶呤(MTX)与中间载体人血清白蛋白交联，活化MTX非药理活性基团后，与含有超微磁粒的生物磁液结合，制备出胶态偶联物甲氨蝶呤磁性白蛋白微球载体系统(FM-MTX)〔4〕。并对磁导向甲氨蝶呤白蛋白缓释药物的组成成分、理化性能等进行检测，HPLC法检测FM-MTX中MTX药物含量为260 mg/L。Fe3O4平均含量为66.29 mg/L。FM-MTX粒度分布均匀，粒径为0.4～1.0 μm，占88.61%。FM-MTX药物含量稳定，放置6个月，含量未见明显变化〔6〕。
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FM-MTX的形态可通过电子显微镜进行直观研究，常用的有扫描电镜、负染色法及冰冻蚀刻等。本研究采用扫描电镜观察时发现，其分辩力尚不能达到满意要求；采用透射电镜负染法，应用铀、铅双染色，显示Fe颗粒非常清楚，但无法判断药物结构。本研究我们采用空间分辩力X射线能量色散谱(EDS)进行组成成份分析。根据不同元素电子跃迁前后的能级不同而得出特征性X射线波长，对FM-MTX的组成成份进行点面分析，得到按能量展开的特征性X射线能量分析图，应用相应的软件处理这些能谱图，就可以进行谱峰的定性和定量分析。能谱法灵敏度高，最小检测量为10-9～10-20 g。我们应用其进行定性定量分析FM-MTX药物，结果显示，FM-MTX的主成份以Fe，Na，C1，O，C，S为主，这与克分子比值计算相一致。我们在X射线能谱仪的图像分析基础上，应用激光粒度分析仪对样品粒度百分比进行检测，给出粒径分布直方图，小于1 μm者占80%以上，达到满意的药用要求。
基金项目：国家自然科学基金资助项目 39070871
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国家新药基金资助项目 93-(62)-N-42
参考文献：
[1]Gupta PK.Drug trageting in cancer chemotherapy.A Clinical Perspective.Joumal of Pharmaceutical Science,1990,79:949
[2]Gupta PK,Hung T.Comparative disposition of adriamycin delivered via magnetic albumin microspheres in presence and absence of magnetic fieldin rats.Life Science,1990,46:471
[3]Widder KJ,Senyei AE,Sears B,et al.Experimental methods in cancer therapeutics.J Pharm Sci,1982,71:379
[4]张皖清,毛天球,孙玉鹏,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的研制及含量测定.实用口腔医学杂志,2000,16(1):61
[5] 张皖清,马定祥,毛天球,等.磁微粒负载甲氨蝶呤对舌癌移植瘤的靶向治疗实验研究.实用口腔医学杂志,1990,6:147
[6]张皖清,孙玉鹏,毛天球,等.磁导向甲氨蝶呤缓释药物的药学参数检测.实用口腔医学杂志,2000,16(1):65
收稿日期：1998-08-24
修改日期：1999-11-01, http://www.100md.com