舌癌组织及细胞系中细胞周期蛋白D基因的转录与蛋白的合成
作者：周峻 杨连甲 董绍忠 李媛
单位：周峻(第四军医大学口腔医学院病理科，710032)；杨连甲(第四军医大学口腔医学院病理科，710032)；董绍忠(第四军医大学口腔医学院病理科，710032)；李媛(第四军医大学口腔医学院病理科，710032)
关键词：癌；细胞周期蛋白D；免疫组织化学；原位杂交；基因表达
实用口腔医学杂志000111 摘 要：目的： 研究舌部鳞状细胞癌的细胞系以及根据不同的分化程度和是否有淋巴结转移来分类的舌癌组织中细胞周期蛋白D(cyclin D)的基因转录和蛋白合成情况。方法：应用免疫组织化学ABC法检测cyclin D蛋白合成；原位杂交技术检测cyclin D 基因的转录。结果：①cyclin D单克隆抗体标记后，经免疫组织化学染色78.6%(33/42)显示cyclin D蛋白过度表达；②cyclin D探针随机引物标记，经原位杂交后显示，cyclin D mRNA的阳性表达率为66.7%(28/42)；③cyclin D的表达与是否有淋巴结的转移有相关性，12例有转移的舌癌组织中通过免疫组织化学染色和原位杂交染色后分别有10例(83.3%)和9例(75%)有cyclin D的表达，而在30例无淋巴结转移的舌癌组织中，分别仅有13例(43.3%)和11例(36.7%)出现cyclin D的表达。结论：cyclin D在舌癌中有高水平的表达，且临床分期越晚，恶性程度越高，其表达率也较高，提示cyclin D的过度表达与舌癌的特性密切相关；cyclin D标记指数与舌癌是否有淋巴结转移呈正相关。cyclin D阳性检出率有助于判断舌癌恶性程度及预测肿瘤的转移，在基因诊断方面确定肿瘤生物学特性的诊断标准。
, 百拇医药
分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0034-03
The expression of cyclin D gene in squamous cell carcinoma of tongue by immuno histochemical and in situ hybridization
Zhou Jun Yang Lianjia Dong Shao zhong et al.
( Department of Oral Pathology Stomatological College,The Fourth Military University,Xi'an 710032)
Abstract：Objective： To assess the changes possible role of express of cyclin D in 42 cases of squamous cell carcinoma of tongue. Methods: Immun ohistochemistry study using ABC kit. In situ hybridization investigate using DIG DNA labeling and detection kit. Results: In immunohistochemistry,the express rate of cyclin D was 78.6% for cyclin D protein; In situ hybridization,the positive rate of cyclin D was 66.7% for cyclin D mRNA.There was a close correlation between the intensities of cyclin D and lymph node metastasis of squamous cell carcinoma of tongue. Conclusion: The detection of cyclin D is considered valuable in evaluating the maligant degree and predictable metastasis of squamous cell carcinoma of tongue.Cyclin D played an important role in the occurrence and development of squamous carcinoma of tongue.
, 百拇医药
Key words：Squamous cell carcinoma;Cyclin D;Immunohistochemistry; In situ hybridization;Gene expression▲
无限增殖是恶性肿瘤细胞的基本特征，大量的研究结果证明，肿瘤细胞的细胞周期调控机制发生了改变， D型cyclins被认为是限制G1期进程最重要的调控因子。人们经过研究，相继发现它与许多人类的肿瘤有关，在B细胞淋巴瘤〔1〕、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈部鳞癌〔2〕、胃肠癌、食道癌〔3〕中都证明有cyclin D1基因的过度表达。口腔鳞状细胞癌约占口腔颌面部恶性肿瘤的80%，是口腔颌面部的主要肿瘤之一，并随着年龄的增长其发病率增高。本实验选用舌癌组织及细胞系进行cyclin D基因转录与蛋白合成的研究，观察舌癌与cyclin D的关系。
1 材料与方法
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1.1 标本
42例舌部鳞状细胞癌组织取自我院近5年手术切除标本，所有标本均经体积分数为10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片后苏木精-伊红(HE)染色，进行病理诊断及分类。高度分化舌癌21例，中度分化舌癌13例，低度分化舌癌8例，其中30例无淋巴结转移，12例伴有淋巴结转移。
1.2 细胞系
舌癌细胞系(Tca8113)由何荣根等建立，本院生物学教研室冻存提供。将冻存的Tca8113细胞于37 ℃水浴中快速复苏，接种于含体积分数为10%灭活胎牛血清，105IU/L青霉素的RPMI1640培养液中，置37 ℃，CO2孵箱内培养。
1.3 细胞爬片的制备
将经清洁液处理、消毒后的盖玻片置于6孔板中，加入104/ml浓度含Tca8113贴壁生长细胞的完全培养基悬液，37 ℃，CO2孵箱内培养48 h，弃液，用10 mmol/L pH7.4 PBS洗3次，在PBS配制的40 g/L多聚甲醛中固定30 min，逐级脱水后风干，-20 ℃保存备用。
, 百拇医药
1.4 抗体和探针
羊抗鼠cyclin D单克隆抗体由福州迈新公司提供。插入有cyclin D全长 cDNA的pBS-cyclin D质粒由美国Hunter T博士惠赠。
1.5 免疫组织化学染色检测蛋白合成
常规ABC免疫组化染色法，ABC试剂盒购自Vector公司。主要步骤如下：切片常规脱蜡；枸橼酸微波处理修复抗原；羊血清封闭；一抗(工作浓度1∶30)湿盒中4 ℃过夜；生物素化羊抗鼠IgG室温30 min；ABC复合物室温30 min；DAB显色，苏木精复染，透明，封片。用PBS代替第一抗体作为空白对照。用已知阳性的乳腺癌作为阳性对照。
1.6 组织/细胞原位杂交检测基因转录 碱裂解法小量提取pBS-cyclin D质粒，经Not I和 Hind III双酶切后获得约1.3 Kb的全长cyclin D cDNA。DIG标记与检测试剂盒购自德国宝灵曼公司，探针标记、预杂交及杂交后检测程序均按照该试剂盒说明进行。杂交时设不加探针和不加抗地高辛抗体的对照组，作为阴性对照。
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1.7 结果判定
根据阳性细胞的着色强度分为3个等级，弱阳性(+)即阳性细胞数小于15%，阳性(++)即阳性细胞数在15～65%之间，强阳性(+++)即阳性细胞数大于65%。
1.8 统计学处理方法
采用Spearman相关分析。
2 结 果
2.1 cyclin D免疫组织/细胞化学染色结果
当细胞核内有弥漫性分布或棕黄色颗粒着色时即认为是cyclin D蛋白阳性(图1)。cyclin D单克隆抗体标记后，经免疫组化染色，42例舌癌中有33例显示cyclin D阳性表达(78.6%)，其中“+”9例，占21.4%；“++”11例，占26.2%“+++”13例，占31.0%。对Tca8113细胞而言，90%的胞核中有较强的棕黄色颗粒，表明该细胞核内有较丰富的cyclin D蛋白。
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图1 舌癌组织中cyclinD 蛋白合成胞核着色(ABC法 ×132)
2.2 组织/细胞cyclin D原位杂交结果
当细胞核中出现紫蓝色颗粒时，即被认为阳性杂交信号，表明有cyclin D基因mRNA过表达(图2)。本实验中cyclin D探针经随机引物标记原位杂交后显示，42例舌癌标本中，有28例cyclin D表达阳性(66.7%)，其中“+”7例，占16.7%；“++”9例，占21.4%；“+++”12例，占28.6%。DNA呈紫蓝色团块，cyclin D在癌细胞中的表达具有异质性，鳞癌的cyclin D多位于癌巢的外层，从癌巢外层向巢内扩展，有时可见整个癌巢着色，阳性染色亦深浅不一。在体外培养的Tca8113细胞中，80%的胞核上分布有紫蓝色颗粒，表明该细胞中cyclin D基因转录增强。
, 百拇医药
图2 舌癌组织中CyclinD基因转录癌巢着色 (ISH ×33)
2.3 cyclin D基因表达和蛋白合成与肿瘤病理学分级
见表1
表1 舌癌中cyclin D蛋白合成和基因转录的表达与肿瘤分级的关系 分化程度
例数
cyclin D蛋白合成
cyclin D 基因转录
+
++
+++
阳性率(%)
, 百拇医药
+
++
+++
阳性率(%)
高度分化(Ⅰ)
21
7
4
5
76.2
6
2
5
62.0
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中度分化(Ⅱ)
13
1
6
3
77.0
1
5
3
69.2
低度分化(Ⅲ)
8
1
, 百拇医药 1
5
87.5a
0
2
4
75.0b
合 计
42
9
11
13
78.6
, http://www.100md.com
7
9
12
66.7
a与I比较P<0.05 ；b与I比较P<0.05
2.4 cyclin D基因表达和蛋白合成与淋巴结转移的关系
cyclin D标记指数与舌癌有无淋巴结转移呈正相关。见表2。
表2 舌癌中cyclin D蛋白合成和基因转录的表达与淋巴结转移的关系 转移情况
例数
cyclin D蛋白合成
, 百拇医药
cyclin D 基因转录
阳性数
阳性率(%)
阳性数
阳性率(%)
转 移
12
10
83.3
9
75.0
未转移
30
, http://www.100md.com
13
43.3
11
36.7
合 计
42
23
54.8
20
47.6
2.5 舌癌中cyclin D 基因转录和蛋白合成的关系
凡是有cyclin D基因转录的病例，亦有cyclin D蛋白合成，但有5例cyclin D 蛋白呈阳性表达，而cyclin D mRNA 表达为阴性。两者的吻合率为82.1%。
, 百拇医药
3 讨 论
癌变是多个癌基因与抑癌基因协同作用的结果，其过程和机制十分复杂，至今尚未弄清。因此，目前尚缺乏有效的治疗措施。随着分子生物学的发展，越来越多的研究发现，细胞周期调控异常将引起肿瘤的发生，且肿瘤的恶性程度主要是由肿瘤细胞的增殖活性决定的。许多研究已证实细胞周期蛋白在多种人类恶性肿瘤中的表达增加，如乳腺癌、头颈部鳞癌、食管癌、肺癌等。Dutta等〔4〕发现cyclins的阳性率与肿瘤的增殖有相关性，曾将cyclins作为肿瘤扩增的标记。
cyclins是在海洋无脊椎动物早期胚胎细胞分裂过程中发现的，D型cyclins在cyclins家族有不同寻常的一面，它们能被外源生长因子调节，被认为是限制G1期进程最重要的调控因子。在G1期，cyclin D可被促细胞分裂剂诱导其过度表达，从而缩短G1期间隔，减少细胞数量，降低细胞对促细胞分裂剂的依赖性〔5〕。由此可见，D型细胞周期蛋白的基本作用是将一些细胞外信号与细胞周期机制结合起来。一般认为肿瘤分化越低，增殖力越强，恶性程度越高。因此，本研究依此将舌癌组织分为高度分化、中度分化和低度分化三个组别，分别应用免疫组化和原位杂交检测了42例舌癌标本以及细胞系中cyclin D蛋白合成和基因转录情况，结果均显示：细胞分化差的舌癌组织较分化程度好的表现出更强的胞核染色，表明分化越差基因转录和蛋白合成水平越高，基因表达与肿瘤恶性程度正相关，提示cyclin D能够作为判定舌癌细胞恶性程度的一个重要参数；同时实验结果也显示cyclin D标记指数与舌癌有无淋巴结的转移呈正相关性，由此可以根据cyclin D的阳性检出率来预测舌癌是否有转移的可能。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]Delmer A,Ajchenbaum CF, Tang R,et al.Overexpression of cyclin D2 in chronic B-cell malignancies. Blood, 1995, 85(10): 2870
[2]Naggar AK,Steck K,Batsakis JG .Heterogeneity of the proliferative fraction and cyclin D1/CCND1 gene amplification in head and neck squamous cell carcinoma. Cytometry, 1995,21(1):47
[3]Naitoh H,Shibata J,Kawaguchi A,et al.Overexpression and localization of cyclin D1 mRNA and antigen in esophageal cancer. Am J Pathol,1995,146(5): 1161
[4]Dutta A,Chandra R,Leiter L,et al.Cyclins as marker of tumor proliferation: Immunocytochemical studies in breast cancer.Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92:5386
[5]Sherr CJ.D-type cyclins.Trends Biochem Sci,1995,20(5):187
收稿日期：1999-06-07
修改日期：1999-08-20, http://www.100md.com
单位：周峻(第四军医大学口腔医学院病理科，710032)；杨连甲(第四军医大学口腔医学院病理科，710032)；董绍忠(第四军医大学口腔医学院病理科，710032)；李媛(第四军医大学口腔医学院病理科，710032)
关键词：癌；细胞周期蛋白D；免疫组织化学；原位杂交；基因表达
实用口腔医学杂志000111 摘 要：目的： 研究舌部鳞状细胞癌的细胞系以及根据不同的分化程度和是否有淋巴结转移来分类的舌癌组织中细胞周期蛋白D(cyclin D)的基因转录和蛋白合成情况。方法：应用免疫组织化学ABC法检测cyclin D蛋白合成；原位杂交技术检测cyclin D 基因的转录。结果：①cyclin D单克隆抗体标记后，经免疫组织化学染色78.6%(33/42)显示cyclin D蛋白过度表达；②cyclin D探针随机引物标记，经原位杂交后显示，cyclin D mRNA的阳性表达率为66.7%(28/42)；③cyclin D的表达与是否有淋巴结的转移有相关性，12例有转移的舌癌组织中通过免疫组织化学染色和原位杂交染色后分别有10例(83.3%)和9例(75%)有cyclin D的表达，而在30例无淋巴结转移的舌癌组织中，分别仅有13例(43.3%)和11例(36.7%)出现cyclin D的表达。结论：cyclin D在舌癌中有高水平的表达，且临床分期越晚，恶性程度越高，其表达率也较高，提示cyclin D的过度表达与舌癌的特性密切相关；cyclin D标记指数与舌癌是否有淋巴结转移呈正相关。cyclin D阳性检出率有助于判断舌癌恶性程度及预测肿瘤的转移，在基因诊断方面确定肿瘤生物学特性的诊断标准。
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分类号：R739.8 文献标识码：A
文章编号：1001-3733(2000)01-0034-03
The expression of cyclin D gene in squamous cell carcinoma of tongue by immuno histochemical and in situ hybridization
Zhou Jun Yang Lianjia Dong Shao zhong et al.
( Department of Oral Pathology Stomatological College,The Fourth Military University,Xi'an 710032)
Abstract：Objective： To assess the changes possible role of express of cyclin D in 42 cases of squamous cell carcinoma of tongue. Methods: Immun ohistochemistry study using ABC kit. In situ hybridization investigate using DIG DNA labeling and detection kit. Results: In immunohistochemistry,the express rate of cyclin D was 78.6% for cyclin D protein; In situ hybridization,the positive rate of cyclin D was 66.7% for cyclin D mRNA.There was a close correlation between the intensities of cyclin D and lymph node metastasis of squamous cell carcinoma of tongue. Conclusion: The detection of cyclin D is considered valuable in evaluating the maligant degree and predictable metastasis of squamous cell carcinoma of tongue.Cyclin D played an important role in the occurrence and development of squamous carcinoma of tongue.
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Key words：Squamous cell carcinoma;Cyclin D;Immunohistochemistry; In situ hybridization;Gene expression▲
无限增殖是恶性肿瘤细胞的基本特征，大量的研究结果证明，肿瘤细胞的细胞周期调控机制发生了改变， D型cyclins被认为是限制G1期进程最重要的调控因子。人们经过研究，相继发现它与许多人类的肿瘤有关，在B细胞淋巴瘤〔1〕、乳腺癌、肝癌、肺癌、头颈部鳞癌〔2〕、胃肠癌、食道癌〔3〕中都证明有cyclin D1基因的过度表达。口腔鳞状细胞癌约占口腔颌面部恶性肿瘤的80%，是口腔颌面部的主要肿瘤之一，并随着年龄的增长其发病率增高。本实验选用舌癌组织及细胞系进行cyclin D基因转录与蛋白合成的研究，观察舌癌与cyclin D的关系。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 标本
42例舌部鳞状细胞癌组织取自我院近5年手术切除标本，所有标本均经体积分数为10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片后苏木精-伊红(HE)染色，进行病理诊断及分类。高度分化舌癌21例，中度分化舌癌13例，低度分化舌癌8例，其中30例无淋巴结转移，12例伴有淋巴结转移。
1.2 细胞系
舌癌细胞系(Tca8113)由何荣根等建立，本院生物学教研室冻存提供。将冻存的Tca8113细胞于37 ℃水浴中快速复苏，接种于含体积分数为10%灭活胎牛血清，105IU/L青霉素的RPMI1640培养液中，置37 ℃，CO2孵箱内培养。
1.3 细胞爬片的制备
将经清洁液处理、消毒后的盖玻片置于6孔板中，加入104/ml浓度含Tca8113贴壁生长细胞的完全培养基悬液，37 ℃，CO2孵箱内培养48 h，弃液，用10 mmol/L pH7.4 PBS洗3次，在PBS配制的40 g/L多聚甲醛中固定30 min，逐级脱水后风干，-20 ℃保存备用。
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1.4 抗体和探针
羊抗鼠cyclin D单克隆抗体由福州迈新公司提供。插入有cyclin D全长 cDNA的pBS-cyclin D质粒由美国Hunter T博士惠赠。
1.5 免疫组织化学染色检测蛋白合成
常规ABC免疫组化染色法，ABC试剂盒购自Vector公司。主要步骤如下：切片常规脱蜡；枸橼酸微波处理修复抗原；羊血清封闭；一抗(工作浓度1∶30)湿盒中4 ℃过夜；生物素化羊抗鼠IgG室温30 min；ABC复合物室温30 min；DAB显色，苏木精复染，透明，封片。用PBS代替第一抗体作为空白对照。用已知阳性的乳腺癌作为阳性对照。
1.6 组织/细胞原位杂交检测基因转录 碱裂解法小量提取pBS-cyclin D质粒，经Not I和 Hind III双酶切后获得约1.3 Kb的全长cyclin D cDNA。DIG标记与检测试剂盒购自德国宝灵曼公司，探针标记、预杂交及杂交后检测程序均按照该试剂盒说明进行。杂交时设不加探针和不加抗地高辛抗体的对照组，作为阴性对照。
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1.7 结果判定
根据阳性细胞的着色强度分为3个等级，弱阳性(+)即阳性细胞数小于15%，阳性(++)即阳性细胞数在15～65%之间，强阳性(+++)即阳性细胞数大于65%。
1.8 统计学处理方法
采用Spearman相关分析。
2 结 果
2.1 cyclin D免疫组织/细胞化学染色结果
当细胞核内有弥漫性分布或棕黄色颗粒着色时即认为是cyclin D蛋白阳性(图1)。cyclin D单克隆抗体标记后，经免疫组化染色，42例舌癌中有33例显示cyclin D阳性表达(78.6%)，其中“+”9例，占21.4%；“++”11例，占26.2%“+++”13例，占31.0%。对Tca8113细胞而言，90%的胞核中有较强的棕黄色颗粒，表明该细胞核内有较丰富的cyclin D蛋白。
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图1 舌癌组织中cyclinD 蛋白合成胞核着色(ABC法 ×132)
2.2 组织/细胞cyclin D原位杂交结果
当细胞核中出现紫蓝色颗粒时，即被认为阳性杂交信号，表明有cyclin D基因mRNA过表达(图2)。本实验中cyclin D探针经随机引物标记原位杂交后显示，42例舌癌标本中，有28例cyclin D表达阳性(66.7%)，其中“+”7例，占16.7%；“++”9例，占21.4%；“+++”12例，占28.6%。DNA呈紫蓝色团块，cyclin D在癌细胞中的表达具有异质性，鳞癌的cyclin D多位于癌巢的外层，从癌巢外层向巢内扩展，有时可见整个癌巢着色，阳性染色亦深浅不一。在体外培养的Tca8113细胞中，80%的胞核上分布有紫蓝色颗粒，表明该细胞中cyclin D基因转录增强。
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图2 舌癌组织中CyclinD基因转录癌巢着色 (ISH ×33)
2.3 cyclin D基因表达和蛋白合成与肿瘤病理学分级
见表1
表1 舌癌中cyclin D蛋白合成和基因转录的表达与肿瘤分级的关系 分化程度
例数
cyclin D蛋白合成
cyclin D 基因转录
+
++
+++
阳性率(%)
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+
++
+++
阳性率(%)
高度分化(Ⅰ)
21
7
4
5
76.2
6
2
5
62.0
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中度分化(Ⅱ)
13
1
6
3
77.0
1
5
3
69.2
低度分化(Ⅲ)
8
1
, 百拇医药 1
5
87.5a
0
2
4
75.0b
合 计
42
9
11
13
78.6
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7
9
12
66.7
a与I比较P<0.05 ；b与I比较P<0.05
2.4 cyclin D基因表达和蛋白合成与淋巴结转移的关系
cyclin D标记指数与舌癌有无淋巴结转移呈正相关。见表2。
表2 舌癌中cyclin D蛋白合成和基因转录的表达与淋巴结转移的关系 转移情况
例数
cyclin D蛋白合成
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cyclin D 基因转录
阳性数
阳性率(%)
阳性数
阳性率(%)
转 移
12
10
83.3
9
75.0
未转移
30
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43.3
11
36.7
合 计
42
23
54.8
20
47.6
2.5 舌癌中cyclin D 基因转录和蛋白合成的关系
凡是有cyclin D基因转录的病例，亦有cyclin D蛋白合成，但有5例cyclin D 蛋白呈阳性表达，而cyclin D mRNA 表达为阴性。两者的吻合率为82.1%。
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3 讨 论
癌变是多个癌基因与抑癌基因协同作用的结果，其过程和机制十分复杂，至今尚未弄清。因此，目前尚缺乏有效的治疗措施。随着分子生物学的发展，越来越多的研究发现，细胞周期调控异常将引起肿瘤的发生，且肿瘤的恶性程度主要是由肿瘤细胞的增殖活性决定的。许多研究已证实细胞周期蛋白在多种人类恶性肿瘤中的表达增加，如乳腺癌、头颈部鳞癌、食管癌、肺癌等。Dutta等〔4〕发现cyclins的阳性率与肿瘤的增殖有相关性，曾将cyclins作为肿瘤扩增的标记。
cyclins是在海洋无脊椎动物早期胚胎细胞分裂过程中发现的，D型cyclins在cyclins家族有不同寻常的一面，它们能被外源生长因子调节，被认为是限制G1期进程最重要的调控因子。在G1期，cyclin D可被促细胞分裂剂诱导其过度表达，从而缩短G1期间隔，减少细胞数量，降低细胞对促细胞分裂剂的依赖性〔5〕。由此可见，D型细胞周期蛋白的基本作用是将一些细胞外信号与细胞周期机制结合起来。一般认为肿瘤分化越低，增殖力越强，恶性程度越高。因此，本研究依此将舌癌组织分为高度分化、中度分化和低度分化三个组别，分别应用免疫组化和原位杂交检测了42例舌癌标本以及细胞系中cyclin D蛋白合成和基因转录情况，结果均显示：细胞分化差的舌癌组织较分化程度好的表现出更强的胞核染色，表明分化越差基因转录和蛋白合成水平越高，基因表达与肿瘤恶性程度正相关，提示cyclin D能够作为判定舌癌细胞恶性程度的一个重要参数；同时实验结果也显示cyclin D标记指数与舌癌有无淋巴结的转移呈正相关性，由此可以根据cyclin D的阳性检出率来预测舌癌是否有转移的可能。
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参考文献：
[1]Delmer A,Ajchenbaum CF, Tang R,et al.Overexpression of cyclin D2 in chronic B-cell malignancies. Blood, 1995, 85(10): 2870
[2]Naggar AK,Steck K,Batsakis JG .Heterogeneity of the proliferative fraction and cyclin D1/CCND1 gene amplification in head and neck squamous cell carcinoma. Cytometry, 1995,21(1):47
[3]Naitoh H,Shibata J,Kawaguchi A,et al.Overexpression and localization of cyclin D1 mRNA and antigen in esophageal cancer. Am J Pathol,1995,146(5): 1161
[4]Dutta A,Chandra R,Leiter L,et al.Cyclins as marker of tumor proliferation: Immunocytochemical studies in breast cancer.Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92:5386
[5]Sherr CJ.D-type cyclins.Trends Biochem Sci,1995,20(5):187
收稿日期：1999-06-07
修改日期：1999-08-20, http://www.100md.com