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编号:10274641
直流电对鳞状细胞癌Tca-83细胞系抑杀作用的体外研究
http://www.100md.com 《实用口腔医学杂志》 2000年第1期
     作者:农晓琳 蒙敏 李佳荃 周诺 林毅

    单位:农晓琳(广西医科大学口腔医院口腔凳面外科,530021);蒙敏(广西医科大学口腔医院口腔凳面外科,530021);李佳荃(广西医科大学一附院外科);周诺(广西医科大学口腔医院口腔凳面外科,530021);林毅(广西医科大学口腔医院口腔凳面外科,530021)

    关键词:直流电;舌;鳞状细胞癌;细胞系

    实用口腔医学杂志000115 摘 要:目的:探讨直流电对人舌鳞状细胞癌Tca-83细胞系的抑杀作用。方法:对体外培养的人舌鳞状细胞癌细胞系Tca-83采用不同 的电处理 参数进行了直流处理。观察处理后癌细胞的形态、结构、生长情况、生物学特性;检测电处 理后培养液的酸碱度、电解质的改变情况。结果:直流电处理对舌 鳞状细胞癌有明显的杀伤及抑制作用。在电压一定的情况下增加电量可提高抑杀效率。电处 理后的培养液pH,电解质,有机成分发生较大改变,其对癌细胞的生长有一定的抑制作用。 电处理后未被杀死的癌细胞增殖能力也明显减低。结论:直流电处 理可通过电解、电泳、电渗作用直接杀伤舌癌细胞,亦可通过改变细胞生长的外环境抑制舌 癌细胞修复、生长、增殖。
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    分类号:R73-36 R739.86 文献标识码:A

    文章编号:1001-3733(2000)01 -0046-03

    Cytocidal and inhibitory effects of direct current on human tongue squa mous cell carcinoma cell line Tca83

    Nong Xiaolin Meng Ming Li Jiaquan et al.

    (Hospital of Stomatology, Gu angxi Medical University, Nanning 530021)

    Abstract:Objective:To study the cytocidal and inhibito ry effects of direct currents on human tongue squamous cell carcinoma cell line( Tca-83). Methods:Tca-83 cells were treated with direct currents with different parameters. The effects of the treatment were evaluated by morphological observation, MTT assay and detection of pH and electrolyte in the treated culture medium.Results:Direct current could kill and inhibit the growth o f Tca-83 cells, after the electric treatment, modify of pH and electrolyte of c ulture medium could also kill and inhibit the recover and growth of the cells. Conclusion:Direct current treatment can kill the cells of tongue squamo us cell carcinoma directly by electrolysis, electrophoresis and eletroendosmosis , and inhibit the cell growth indirectly by environment alteration.
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    Key words:Direct current; Tongue; Squamous cell carcinoma ; Cell line▲

    我科于1995年始开展头颈恶性肿瘤的直流电治疗。在手术前辅助治疗及丧失手术时机的 患者的治疗方面进行了一些探索,取得了一定的治疗效果。但因患者的个体条件、肿瘤分型 、分期不同,给我们评价电化疗在抑杀舌鳞状细胞癌的作用上造成了困难。因而有必要在体 外条件下观察、评价直流电治疗对舌鳞状细胞癌的作用效果及处理后细胞形态及生物学行为 的改变,探索有效的治疗参数。

    1 材料与方法

    1.1 人舌鳞状细胞癌细胞系Tca-83(北京医科大学口腔医学院提供):以RPMI 1640培养基 常 规培养于25 ml培养方瓶中,取对数生长期细胞,用含1.25 g/L胰蛋白酶,2 g/LEDTA的消化 液消化并收集细胞,制成5.0×103/ml的细胞悬液。分别以每孔2 ml的量接种于24孔细胞 培养板。37 ℃,体积分数(CO2)=5%培养箱(NAPO 5410),培养72 h取出培养板进行实验。
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    将等量接种的孔板随机。分为空白对照组、实验组。实验组按电压(伏特V),电量(库仑 C)及处理后是否更换培养液分为:5V/5C换液、5V/10C不换液、5V/5C不换液组。

    实验在超净台内进行。将盖板取下,换上预先钻好小孔并消毒好的盖板,通过小孔插入正、 负各一个铂金电极,两电极以1.0 cm间距插入达孔底。按设计分组,接通SDZLY-3电治疗仪 (广西柳州地区无线电总厂),通以平稳电流,逐孔电处理。空白对照组不行电处理。电处理 完毕,观察各组处理后情况并将空白组及电后需换液组孔内培养基小心吸出,加入2 ml新鲜 培养基。不换液组仍保留电处理后的培养液。各板置37 ℃,体积分数(CO2)=5%培养箱继 续培养。每隔24 h各组取2孔进行检测。

    1.2 检测方法

    1.2.1 细胞形态改变 (1)各组分别于处理后0~6 d,分别在倒置生物显微镜下观察细胞生 长情况。(2)取生长于玻片上的细胞在5V/10C电处理后继续培养2 d,常规制作扫描电镜标本 ,JSM-T33扫描电镜观察。
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    1.2.2 生长曲线的测定 每组于处理后1~6 d,分别取2孔,经消化后,加入250 μl 培养基制成细胞悬液。血球计数板计算活细胞数。

    1.2.3 取100 μl上述细胞悬液加至96孔培养板,每孔加入5 g/L噻唑蓝(MTT,SIGMA)20 μ l,37 ℃培养4 h后,吸去上清液,每孔加入二甲基亚砜100 μl,充分混匀后在(Bio-tek EL3IIS)全自动酶标仪上测570 nm吸光度值。据公式算出各处理组每天杀伤率。

    杀伤率=(对照组吸光度值—实验组吸光度值)/对照组吸光度值。

    1.2.4 培养液电解质、pH值测定 分别采集空白组,5V/5C、5V/10C组阴、阳极区;5V/10C 阴、阳极混合液,深圳IMS-952型电解质分析仪测定pH值及K、Na、Cl、Ca离子含量。

    2 结 果
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    2.1 电处理时培养液变化

    电处理时培养板各孔中阳极产生大量泡沫,阴极泡沫较少;阳极区培养液呈黄色,p H3左右,阴极区培养液呈紫红色,pH12左右。两极间酸碱度差别有一明显分界区。电处理过程中该界限逐渐清晰,终止处理后两极间液体渐相互渗透、弥散。

    2.2 倒置显微镜下观察

    空白组癌细胞呈多角形,均匀分布于孔底,细胞边界清 晰。各处理组低倍镜下见:阳极区细胞碎裂、固缩,细胞形态、结构消失,细胞碎片多。阴 极区细胞水肿,呈类圆形。低倍镜下细胞边界尚清楚,高倍镜下见广泛细胞膜连续性中断。 处理后即可观察到此表现,24 h后该现象明显。此后阳极区仍无活细胞,阴极区及阴、阳极 交界 区细胞可少量存活,自行修复并恢复分裂能力。镜下见癌细胞的破坏、形态改变、存活及修 复能力与各组的处理条件有关。5V/10C不换液组与5V/5C不换液组比,癌细胞破坏程度大, 形态改变明显,修复能力差。5V/5C不换液组与换液组比,各天生长情况均较后者差。
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    2.3 扫描电镜观察结果

    电处理后细胞扁平、塌陷,细胞突起及绒毛短缩、消失 。阳极区细胞固缩、破碎。可凝固呈片、块状(见图1),亦可破碎、溶解呈点、网状。阴、 阳 极交界区,细胞突起及绒毛短缩,呈固缩倾向,细胞破坏较两极区相对小(见图2)。阴极区 细胞变圆、变大,表面突起、绒毛变短、消失(见图3)。

    图1 阳极区细胞固缩、破碎凝固呈片、块状

    图2 阴、阳极交界区,细胞破坏较两极区小,突起及绒毛短缩,呈固缩倾向

    图3 阴极区细胞变圆、变大,表面突起、绒毛变短、消失
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    2.4 生长曲线

    各电处理组均可较大程度地抑杀Tca-83细胞。5V/5C电后不换液 组抑杀作用大于同条件的换液组;小于5V/10C不换液组。

    2.5 MTT法测定各组生长情况

    电处理后各天,各电处理细胞均被抑制。5V /5C不换液,5V/10C不换液组抑制效果明显,至第6天活细胞数仍很少。5V/5C换液组处理后 第5、6 天已开始有明显的细胞增殖。

    2.6 各电处理组细胞杀伤情况

    见表1。

    3 讨 论

    直流电运用于肿瘤临床治疗始于70~80年代。瑞典学者Nordenstrom〔1~3〕提出了组织内电传导的 “血管-间质闭合电路”(vascular-interstitial closed electric circuit)及“生物闭 合电路”(biologically closed electric circuits)学说,并在此基础上首 先将直流电治疗用于肺转移瘤的治疗,并获得了成功。直流电治疗恶性肿瘤的 理论基础为:利用外加直流电场对肿瘤组织原有电活动施加影响,发生电解、电泳、电渗, 以改变肿瘤细胞生存、增殖、扩散的电场分布条件,并产生一系列促使肿瘤组织消亡的电生 理、电化学反应,强制性造成肿瘤组织内外环境剧烈变化,使瘤组织代谢紊乱,导致瘤细胞 死亡。
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    表1 各电处理组杀伤率 (%) 处理后天数

    5V/10C不换液

    5V/5C不换液

    5V/5C换液

    1

    77.3

    68.8

    26.6

    2

    92.2

    85.7

    52.8

, 百拇医药     3

    92.7

    89.0

    63.1

    4

    93.9

    90.7

    71.0

    5

    94.1

    90.0

    48.4

    6

, http://www.100md.com     89.3

    86.0

    55.1

    用直流电将肿瘤中心对放疗不敏感的乏氧细胞杀灭,再用放疗处理肿瘤周围敏感的细胞 ,既 可减少放疗剂量,减轻副作用,又可提高对肿瘤的治疗效果。另因肿瘤灶周围的炎症反应可 增加肿瘤的血供及提高局部的氧含量,可使放疗更敏感〔4〕

    本实验为体外实验。离体检测直流电作用对舌鳞癌Tca-83细胞系的抑杀作用,可观察结果 直观、方便。除血液循环,白细胞、吞噬细胞趋化,机体免疫调节等因素外,大体上摸拟了 体内作用后癌细胞的改变情况。

    实验组与未处理对照组比较存活细胞数少,倍增时间长。提示:直流电处理对人舌鳞癌细胞 系Tca-83有杀伤及抑制生长的作用。本实验设5V/5C电处理后不换液组、5V/10C电后不换液 组、5V/5C电处理后换液组及空白对照组。旨在比较电压不变,电量增大与相应的杀伤率的 关系;了解培养液经电处理后对细胞生长、增殖的影响,以摸拟在体瘤组织电处理后组织间 质的变化对残存瘤细胞的影响。实验结果表明:电压一定时,加大电量的杀伤效果比低电量 的杀伤效果好,杀伤率随电量增大而升高。该结果与以往的一些体内、外实验结果相符 〔5〕
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    在体组织经电处理后产生一系列的电解、电渗、电泳等物理及组织化学的作用,引起局部 pH改变、电解质平衡紊乱,蛋白质变性、沉淀〔6〕。其中阳极区形成圆形干燥的 坏 疽样黑变区,阴极区的黑变区不如阳极明显,呈水肿状,血管栓塞,循环障碍。5V/5C电处 理后换液组模拟的是:单纯电处理对舌癌细胞的抑杀情况;相同条件不换液组模拟的是:电 处理因素协同处理后培养液酸碱度、培养液成分改变等因素对舌鳞癌细胞的抑杀情况。不换 液组生长情况明显比换液组差。作者认为:体内治疗时瘤体的血供、体液循环受破坏的情况 不一,导致对电处理后所致的局部酸碱、电解质、营养成分代谢紊乱的代偿能力不一。单纯 以电处理后换液或不换液的生长情况来说明体内处理的效果都是片面的。将两者结果结合, 考虑电处理的即时效应及后续效应,综合评价方能较客观反映体内作用后的情况。

    本组电处理后,培养液的电解质及酸碱度检测结果与以往学者实验结果基本相符。正极区阳 离子聚集多,负极区氯离子聚集多,两极间pH值及离子分布变化在电压一定的情况下与电量 大小有关。阴、阳两极区的离子浓度变化除电离作用外,尚可能与细胞破坏的程度不一、释 放的离子多少不同有关。
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    我们在临床应用直流电治疗舌鳞癌取得一定疗效,也在实验室建立了用该法有效杀伤舌鳞 癌的体外模型,并对其治疗机制作了进一步推导。表明:直流电治疗对舌鳞癌有一定的抑杀 作用,不失为治疗晚期或其他原因丧失手术时机的舌鳞癌等头颈部恶性肿瘤患者的较好方法 。为临床应用该疗法对颌面部恶性肿瘤患者进行术前辅助治疗、对丧失手术时机的晚期患者 进行治疗提供了依据。实验电处理后尚有少数癌细胞可修复并继续生长、增殖。提示:多次 电处理及综合治疗的必要。两次治疗的时间不宜间隔过长,在电压一定的情况下增加电量可 提高电处理的即时杀伤力,同时也因培养液的改变相应增大而增加培养液对Tca-83细胞生 长抑制的后续效应。因而,电压一定的情况下合理增加电量可得到较好的治疗效果。电处理 与各种疗法相结合的临床综合治疗还有待进一步研究。 参考文献

    [1]Nordenstrom BE.Fleischner lecture.Biokinetic impacts on structure and i maging of the lung:The concept of biologically closed electric circuits.AJR Am J Roentgenol,1985,145:447
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    [2]Nordenstrom BE. Impact of biologically closed electric circuits (BCEC) on stru cture and function.Integr Physiol Behav Sci,1992,27(4):285

    [3]Nordenstrom BE.Preliminary trial of electrophoretic ionization in the treatmen t of malignant tumors.IRCS Med Sci,1978,6:537

    [4]李开华,顾一农,辛育龄.电化学治疗恶性肿瘤机理的探讨.陕西医学杂志,1990,19(12):38

    [5]Davia SL,Absdom DR,Smith CR,et al.Effect of low level direct current on in vivo tumor growth in hamsters.Cancer Res,1985,45:5625

    [6]Samuelsson L,Jonsson L,Lamm IL. et al.Electrolysis with different electrod e materials and combined with irradiation for treatment of experimental rat tumo rs.Acta Radiol,1991,32(2):178

    收稿日期:1999-04-11

    修改日期:1999-08-20, 百拇医药